Name: 胸腺表征祖定居在小鼠胚胎使用在体内和在体外测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 了解胸腺定居祖细胞表征方法，用于免疫学与发育生物学研究，采用小鼠胚胎体内外联合实验技术。该方法通过流式分选与肾包膜移植实现T细胞完整成熟，助力深入探索T细胞发育动态机制。

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由巴斯德研究所、法国国家健康与医学研究院（INSERM）、法国国家科研署（ANR）（“淋巴细胞生成”项目资助）、REVIVE 未来投资计划以及“法国抗癌联盟”提供支持。

伦理声明：所有实验均根据法国农业部批准的巴斯德研究所伦理章程以及欧盟指南进行。所有外科手术均由接受过小型啮齿动物手术培训并获得法国农业部认证的操作人员执行。 
注意：参见附录中的表1，其中展示了五步计划程序。
1. 胚胎的选择
<ol>
	<li>使用36只C57BL/6 CD45.2雌性小鼠、12只CD45.1雌性小鼠、12只C57BL/6 CD45.1雄性小鼠和12只C57BL/6 CD45.2雄性小鼠。将雌鼠与任一基因型雄鼠交配，可获得CD45.1/2或CD45.1胚胎，用于获取TSP；或获得CD45.2胚胎，用于获取受体胸腺叶。所有雄鼠需单独饲养。</li>
	<li>为获得用于E18期TSP分离的胚胎，于移植实验前21天下午6点将2只雌鼠与1只CD45.1雄鼠合笼。次日中午前检查阴道栓情况，并将发现阴道栓的雌鼠单独分离饲养。</li>
	<li>为获得用于被TSP定植的E14期胚胎，在移植实验前17天重复上述步骤（1.2），使用CD45.2雄鼠进行交配。</li>
	<li>为获得用于分离E13期TSP的胚胎，在移植实验前16天重复上述步骤（1.2），使用C57BL/6 CD45.1雄鼠进行交配。</li>
</ol>
2. 在水平层流罩下解剖胚胎
注意：嫁接实验前两天。
<ol>
	<li>通过颈椎脱位或在密闭饱和容器中持续通入 CO2 气体至少 5 分钟，处死怀孕雌鼠。通过确认心肺运动永久停止来确保动物死亡。用 70% 乙醇润湿腹部。</li>
	<li>沿腹部正中线做皮肤纵向切口，将皮肤向两侧拉开。用镊子和剪刀切开腹膜，避免接触消化道。取出双角子宫，并用剪刀将其与阴道分离。</li>
	<li>将子宫置于一个含有 40–50 ml DPBS 的 90 × 15 mm 培养皿中，并在每个胚胎的蜕膜之间横向剪开。</li>
	<li>使用精细尖头剪刀和精细镊子去除子宫的肌层膜，通过在胎盘和卵黄囊之间剪开取出胚胎，并移除包裹胚胎的羊膜。</li>
	<li>将胚胎转移至一个含有 HBSS + 1% 胎牛血清（FCS）的 90 × 15 mm 培养皿中。对于 E15 以后的胚胎，在进一步解剖前需用剪刀去除头部。</li>
</ol>
3. 胸腺的分离
<ol>
	<li>在双目放大镜下，将胚胎仰卧位（腹面朝上）放置于湿润的纱布垫上。</li>
	<li>用一把镊子沿胸骨软骨纵向插入，夹住并打开胸廓。使用弯头镊子将胸壁向一侧拉开，以暴露气管两侧的胸腺叶。</li>
	<li>用精细镊子轻轻夹住每个胸腺叶的下方，小心提起，将其置于含有1 ml HBSS + 1% FCS的培养皿中。利用两支1 ml注射器配26 G ⅜"针头分离胸腺叶，并去除周围结缔组织，注意不要损伤包膜。</li>
	<li>用3 ml HBSS + 1% FCS洗涤胸腺叶，以去除血细胞。 
	注意：在E15之前，胸腺叶位于气管两侧，之后在中线融合形成双叶状器官。</li>
</ol>
4. 细胞悬液
<ol>
	<li>在含有1% FCS的HBSS中，使用安装在1 ml注射器上的两根26 G针头，在双目放大镜下分离肺叶。将细胞悬液通过尼龙网筛过滤。</li>
</ol>
5. 荧光抗体染色与细胞分选
注意：所有抗体均已预先滴定以获得最佳的细胞群定义效果（滴定值可能因抗体批次不同而有所变化）。
<ol>
	<li>将胸腺细胞（E13 或 E18）与 100 μl 生物素标记抗体混合液在 4 °C 下孵育 15–30 分钟，以标记谱系阳性细胞（抗 CD19、抗 Gr1、抗 Ter119、抗 NK1.1、抗 CD11c、抗 CD3、抗 CD4、抗 CD8、抗 CD25）。</li>
