Name: 鸡心脏侵袭试验试验癌细胞的侵袭和潜在的反侵入性化合物的活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学习利用鸡心脏器官培养技术评估肿瘤细胞侵袭能力及抗侵袭化合物活性的三维体外实验方法。该技术通过将肿瘤细胞聚集体与胚胎鸡心脏组织片段在半固体琼脂床上共培养，为癌症治疗研究提供可控的实验模型。

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我们感谢 Marleen De Meulemeester 在视频中演示了该检测技术。B. I. R. 是佛兰德研究基金会（Research Foundation – Flanders，FWO – Vlaanderen）的博士后研究员。L.M.M. 获得了比利时佛兰德癌症联盟（Flemish League against Cancer，Vlaamse Liga tegen Kanker）颁发的 Emmanuel van der Schueren 奖学金。

<img alt="鸡胚心脏和肿瘤细胞培养实验示意图；苏木精和伊红染色组织学图像。" src="/files/ftp_upload/52792/52792fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 不同检测步骤的示意图概览。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52792/52792fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 预培养心肌碎片（PHFs）的制备
<ol>
	<li>将受精的鸡卵在 37 °C 下孵育 9 天。应安排孵育时间，以便后续可在 4 天内完成 PHF 的制备（例如，在周四完成），并在规定时间与肿瘤细胞聚集体进行最终共培养（例如，在下周一进行）。</li>
	<li>用 70% (v/v) 乙醇水溶液对蛋壳进行消毒。所有后续操作均须在组织培养柜中进行，并使用无菌溶液和材料。用钝头镊子在胚胎极处打开蛋壳。</li>
	<li>用去核勺夹住颈部将胚胎取出（图 2）。将胚胎置于直径为 5 cm 的玻璃培养皿中，内含 5 mL 林格氏盐溶液。
	<ol>
		<li>用双手持尖头镊子撕开腹侧胸壁皮肤，以相同操作方式去除胸骨，并使用显微虹膜剪进行解剖，切断心脏的主要血管以分离心脏。所有后续操作均须在带有校准目镜网格的体视显微镜下进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显示胚胎的卵解剖图，研究方法，生物学分析演示。" src="/files/ftp_upload/52792/52792fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用去核勺将胚胎从卵中取出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52792/52792fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>将心脏转移至一个直径为5 cm、含有5 ml MEM-Rega 3培养基（含5%胎牛血清）的玻璃培养皿中。使用显微解剖虹膜剪切除心脏上部颅侧三分之一，以去除心房及相关血管。用一对尖头镊子将心包从心室上剥离。</li>
	<li>使用显微解剖虹膜剪对心室进行矢状面半切，并用尖头镊子轻轻振荡以去除血液。</li>
	<li>将心室转移至另一个直径为5 cm、含有5 ml新鲜MEM-Rega 3培养基（含5%胎牛血清）的玻璃培养皿中。使用显微解剖虹膜剪将心室切成直径约0.4 mm的小块。一颗心脏可获得约100个组织片段。 
	注意：一颗心脏可获得约100个组织片段</li>
	<li>轻轻旋转培养皿，使所有心室片段向皿中心聚集。用不锈钢针将异物从心室片段中分离，并推向培养皿边缘，从而将其清除。</li>
	<li>用玻璃巴斯德吸管将心脏片段转移至含有2至3 ml培养基（MEM-Rega 3加10% v/v胎牛血清）的50 ml锥形瓶中。 
	注意：确切的培养基体积取决于不同锥形瓶底部的凸起程度：瓶底中心仅需覆盖一层薄液膜即可。</li>
	<li>通过瓶塞向锥形瓶中通入含5% CO2的空气混合气体，并将锥形瓶置于37 °C、70转/分钟（rpm）的旋转摇床上孵育24小时。该悬浮培养步骤的目的是获得适合后续与肿瘤细胞团块共培养的球形心脏组织片段。</li>
	<li>将心脏片段及其培养基转移至培养皿中。用针去除异物、坏死（颜色发暗）的片段以及聚集在一起的心脏片段团块。</li>
	<li>将剩余的心脏片段转移至另一个含有6 ml培养基的50 ml锥形瓶中，孵育条件同步骤1.9，继续孵育60小时。 
	注意：在此孵育期间，片段将逐渐变为球形。它们由中央的成肌细胞核心和外围一层薄薄的成纤维样细胞构成。</li>
	<li>在体视显微镜下借助针挑选出具有均匀薄层成纤维样细胞（形成半透明包膜）、直径为0.4 mm的球形片段。每只鸡胚心脏可获得约20个合适的PHF（预制心脏球体）。将这些PHF（其中许多在37 °C下会节律性收缩）转移至另一含有新鲜培养基的培养皿中。这些PHF现已准备好用于与待测细胞进行共培养。</li>
</ol>
2. 球形测试细胞聚集体的制备与共培养
<ol>
	<li>制备半固体琼脂培养基：将100 mg琼脂溶于15 ml林格氏盐溶液中，煮沸三次。将悬浮液冷却至40 °C，加入7.5 ml林格氏盐溶液/蛋清（1:1）和7.5 ml胎牛血清。</li>
	<li>在50 ml锥形瓶中，用适当的培养基制备6 ml含1 × 105 个测试细胞/ml的细胞悬液。在计划进行共培养前3天进行此操作。将锥形瓶置于旋转摇床上，37 °C、70 rpm条件下培养3天。根据所用培养基类型，向瓶内通入含5%或10%（v/v）CO2的空气混合气体。</li>
	<li>在配有标定目镜网格的体视显微镜下观察细胞聚集体。用针挑选直径为0.2 mm的球形细胞聚集体。</li>
	<li>用巴斯德吸管将八个选定的PHF（直径 = 0.4 mm）连同少量培养基转移至含有半固体琼脂培养基的胚胎学培养皿中13。用针移动各个PHF，使其排列成圆形。用一小片滤纸吸除多余培养基（见图3）。</li>
</ol>
<img alt="用于染料分离的硅胶板薄层色谱装置，包含溶剂和镊子。" src="/files/ftp_upload/52792/52792fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 去除PHF周围过量液体。将八个PHF置于胚胎学培养皿中的半固体琼脂上，并用一小块三角形滤纸吸除多余液体。箭头指示八个独立的PHF。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52792/52792fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>用巴斯德吸管将十个选定的球形细胞聚集体（直径 = 0.2 mm）移入圆圈内。吸除多余培养基。用针头将每个聚集体逐一移向PHF，直至彼此接触。用一小片滤纸吸除多余培养基。</li>
	<li>用石蜡密封培养皿盖，根据测试细胞与PHF的黏附特性，在37 °C下孵育4–24小时。</li>
	<li>用预热（37 °C）的培养基浸没相对的配对结构，并用巴斯德吸管将每对独立的结构转移至含有1.5 ml培养基的5 ml锥形瓶中。</li>
	<li>将锥形瓶置于旋转摇床上，在37 °C、120 rpm条件下孵育。根据测试细胞所用培养基的类型，向瓶内通入含5%或10%（v/v）CO2的空气（参见图4）。
	<ol>
		<li>为避免培养基浓缩，使气体通过两个额外的5 ml锥形瓶（各装有2 ml林格氏盐溶液）进行加湿。每8天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于金属离子分析的电化学装置；包括多通道电极、管路、烧瓶。" src="/files/ftp_upload/52792/52792fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 置于旋转摇床顶部的小型锥形瓶。 装有 1.5 ml 培养基的锥形瓶用带有进气和出气针头的硅胶塞密封，在 37 °C 下以 120 rpm 的速度振荡。气体通过进气管（1）导入装有无菌林格盐溶液的大型锥形瓶（2），然后经（3 和 4）分配至含有培养基及各自对峙组合（5 和 6）的较小锥形瓶中。最后，废气被收集到装有无菌水封的大型烧瓶（7）中，并由此排入空气中（8）。图中显示了两个培养电池组，置于一个自制的平台板上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52792/52792fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 对峙培养物的组织学
<ol>