	<li>为去除未结合的抗体，将细胞管在 280 × g 条件下以 4 ml HBSS + 1% FCS 离心 7 分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于新鲜的 HBSS + 1% FCS 中。重复一次离心步骤。</li>
	<li>将 E18 生物素标记的细胞与链霉亲和素磁珠在 4 °C 下孵育 15 分钟，并用 HBSS + 1% FCS 洗涤细胞两次。将细胞重悬于 2 ml HBSS + 1% FCS 中。大多数 E13 胸腺细胞为谱系阴性，因此在细胞分选前无需进行 MACS 富集。</li>
	<li>按照制造商说明，将细胞通过 LS 柱。当全部细胞悬液进入柱子后，加入 2 ml HBSS + 1% FCS。收集柱子流出的 4 ml 液体，并在 280 × g 条件下离心 7 分钟以收集细胞。</li>
	<li>将经耗竭处理的 E18 细胞或总 E13 胸腺细胞沉淀重悬于 50 μl TSP 抗体混合液（抗 CD117 APC、抗 CD135 PE、抗 CD127 PECy7、抗 CD24 FITC、抗 CD44 APCCy7 和链霉亲和素 Pacific Blue）中，在 4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
	<li>用 4 ml HBSS + 1% FCS 洗涤细胞，然后将细胞重悬于含碘化丙啶的 1 ml HBSS + 1% FCS 中。</li>
	<li>使用配备 4 个激光器的流式细胞分选仪（FACS），将 TSPs Lin-CD44+CD117+CD24lowCD127+CD135+ 细胞分选至含有 200 μl 完全培养基 + 20% FCS 的 1.5 ml 离心管中。首先根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）信号对细胞按大小和颗粒度设门。排除死细胞（碘化丙啶染色阳性），去除双联体，并以指数刻度记录荧光信号。每个 E13 胸腺可获得约 100 个 TSPs，每个 E18 胸腺可获得约 600 个 TSPs。</li>
</ol>
6. 前体细胞定植 E14 胸腺叶：悬滴法
<ol>
	<li>在培养前3小时，对来自CD45.2胚胎的E14胸腺叶进行照射（30戈瑞 = 30 Gy）。 
	注意：E14或E15胸腺叶已成功用作T细胞前体细胞的受体。使用妊娠后期的胸腺叶作为受体会因器官体积较大而导致过早坏死，而更早期的胸腺叶则发育不良，可能与上皮细胞未完全发育有关。</li>
	<li>将分选得到的TSP细胞离心，并重悬于培养基中（含10%胎牛血清、青霉素（50单位/毫升）、链霉素（50 µg/毫升）和2β-巯基乙醇（50 µM）的OPTI-MEM完全培养基），使35 μl体系中含有500个TSP细胞。</li>
	<li>在60孔Terasaki板中，每隔一个孔加入一滴35 μl的细胞悬液。 
	注意：若将35 μl液滴置于相邻孔中，可能发生融合。</li>
	<li>将一个经照射的胸腺叶放置于每滴液滴表面。盖上Terasaki板，然后将板倒置，使细胞在重力作用下迁移至液滴的顶端极。</li>
	<li>轻轻敲击倒置板的上侧，促使胸腺叶滑向液滴顶端边缘。将倒置的Terasaki板置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育48小时。完成定植后，可将E14胸腺组织用于FTOC7培养，或移植至受体成年小鼠的肾包膜下8。</li>
</ol>
7. 胎儿胸腺器官培养
<ol>
	<li>在35 mm培养皿中加入3 ml完全培养基。将一张Isopore膜滤器漂浮于培养基上。用镊子将重建的胸腺叶放置在膜的边缘（每张膜上不超过8个胸腺叶）。</li>
	<li>将含有胸腺叶的培养皿放入一个90 mm培养皿中，同时放入一个无盖的35 mm培养皿，其中含有2 ml水，以维持最佳湿度。在37 °C、5% CO2条件下孵育12天。</li>
</ol>
8. 无菌条件下肾包膜下移植
注意：肾实质由结缔组织形成的被膜包裹。被膜下区域富含血管和淋巴管，因而为移植物的发育提供了适宜的环境例如 胸腺叶、胰岛或新生心脏）。移植通常在左肾进行，因为左肾比右肾更易于操作。CD3-/- 使用雄性小鼠作为受体，以避免因与Y染色体连锁的次要组织相容性抗原引起的移植物抗宿主反应，因为在E15之前难以进行性别鉴定。
<ol>