	<li>制备布因-霍兰德固定液。
	<ol>
		<li>将2.5 g中性醋酸铜溶解于100 ml单蒸水中，并缓慢加入4.0 g苦味酸。</li>
		<li>用滤纸过滤该溶液。加入10 ml福尔马林和1 ml乙酸。将9份该溶液与1份用单蒸水配制的饱和氯化汞溶液混合。 
		注意：该溶液含有多种有毒物质。福尔马林经吸入、皮肤接触或吞咽后具有毒性。乙酸在摄入后对口腔和肠道具有腐蚀性。苦味酸具有致敏性，且在快速加热或受到撞击时可能发生爆炸。氯化汞对黏膜具有强腐蚀性，并具有肾毒性。配制布因-霍兰德溶液时应穿戴防护服和手套，并在通风良好且远离火源的区域操作。另一种替代固定方法是使用磷酸盐缓冲液中含4%甲醛的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在培养数天或数周后，按如下步骤固定各培养物。首先，将培养物转移至林格氏盐溶液中数秒，以去除血清蛋白。随后，将其浸入直径为3 cm、含有3 ml布因-霍兰德固定液的培养皿中，固定约2小时。</li>
	<li>用3 ml去离子水将培养物清洗三次，然后将其在水中孵育2小时，以尽可能去除固定液。最后转移至3 ml含70%（v/v）乙醇的水溶液中。在该溶液中保存过夜（O/N），但也可延长至数天。</li>
	<li>依次将样品转移至含有100 ml 96%（v/v）乙醇、100%乙醇或100%异丙醇以及100%二甲苯的容器中，每步各2小时，进行脱水处理。
	<ol>
		<li>将每个培养物转移至单独的玻璃盖玻片上（保留极少量二甲苯），将盖玻片置于葡萄酒瓶塞胶囊底部用于石蜡包埋，并在56 °C下用液态石蜡覆盖固定组织。在56 °C孵育24小时后，将包埋材料冷却至室温。 
		注意：二甲苯为苯的衍生物，经吸入可能具有毒性，仅可在通风良好的区域操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除葡萄酒瓶塞胶囊和盖玻片，切出含有固定培养物的石蜡块。</li>
	<li>使用切片机14对整个对置培养对进行8 µm厚的石蜡切片，并将所有切片依次收集在三张预先用组织粘附剂溶液处理过的载玻片上，以实现交替贴片。避免使用蛋清作为粘附剂，因其可能干扰免疫染色。 
	说明：载玻片的预处理方法为使用巴斯德移液管在载玻片上滴加1小滴组织粘附剂溶液和3小滴去离子水，并混合均匀以覆盖整个载玻片表面。</li>
	<li>将第一张载玻片浸入含100 ml 100%二甲苯的容器中两次，每次10分钟，以去除石蜡。</li>
	<li>将载玻片依次浸入含100 ml下列溶液的容器中各10秒，进行再水化处理：二甲苯/乙醇（1:1）、100%乙醇、96%（v/v）乙醇水溶液、70%（v/v）乙醇水溶液，最后为去离子水。</li>
	<li>将载玻片浸入含100 ml 0.5%（w/v）碘的96%（v/v）乙醇水溶液的容器中2分钟，以溶解氯化汞结晶。</li>
	<li>在含100 ml 5%（w/v）硫代硫酸钠水溶液的容器中清洗切片10秒，然后用蒸馏水彻底冲洗载玻片。</li>
	<li>将载玻片浸入含100 ml哈里斯苏木精染液的容器中染色2分钟，短暂浸入0.1 M HCl中，随后用流动自来水冲洗10分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入含100 ml 0.1%（w/v）伊红水溶液的容器中染色1分钟。</li>
	<li>依次短暂浸入含100 ml下列溶液的容器中进行脱水：去离子水、70%（v/v）乙醇、96%（v/v）乙醇、100%乙醇（两次）、二甲苯-乙醇（1:1），最后为100%二甲苯。</li>
	<li>在载玻片上滴加两滴封片介质，将盖玻片覆盖其上使其自然展开，然后在室温下静置24小时使其固化。</li>
</ol>
4. 免疫组织化学
<ol>
	<li>配制 Tris 缓冲盐水（TBS）。将 6.0 g 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris 碱）和 45.0 g 氯化钠（NaCl）溶解于 4.5 L 去离子水中，用 1 M 盐酸（HCl）调 pH 至 7.6（约 42 ml）。加蒸馏水定容至 5 L。</li>
	<li>配制 Tris-HCl 缓冲液。将 60 g Tris 碱溶解于 800 ml 去离子水中，用 6 M HCl 调节 pH 至 7.6（约需 65 ml），加蒸馏水定容至 1 L。使用前用蒸馏水稀释 10 倍。</li>