	<li>手术过程中对器械进行灭菌，并佩戴无菌手套。使用1 ml注射器，通过腹腔注射 Ketamine（10 mg/ml）与 Xylazine（1 mg/ml）溶于PBS的混合溶液对小鼠进行麻醉（每10 g体重注射50至100 μl）。通过检测趾间反射是否消失来确认麻醉效果。每只眼睛滴加一滴hydro-Optimune凝胶，以防止麻醉期间角膜干燥。 
	注意：该溶液应现配现用，并在注射前于室温下预热。麻醉作用可持续至少20分钟。整个手术过程中需持续监控麻醉深度。每20分钟可通过腹腔注射半剂量药物以延长麻醉时间。</li>
	<li>将小鼠置于水平层流罩下，侧卧于右侧。使用70%乙醇和10%碘伏皮肤消毒液对术区进行消毒。用镊子分开后肢关节上方约2 cm长度的毛发，剃除手术区域的毛发。</li>
	<li>使用手术刀在皮肤组织上做一道长约1.5 cm的切口，随后用剪刀剪开肌肉组织。对切口两侧施加轻微压力，使肾脏从腹腔中突出。</li>
	<li>用棉签蘸取生理盐水保持肾脏湿润。若暴露器官有困难，可用平头镊子轻轻牵拉附着于肾脏周围的脂肪组织。将棉签置于器官下方，以维持肾脏处于腹膜后腔外的位置。</li>
	<li>使用两把精细镊子在肾包膜上制造一个2–3 mm的小孔（注意避免触碰实质组织，以防出血）。在整个手术过程中，应持续保持暴露的肾包膜湿润。</li>
	<li>在保持肾包膜切口张开的状态下，小心地将移植物小叶插入肾包膜下，并沿包膜向极缘滑动移植物。每侧肾脏最多可植入6个小叶。</li>
	<li>将肾脏复位至腹膜后腔。使用单独外科结缝合肌膜，然后缝合皮肤。用10%聚维酮碘溶液湿润伤口。将小鼠置于37 °C加热垫上。</li>
	<li>持续观察移植小鼠，直至其完全从麻醉中恢复，监测指标包括心率、呼吸及胡须运动，黏膜颜色，直至出现自主活动表明完全恢复。 
	注意：建议在手术后立即以及术后连续两天进行肌肉注射镇痛剂（布托啡诺，0.1 mg/kg），以预防术后疼痛。</li>
	<li>将手术后的小鼠隔离饲养直至完全恢复。每隔一天检查一次伤口缝线，以确认并预防感染。采用本方案未观察到伤口感染的发生。 
	注意：每周对CD3-/-移植小鼠的外周血细胞进行分析，可通过CD45同种异型标记及T细胞谱系特异性抗体检测来源于E13或E18期前体细胞的胸腺来源细胞群（图3）。</li>
</ol>
9. 通过流式细胞术分析 TSP 后代
<ol>
	<li>将FTOCs逐个分离，以获得单细胞悬液（参见第4步实验方案）。</li>
	<li>使用含有识别CD45.1 PECy7、CD45.2 AmCyan、CD4 APCCy7、CD8 APC、CD3 Pacific Blue、Vγ5 FITC、Vδ1 PE抗体的抗体混合物对来自各个叶的单细胞悬液进行染色，并按照第&#160;5节所述条件孵育。</li>
	<li>将细胞重悬于HBSS + 1% FCS + 碘化丙啶中，然后在流式细胞仪中进行分析（结果见图2）。</li>
</ol>

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<li>Malissen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+T+cell+development+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+CD3-epsilon+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene.</a> EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

分析T细胞分化的两种主要检测方法 离体最近报道的方法是将造血祖细胞与表达Notch1配体（delta like 1或4）的骨髓基质细胞OP9进行共培养。12该二维检测方法操作简便、效率高且灵敏，可实现单细胞水平的分析。然而，它既不能支持T细胞发育超越双阳性（DP）阶段，也无法生成γδ型表皮内T细胞（DETC）。13两者均需要与胸腺上皮直接相互作用。