	<li>配制 0.1% Tris-BSA 缓冲液。将 12.1 g Tris 碱和 45.0 g NaCl 溶解于 4.5 L 去离子水中，用 1 M HCl（约 42 ml）调节 pH 至 8.2。加入 5.0 g 牛血清白蛋白（BSA）和 6.5 g NaN3加入去离子水至5 L。 
	警告：NaN3 为高毒性物质，与酸接触会释放出剧毒气体。务必佩戴手套，并严禁摄入。NaN3 与铜、铅及其他金属可形成极为敏感的爆炸性化合物。使用后需用大量水冲洗 sinks。可选用 0.01% 硫柳汞作为替代防腐剂。</li>
	<li>按照步骤 3.2 至 3.10 操作。</li>
	<li>将切片浸入TBS或Tris–0.1% BSA缓冲液中，用纸巾擦去组织周围多余的液体。</li>
	<li>应用 150 µl 正常山羊血清用TBS或含5%（w/v）BSA的Tris–0.1%（w/v）BSA缓冲液按1:20稀释，在高湿度孵育盒（用于载玻片共孵育的密闭盒，内放置开放的盛水容器以维持高湿度环境）中孵育30分钟。随后用纸巾吸除多余液体。</li>
	<li>应用 150 µl 在含1%（v/v）正常山羊血清的Tris缓冲液–0.1%（w/v）BSA中稀释一抗血清，在高湿度孵育盒中孵育至少2小时。一抗血清的最佳稀释比例需通过实验确定。 
	注意：免疫组织化学可用于检测鸡心脏抗原，但使用特异性抗体时，本方法也可适用于其他抗原（如绿色荧光蛋白）的检测15 同样。</li>
	<li>在摇床上用 Tris-0.1% w/v BSA 溶液洗涤载玻片两次，每次 5–10 分钟。</li>
	<li>用纸巾吸去多余液体并涂抹 150 µl 过量的羊抗兔抗血清例如在高湿度孵育盒中，用TBS缓冲液按1:20比例稀释的抗体孵育至少1小时。</li>
	<li>在摇床上用 TBS 洗涤两次，每次 5–10 分钟。</li>
	<li>用纸巾吸去多余液体。在高湿度孵育盒中，加入用含1%（v/v）正常山羊血清的TBS稀释1:250的辣根过氧化物酶-抗辣根过氧化物酶复合物，孵育至少1小时。该复合物的稀释比例取决于批次。</li>
	<li>用TBS洗涤载玻片，然后转移至pH 7.6的Tris–HCl缓冲液中。</li>
	<li>将载玻片转移至含有0.25 g/L二氨基联苯胺和0.01%（v/v）H₂O₂的Tris–HCl缓冲液中2O2 孵育几分钟。当鸡心被染色后，停止孵育。在显微镜下定期检查。</li>
	<li>将载玻片转移至 Tris–HCl 中孵育 10 分钟，随后转移至蒸馏水中。</li>
	<li>遵循步骤 3.13 和 3.14。 
	注意：对于在固定过程中容易被破坏的抗原，培养物的冷冻切片可作为免疫组织化学分析的替代方法。以下实验步骤对此进行了描述：</li>
	<li>用3 ml林格氏盐溶液洗涤活体培养物，以去除血清蛋白。</li>
	<li>加入一滴封片剂至预冷的（−16 °C冷冻切片机的样品夹持器。在液滴完全冻结之前，将培养的组织从玻璃盖玻片边缘转移至该液滴顶部。</li>
	<li>将培养物冷却至 −16 °C，切割 6 µm 厚的冰冻切片，并将其收集在明胶包被的玻片上。</li>
	<li>将载玻片置于丙酮中固定 4 °C 10 分钟后储存于 4 °C.</li>
	<li>按照步骤 4.5 至 4.15 进行操作。</li>
</ol>
5. 检测结果的评估
注意：在本实验中，侵袭定义为测试细胞对PHF的逐步占据。通过显微镜分析共培养体系的所有连续切片，可重建测试细胞聚集体与PHF之间相互作用的三维结构。
<ol>
	<li>观察不同的相互作用模式，并根据以下标准进行分级（见图5）。 
	0级：仅观察到心外膜下成纤维细胞团（PHF），无 confronting 细胞可见。 
	I级：confronting 测试细胞附着于PHF，但未侵入心肌组织，甚至未占据最外层的成纤维样细胞层。 
	IIa级：对PHF的占据仅限于外层的成纤维样细胞和成肌细胞层。 
	IIb级：PHF已包围细胞聚集体，但无任何占据迹象。 
	III级：confronting 细胞已侵入PHF，但保留了超过一半的原始心肌组织结构。 
	IV级：confronting 细胞已占据PHF原始体积的一半以上。 
	注意：I级和II级通常出现在非侵袭性细胞群体中，而III级和IV级则为侵袭性行为的典型表现。为评估不同时间点的进展，应对经过不同孵育时间后固定的confronting共培养样本进行组织学分析。</li>
</ol>