FTOC 已长期用于分析 T 细胞发育3。该实验的主要优势在于能够生成所有成熟的 T 细胞区室，这一特性得益于胸腺细胞与胸腺上皮之间高效的三维相互作用。本文中我们测试了两种目前用于耗竭内源性胸腺细胞的方法，以实现外源前体细胞的有效定植。电离辐射和脱氧鸟苷处理均能有效耗竭发育中的胸腺细胞。然而，只有经辐射处理的胸腺叶能够在较长时间内维持 robust 的 T 细胞发育，提示 d-Gua 处理可能同时影响了上皮区室的某些组分。采用“悬滴法”使外源前体细胞定植于胚胎期胸腺叶。在竞争条件下，将两种细胞群体共同定植于经辐射处理的胸腺叶，可检测到不同细胞自主的生物学...

T淋巴细胞携带αβ或γδ T细胞受体（TcR），在特化的器官——胸腺中分化发育。发育完全的胸腺分为两个 distinct 区域：皮质区，在此胸腺前体细胞发育，并且TcR β链和α链基因发生功能性重排的胸腺细胞得以从程序性死亡中被拯救（该过程称为阳性选择）；以及髓质区，在此对自身配体反应过强的被选择性胸腺细胞被清除（阴性选择）1,2。胸腺起源于第三咽囊的内胚层，随后被间充质细胞包绕3。自胚胎第12天（E12）起，造血前体细胞开始定植于胸腺，此后持续的前体细胞招募对于正常T细胞发育至关重要4。胸腺定植细胞经历一系列连续的发育阶段，这一过程由Notch信号通路的激活所启动并维持，当胸腺上皮细胞（TECs）表面表达的类似delta样配体4（delta like 4）与胸腺细胞相互作用时，触发Notch信号通路，从而精确调控发育程序5。
胸腺细胞发育始于所谓的 CD4-CD8- 双阴性（DN）阶段。根据 CD25 和 CD44 的表达情况，DN 胸腺细胞可进一步细分为 DN1（CD25-CD44+）、DN2（CD25+CD44+）、DN3（CD25+CD44-）和 DN4（CD25-CD44-）。CD24（HSA）和 CD117（c-Kit）可将 DN1 亚群进一步划分为 5 个亚群，其中 DN1a 和 DN1b 对应早期胸腺前体细胞（ETP）。胸腺细胞在 DN 阶段发生 TcR δ、β 和 α 链的重排，并经历前 TcR 选择（发生在 DN3 至 DN4 阶段）。随后，它们过渡至 CD4+CD8+ 双阳性（DP）阶段，在此阶段 TcR α 链发生重排，继而进行阳性与阴性选择。在此过程中，大多数胸腺细胞被清除，仅有少数（3–5%）最终发育为成熟的 CD4+ 或 CD8+ T 细胞。
淋巴细胞分化途径依次经历造血干细胞（HSC）阶段，生成多能祖细胞（MPP）和淋巴系偏向的多能祖细胞（LMPP），后者已丧失生成红细胞和巨核细胞的潜能6。LMPP在表型上定义为缺乏成熟血细胞标记物（谱系阴性，Lin-），表达c-Kit（CD117）、Sca-1和Flt3/Flk2（CD135），且不表达可检测水平的白细胞介素（IL）-7受体α链（IL-7rα或CD127）。LMPP进一步分化为共同淋巴祖细胞（CLP）7，此时已失去生成髓系细胞的能力。CLP保留生成淋巴细胞（B细胞和T细胞）、自然杀伤细胞（NK细胞）、树突状细胞（DC）以及先天性淋巴细胞（ILC）的潜能，与LMPP的区别在于表达CD127且不表达高水平的Sca-1。
尽管胸腺定植前体细胞（TSP）的性质已受到广泛讨论8最近的研究明确表明，TSP在发育过程中会改变其表型、分化潜能和功能9我们进行了 体外 和 体内 通过FACS细胞分选技术分离E13（第一波）或E18（第二波）时期的胸腺定植前体细胞（TSP），并采用多种检测方法对其进行表征。将携带不同同种异型标记的等量E13和E18前体细胞接种至经辐照的胸腺叶中，进行胎儿胸腺器官培养（FTOC），可在相似的发育环境中追踪其子代细胞，揭示两类前体细胞之间存在的细胞内在特性差异。分别由E13或E18 TSP定植的胸腺叶可实现无竞争条件下的发育，从而避免两类前体细胞之间的选择性压力。 在体 移植定植的胸腺叶进一步表明，E13和E18 TSP的成熟后代也具有不同的生物学特性 体内第一波TSPs能快速产生T细胞，但生成的αβ和γδ T细胞数量较少。在后者中，我们检测到Vγ5Vδ1树突状表皮T细胞（DETC），这类细胞具有不变的TcR，可迁移至表皮并在伤口愈合中发挥功能，且仅在胚胎发育期间产生。10相比之下，第二波TSP产生大量TcR所需时间更长+ T细胞无法生成DETC。