<img alt="显示连续切片、苏木精-伊红染色、抗血清、鸡心、组织染色的组织学示意图。" src="/files/ftp_upload/52792/52792fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 癌细胞与PHFs相互作用的示例。共培养体系的组织学切片，分别用苏木精-伊红染色（左图）或针对鸡心组织的抗体进行免疫组织化学染色（右图）。相互作用等级在实验方案文本中定义。（H：心脏组织，T：肿瘤细胞）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52792/52792fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 药物处理后的毒性评估
<ol>
	<li>用巴斯德吸管将对置培养物以最小体积转移至24孔组织培养多孔板中。</li>
	<li>加入500 µl不含药物的培养基洗涤培养物，并在6小时后更换新鲜培养基。</li>
	<li>每天使用倒置显微镜（物镜40X）检查所有孔中组织块是否有细胞迁出。将有细胞迁出的培养物数量除以接种的组织块总数，得到对置培养物的存活指数。将药物处理组的结果与溶剂对照组进行比较。 
	注意：建议将Ki67免疫组织化学法（用于检测细胞增殖）和TUNEL法（用于检测细胞凋亡）作为外植体实验的补充技术，用于评估毒性。</li>
</ol>
7. 对峙培养物的生长评估
<ol>
	<li>使用配备数字摄像机的显微镜（物镜50X），在固定前对培养物拍摄黑白照片。</li>
	<li>根据放大倍数，以毫米（mm）为单位测量培养物的较大直径（a）和较小直径（b）。</li>
	<li>通过以下公式16计算培养物的近似体积（V），单位为 mm3</li>
	<li>V = 0.4 × a × b2</li>
	<li>通过将该终末体积与对峙开始时PHF和细胞聚集体的总体积进行比较，计算培养物的生长情况。 
	注意：由于单独培养的PHF在培养过程中体积 tends to 减小，因此对峙共培养中的生长情况依赖于肿瘤细胞。</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在制备成纤维细胞凝块（PHFs）过程中，组织碎片可能无法保持悬浮状态，而是粘附于容器壁上；可通过增加培养基体积来克服这一问题。如果PHFs数量过少且体积过大，则应减少培养基体积。试验细胞未能发生聚集可能源于温度波动或微生物污染。此外，细胞本身可能具有无法聚集的内在特性。在细胞聚集体与PHFs贴附过程中，若出现贴附不良，可通过延长在半固体琼脂培养基上的孵育时间，或用吸水滤纸吸除培养物周围多余的液体培养基来改善。此时也应检查是否存在微生物污染。切片过程中遇到困难可能是由于石蜡块发生解体所致：这种情况通常因石蜡块储存时间过长引起（可重新熔化石蜡）。当出现切片伪影时，应检查切片刀的完整性，并确认固定后的培养物中不存在异物（corpora aliena）。培养物中出现坏死区域是培养条件不佳的表现。若坏死区域仅局限于培养物的中心部位，则应怀疑共培养体系的体积过大。因此，PHF与细胞聚集体体积的恰当选择确实是一个关键因素。然而，若出现广泛性坏死，则提示可能存在pH调控不当、微生物污染或固定过程中的伪影。最后，若切片颜色过深，可能是苏木精浸染时间过长，或切片过厚（&#62;8 µm）所致。
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侵袭是恶性肿瘤的特征。这种活动不仅会导致周围组织的破坏，还与转移灶的形成有关。由于癌症患者大多死于肿瘤侵袭和转移，而目前有效的抗侵袭治疗手段仍然有限，因此已开发出多种实验室检测方法以模拟肿瘤细胞的侵袭过程。鸡胚心脏检测法旨在提供一种相关的器官培养方法，用于在三维环境中研究肿瘤侵袭。该检测能够区分侵袭性与非侵袭性细胞，并可用于研究测试化合物对肿瘤侵袭的影响。
该实验方法的理论基础在于，肿瘤本质上是生态系统，其中肿瘤细胞持续与其间质（宿主细胞和细胞外基质）相互作用，并通过这些分子相互作用精确调控侵袭过程1。因此，在该实验中，将肿瘤细胞与活的鸡胚心脏组织碎片共同培养2，后者不仅作为肿瘤细胞侵袭的基质，同时也提供多种类型的间质细胞和基质成分。鸡心脏组织包含心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞，其细胞外基质由层粘连蛋白、纤连蛋白及多种类型的胶原蛋白组成。通过这种方式，三维器官培养技术涵盖了患者肿瘤侵袭过程中涉及的多种细胞与分子相互作用。