<table><tbody><tr><td>90 × 15 mm 和 35 × 15 mm 塑料组织培养培养皿。</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>取样</td></tr><tr><td>26 G &amp;frac38;&quot; 0.45 x 10 mm 注射器配针头</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>细胞悬液</td></tr><tr><td>尼龙网筛布，已灭菌，50/50 毫米片状</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>细胞过滤</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>无菌操作</td></tr><tr><td>聚维酮碘 10%（贝塔碘）</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>无菌操作</td></tr><tr><td>氯胺酮 100 mg/ml（储备液）</td><td>MERIAL</td><td></td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>PBS 中的赛拉嗪 100 mg/ml（储存液）</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>麻醉剂和肌肉松弛剂</td></tr><tr><td>布托啡诺 0.3 mg/ml 储备液</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>阿片类镇痛药</td></tr><tr><td>眼科凝胶（0.2% 环孢素）</td><td>Schering-Plough 动物保健</td><td></td><td>眼部防护</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>分离胚胎</td></tr><tr><td>HBSS Hanks' 平衡盐溶液（+ CaCl）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>以洗去血液并解剖胚胎</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>培养用抗生素</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 体视显微镜</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>眼用W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>冷光源灯</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 紧凑型</td><td>两根鹅颈式光纤适配器</td></tr><tr><td>硅弹性体</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>解剖垫</td></tr><tr><td>圆形带孔勺</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>精细虹膜剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>万纳斯弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>镊子：Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>2 对精细的直头钟表匠镊子&amp;rsquo; Dumont #5 镊子，11 厘米，精细尖端。</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>6-0 C-3 3/8c 带针聚酰胺缝线</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>用于缝合</td></tr><tr><td>持针器</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>用于缝合</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>麻醉期间维持小鼠体温</td></tr><tr><td>膜式 Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>用于 FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 孔板</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>悬滴法</td></tr><tr><td>无菌纱布敷料 7.5 x 7.5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>涂抹消毒液</td></tr><tr><td>荧光或生物素标记的抗体</td><td>BD Biosciences、Biolegend 或 e-Bioscience&amp;nbsp;</td><td>克隆编号 见下表</td><td>细胞染色</td></tr><tr><td>MACS 柱/链霉亲和素磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>细胞耗竭</td></tr><tr><td>小鼠</td><td>查尔斯河实验室（CD45.1）和让维耶实验室&amp;nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 或 CD45.2</td><td>细胞与胸腺叶的来源</td></tr><tr><td>小鼠</td><td>CDTA Orl&amp;eacute;法国</td><td>CD3ε 基因敲除 CD45.2</td><td>嫁接实验</td></tr></tbody></table>

利用小鼠胚胎胸腺定植前体细胞的表征 体内 和 体外 检测方法

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

表征胸腺定植前体细胞对于理解T细胞发育的胸腺前阶段至关重要，这对于为淋巴细胞减少症患者设计T细胞替代策略具有重要意义。我们通过两种互补方法研究了小鼠胚胎第13天和第18天胸腺中的胸腺定植前体细胞 体外 和 体内 技术，均基于“悬滴”法。该方法可通过CD45同种异型标记物区分E13和/或E18胸腺前体细胞，从而定植经辐照的胎鼠胸腺叶，并追踪其子代细胞。通过混合细胞群定植可分析前体细胞生物学特性中的细胞自主性差异，而仅使用单一细胞群定植则可消除可能存在的竞争性选择压力。定植后的胸腺叶还可移植至免疫缺陷的雄性受体小鼠体内，以进一步分析其成熟的T细胞子代。 在体，例如外周免疫系统的种群动态以及不同组织和器官的定植情况。胎鼠胸腺器官培养显示，E13时期的前体细胞能够迅速发育为所有成熟的CD3+ 细胞并产出了经典的γδ T细胞亚群，即树突状上皮T细胞。相比之下，E18期前体细胞的分化延迟，无法生成树突状上皮T细胞。对胸腺移植的CD3-/- 小鼠实验进一步表明，E18期胸腺定植前体细胞随时间推移产生的成熟T细胞数量多于E13期对应细胞，而这一特征在短期胎儿胸腺器官培养中无法观察到。

为了选择一种能够有效清除胸腺小叶内源性胸腺细胞、从而促进定植前体细胞最佳发育的方法，我们比较了经照射或5天脱氧鸟苷（d-Gua）处理后胸腺小叶在定植后T细胞重建的水平。结果显示，在培养第9天时无显著差异，但在第12天时，经照射处理的小叶中T细胞数量多于经d-Gua处理的小叶。因此，在胸腺定植后获得T细胞发育方面，照射处理优于d-Gua处理图1）。为了研究E13和E18期TSP的发育潜能，我们将等量的这两种前体细胞混合后植入E14期经辐照的胸腺叶中。结果显示，与E18期TSP相比，E13期TSP产生的胸腺细胞和双阳性（DP）细胞较少，但相反地，E13期TSP能够生成DETC以及更高频率的CD3+ 成熟细胞（图2）。为了分析 体内 E13和E18 TSP潜能的评估中，将定植了每种类型前体细胞的胸腺叶移植至CD3肾包膜下-/- 受体。结果表明，与FTOC结果一致，E13 TSP产生T细胞的速度快于E18前体细胞，但循环T细胞的数量显著较低（图3).
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本文描述了通过分析T细胞前体的生成动力学、表型及数量，来表征胸腺定植前体细胞的体内和体外方法。

表征胸腺定植前体细胞对于理解T细胞发育的胸腺前阶段至关重要，是制定T细胞再生与免疫重建策略的基础。