鸡胚心脏实验的主要优势在于能够体现间质效应。这一方面比其他侵袭实验更为全面。 体外 基于肿瘤细胞侵袭由基底膜组成的非活性凝胶3 或间质基质4 分子。在器官培养实验中观察到的肿瘤细胞与正常活体宿主组织之间的对抗概念，已由包括法国的 Wolff 和 Schneider 在内的多位学者提出。5，英国的Easty和Easty6，以及德国的施莱希7该鸡胚心脏侵袭实验相较于所引用方法的两个技术优势在于，组织碎片的体积易于标准化，且碎片保持收缩功能，从而可在器官培养期间监测其功能完整性。此外，优先选用禽类胚胎的原因是可轻松从无菌的蛋内容物中分离获取。该实验在概念上与鸡胚尿囊绒毛膜实验具有相似性。8 通过为肿瘤细胞提供复杂的间质环境。
该检测方法已成功应用于区分来自同种人类肿瘤的侵袭性与非侵袭性细胞亚型，例如 MCF-7（乳腺）9 和 HCT-8（结肠）10 细胞系家族。该技术也可用于测试潜在的抗侵袭性化合物11,12。如后文所述，还可用于建立小分子有机化合物的构效关系。然而，该检测未考虑免疫细胞在癌症侵袭过程中的作用。需要强调的是，由于操作步骤繁多、每次实验的检测数量有限（最多30个培养样本）以及较长的周转时间（约1个月），该技术不能被视为高通量分析系统。

<table><tbody><tr><td>林格氏盐溶液</td><td>Braun</td><td>CEO123</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养用琼脂</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷（Tris）分析纯</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），Cohn V 组分</td><td>Sigma</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Rega 3 培养基</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>19993013</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>G10 和 G33</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形瓶</td><td>Novolab</td><td>92717</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>Novolab</td><td>68516</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>Rumex</td><td>11-0625</td><td></td></tr><tr><td>带校准目镜网格的体视显微镜</td><td>Wild</td><td>157702</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>International Medical Products</td><td>8599956</td><td></td></tr><tr><td>伊红 Y</td><td>Sigma</td><td>230251-25g</td><td></td></tr><tr><td>哈里斯苏木精</td><td>Sigma</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>封片树脂（Tissue-Tek）</td><td>Sakura</td><td>4494</td><td></td></tr><tr><td>石蜡熔化装置</td><td>GFL</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>石蜡切片用切片机</td><td>Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带气体进出接口的锥形瓶塞子</td><td>Novolab</td><td>2602421 和 260243</td><td></td></tr><tr><td>二氨基联苯胺</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>REAX 摇床</td><td>Heidolph</td><td>54131</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>VWR</td><td>NUNC142475</td><td></td></tr><tr><td>眼科去眼球匙</td><td>Rumex</td><td>16-060</td><td></td></tr><tr><td>尖头镊子</td><td>Rumex</td><td>4-111T</td><td></td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>Nickel-Electro LTD</td><td>7112</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 锥形瓶</td><td>Novolab</td><td>211901</td><td></td></tr><tr><td>清洗并脱脂的显微镜载玻片</td><td>International Medical Products</td><td>8613908</td><td></td></tr></tbody></table>

用于检测癌细胞侵袭性及潜在抗侵袭化合物活性的鸡胚心脏侵袭实验

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

鸡胚心脏实验的目的是提供一种相关的器官培养方法，用于在三维环境中研究肿瘤侵袭。该实验可区分侵袭性与非侵袭性细胞，并可用于研究待测化合物对肿瘤侵袭的影响。将癌细胞（以细胞团或单细胞形式）与鸡胚心脏组织碎片共培养。经过数天至数周的悬浮器官培养后，将共培养物固定并包埋于石蜡中，以进行组织学分析。通过连续切片并使用苏木精-伊红染色，或对心脏组织及相邻癌细胞中的抗原表位进行免疫组织化学染色，重建癌细胞与正常组织之间的三维相互作用。该实验与当前关于肿瘤侵袭的概念一致，即肿瘤侵袭是癌细胞与其邻近间质宿主成分（如肌成纤维细胞、内皮细胞、细胞外基质成分等）之间分子相互作用的结果。在此模型中，癌细胞所面对的正是以活体组织碎片形式提供的间质微环境。该实验的相关性具有多方面支持。实验中的侵袭过程符合肿瘤侵袭的判定标准：在时间和空间上逐步占据并取代宿主组织，以及表现出侵袭性或非侵袭性特征 体内 对 confronting 细胞的行为通常与实验结果相关。此外，细胞的侵袭模式 体内 由病理学家定义的特征在检测的组织学图像中得以体现。对多种潜在抗侵袭性有机同类化合物所得结果进行定量构效关系（QSAR）分析，可研究黄酮类化合物、查尔酮类化合物以及临床使用的已知抗转移药物的构效关系。例如， 微管抑制剂在该检测中同样抑制侵袭。然而，该检测未考虑免疫因素对癌症侵袭的影响。

图5所示的组织学切片呈现了多次成功实验的最终结果。培养物良好的组织学形态表明细胞具有活性，可用于解读肿瘤细胞与正常组织之间的相互作用。此外，未观察到正常组织产生免疫反应，这证实所使用的鸡胚日龄正确。 例如， 在免疫排斥系统发育完成之前。培养期间未见细菌，表明无（明显）污染。最后，组织块边缘呈圆形，证实其为悬浮培养，且无（暂时性）黏附于锥形瓶壁的迹象。
已在该检测中测试了多种化合物。通常在将成对的PHF/肿瘤聚集体转移到小型锥形瓶时（步骤2.7），将药物加入培养基中。部分化合物作为工具药使用（已知的抑制剂和激活剂），用于揭示参与肿瘤侵袭过程的信号通路和效应分子。对于其他结构相关的化合物，则根据鸡胚心脏侵袭实验的结果建立了定量构效关系（QSAR）。因此，针对一系列相关的多酚类化合物，采用了多个计算描述符，以预测其在该实验中的抗侵袭活性。在长达15年的时间里，共测试了139种不同的类似物在该实验中可能具有的抗侵袭作用，并将其活性分为4类。从中随机选取93种和46种多酚类化合物分别作为训练集和验证集。通过QSAR人工神经网络分析，验证集的结果显示预测的抗侵袭活性与实验...

在此，我们介绍一种在三维条件下研究肿瘤细胞侵袭活体正常组织碎片的实验方案。该器官培养技术主要用于测试潜在的抗侵袭性药物 体外.

鸡胚心脏实验的目的是提供一种相关的器官培养方法，用于在三维环境中研究肿瘤侵袭。该实验能够区分……

本实验的总体目标是提供一种相关的器官培养方法，用于在三维环境中研究肿瘤侵袭。该方法首先制备来自鸡胚心脏的正常组织碎片，然后在第二步中制备悬浮状态的肿瘤细胞聚集体。随后，将肿瘤细胞团块分别置于半固体琼脂培养基上，与正常组织碎片共培养，在悬浮培养条件下进行孵育。最后一步中，将共培养的样本固定，用于石蜡包埋和组织切片。最终，通过连续显微镜分析组织切片，可观察到肿瘤细胞向组织碎片中的侵袭情况。与现有的凝胶侵袭实验等方法相比，该技术的主要优势在于，肿瘤细胞将与三维的活体组织碎片直接接触。该技术的应用意义延伸至癌症治疗领域，因为目前临床上仍缺乏有效的抗侵袭药物。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，其原因在于他们忽视了使用特定尺寸的组织碎片和肿瘤细胞聚集体的重要性。尽管该方法可用于研究癌症侵袭，也可应用于其他系统。例如，可用于研究炎性细胞对周围组织的侵袭，或干细胞向心肌组织的整合。在培养过程中，首先将受精蛋在37摄氏度下孵育九天，以获取鸡心脏组织碎片。第九天，用70%乙醇对蛋壳进行消毒。然后在组织培养柜中，使用钝头镊子打开蛋壳。接着将去壳勺置于胚胎颈部周围，将胚胎从蛋壳中取出。将胚胎置于含有5毫升任氏盐溶液的5厘米玻璃培养皿中。然后双手各持一把尖头镊子，撕开胸部腹侧皮肤，去除胸骨，并使用虹膜剪分离心脏并切断其主要血管。将心脏转移至一个新的含有5毫升培养基的五厘米玻璃培养皿中，培养基中添加5%胎牛血清，在带有校准目镜网格的显微镜下操作。使用显微解剖剪切除心脏上部的颅侧三分之一，以去除心房及相关的血管。然后使用锐利的镊子将心包膜从心室上分离。接着，在心室上做矢状半切，并去除血液。随后将心室转移至另一个含有5毫升新鲜培养基和胎牛血清的5厘米培养皿中，并将组织切成直径为0.4毫米的组织块。当所有心室均被切开后，轻轻旋转培养皿，使所有组织碎片向皿的中心聚集。然后使用不锈钢针将所有Cora Eliana移至培养皿的边缘。接着用玻璃巴斯德吸管将心脏碎片转移至一个50毫升的Erlenmeyer锥形瓶中，该锥形瓶表面覆盖有一层薄薄的培养膜。用含5%二氧化碳的气体环境处理烧瓶，并将组织碎片置于37°C、转速为每分钟70转的旋转摇床上孵育24小时。次日，将组织碎片转移至培养皿中，使用针头去除坏死的深色碎片（Corporal Eliana）以及任何组织团块。将碎片继续在含有6毫升培养基的50毫升锥形瓶中，于旋转摇床上孵育额外60小时。两天半后，使用显微镜和针头挑选出具有均匀薄层成纤维细胞样细胞、直径为0.4毫米的类固醇样组织碎片。然后将预先培养的心脏组织碎片转移至另一含有新鲜培养基的培养皿中。在开始对向培养前3天，将100,000个测试细胞悬浮于6毫升适当的培养基中，置于50毫升锥形瓶内。随后将锥形瓶置于旋转摇床上，在37°C、70转/分钟及适当浓度二氧化碳条件下进行培养。72 小时后，在显微镜下观察细胞团，并挑选直径为 0.2 毫米的类固醇细胞团。接着，将悬浮在少量培养基中的八个 0.4 毫米预培养心脏碎片转移至含有半固体琼脂培养基的胚胎学培养皿中。将组织块移至一个圆形区域内，用一小块滤纸吸除多余的培养基。将10个0.2毫米的类固醇细胞聚集体放入该圆形区域中。在去除多余培养基后，将每个聚集体逐一移向预先培养的心脏组织块，直至彼此接触。现在，用石蜡密封表面皿的盖子，并根据待测细胞对预培养心脏组织碎片的黏附特性，将共培养物在37摄氏度下孵育4至24小时。孵育结束后，将一对相对的组织置于37摄氏度预热的培养基中，使用巴斯德移液管将每对组织转移至各自含有1.5毫升培养基的5毫升厄伦美厄烧瓶中。随后将烧瓶置于旋转摇床上，在37摄氏度、120转/分钟的条件下孵育，并通入适当浓度的二氧化碳。另准备两个装有2毫升林格氏盐溶液的5毫升锥形瓶，用于对相对组织进行组织学分析。孵育结束后，将培养物转移至林格氏盐溶液中数秒钟，以去除血清蛋白。接着，将组织块转移至分别盛有3毫升Bowen Holland溶液的3厘米培养皿中。2小时后，用3毫升去离子水将培养物冲洗三次，然后在自来水中孵育2小时，以尽可能去除固定液。最后，将组织对分别转移至含有3毫升70%乙醇的容器中，可保存数天。在这些成功培养的图像中，肿瘤组织和心脏组织均未观察到正常组织产生的免疫反应，证实所使用的鸡胚是在免疫排斥系统发育之前进行实验的。同时未见细菌存在，表明培养期间无明显污染。此外，组织块边缘呈圆形，表明这些培养物处于悬浮状态，未出现暂时性黏附于Erla mire培养瓶壁的现象。已有多种化合物通过该鸡胚心脏侵袭实验进行测试。对于结构相关的化合物，基于实验结果建立了定量构效关系，数据显示预测的抗侵袭活性与实验测得的抗侵袭活性之间存在明确相关性。事实上，该混淆矩阵可用于总结该检测方法的优缺点，粗略地反映实验的准确性和可重复性。在尝试这一新方案时，严格遵循所规定的组织碎片尺寸至关重要。此外，还可采用其他方法，如将组织与非癌细胞共培养，以回答更多问题，例如：炎性细胞是否会侵入？观看本视频后，您应能充分理解如何区分侵袭性与非侵袭性肿瘤细胞。请注意，使用固定剂时可能存在极高危险性，因此在进行该操作时应采取适当预防措施，例如确保空气通风。

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