本实验的总体目标是分析E13或E18胸腺定植前体细胞所产生T细胞的表型动力学特征及其数量变化。首先从E13、E14和E18小鼠胚胎中分离胸腺叶；第二步，将E14胸腺叶进行辐照处理，随后用流式分选的E13或E18细胞在悬滴系统中接种48小时，以实现胸腺叶的重建。在最后一步中，将定植的叶状组织移植到成年CD3基因敲除小鼠的肾包膜下。最终，可通过流式细胞术检测嵌合动物血液中E13和E18胸腺定植前体细胞的子代细胞的存在情况。与现有的体外T细胞培养于基质细胞上的方法相比，该技术的主要优势在于，它结合了三维实验体系中由明确前体细胞实现完整T细胞成熟的方法，并将胸腺器官样培养物移植至完整受体小鼠体内，从而能够评估胸腺切片前体细胞及其子代细胞的分化潜能与功能特性。作为一名具有啮齿类动物外科手术专长的研究工程师，我将演示以下操作步骤：在层流罩内，于移植实验前两天，用70%乙醇擦拭一只怀孕雌性小鼠的腹部，并沿腹中线纵向切开皮肤，将皮肤向两侧拉开以暴露切口，然后使用镊子和剪刀切开腹膜，注意避免接触消化道。接下来，取出双角子宫，并用剪刀将其与阴道分离。随后，将子宫置于一个90 × 15毫米的培养皿中，培养皿内含有40至50毫升DPBS溶液，并在每个胚胎的蜕膜之间进行横向切割。使用精细尖头剪刀和精细镊子，沿胎盘与卵黄囊之间的区域剪开子宫肌层膜，取出每个胚胎。随后去除羊膜，保留胚胎，并将胚胎置于一个新的含有HBSS加1%FCS的培养皿中。为分离胸腺，将胚胎逐一置于双目放大镜下，仰卧位放置。然后沿胸骨软骨纵向插入一把镊子，使用弯头镊子夹住并撑开胸廓网格。将胸壁拉向一侧，以观察气管两侧的胸腺叶。接着用精细镊子夹住胸腺下方，小心摘除每一片胸腺叶，并将其置于含有1毫升HBSS加1% FCS的培养皿中。接下来，使用两把精细镊子去除周围结缔组织，注意不要损伤小叶。然后将小叶在含有1% FCS的3毫升HBSS中洗涤，以去除红细胞，开始进行胎鼠胸腺器官培养照射。所用E14胸腺小叶如前所示，来自CD45.2胚胎。让叶状组织静置约三小时。然后离心收集 freshly sorted E 13 或 E 18 胸腺定植前体细胞。将沉淀重悬于培养基中，最终浓度为每 35 微升培养基含 500 个细胞。然后，在60孔Terasaki培养板的每隔一个孔中加入35微升细胞悬液，并将一个经辐照的叶组织置于每滴液体的表面。盖上培养板，将其倒置，使细胞在重力作用下沉降到液滴的顶端；轻轻敲击倒置培养板的上表面，促使组织叶滑移至液滴的顶端边缘。随后，将倒置的培养板置于含37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育48小时。在胸腺叶被定植后，通过观察受体动物是否缺乏反射反应来确认其麻醉水平。然后在每只眼睛上涂抹一滴眼膏，并将小鼠置于层流罩下右侧卧位。接着剃除后肢关节上方的手术区域毛发。接下来，戴上一副无菌手套，并用70%乙醇和10%碘伏溶液对手术区域进行消毒。使用手术刀穿过皮肤组织做一道1.5厘米的切口，随后切开肌肉组织。现在轻轻按压切口两侧，使肾脏从腹腔中部分挤出，并用生理盐水保持肾脏湿润。用棉签将肾脏固定于腹膜后腔外，使用两把精细镊子在肾包膜上制造一个2至3毫米的孔。然后轻轻撑开包膜切口，将最多六个胸腺叶移植物缓慢滑入肾极边缘下方，随后将肾脏放回腹膜后腔。先缝合肌肉和筋膜，再用单独的外科结缝合皮肤。然后用10%碘伏溶液润湿伤口，并将小鼠置于37°C的加热垫上，持续监测动物状态和手术伤口，直至其完全恢复，以确定耗竭内源性胸腺细胞、促进定植前体细胞发育的最佳方法。在本实验中，比较了经辐射处理或五天脱氧鸟苷处理后，定植胸腺叶中T细胞重建水平的差异。尽管在培养第9天时，两种处理组定植淋巴细胞的数量无明显差异，但在第12天，辐射处理组的胸腺叶中T细胞数量多于脱氧鸟苷处理组，因此辐射处理更有利于胸腺定植后T细胞的发育。为研究E13和E18期胸腺定植前体细胞的发育潜能，本实验采用E14期经辐射处理的胸腺叶，并接种等量的上述两种前体细胞。结果显示，E13期胸腺定植前体细胞产生的胸腺细胞和双阳性T细胞少于E18期胸腺定植前体细胞。然而，成熟 CD3 阳性细胞的频率增加，并且仅在 E13 胸腺定植前体细胞的子代中检测到树突状上皮 T 细胞的产生，以分析 E13 和 E18 胸腺定植前体细胞的体内潜能。将分别定植了这两类前体细胞的胸腺叶移植至 CD3 基因敲除受体的肾包膜下。正如刚刚所展示的，结果符合预期：E13 胸腺定植前体细胞比 E18 前体细胞更快地产生 T 细胞，尽管总体而言，E13 胸腺定植前体细胞定植动物体内循环 T 细胞的数量显著较低。该技术建立后，为发育免疫学领域的研究人员探索某些严格起源于胚胎的 T 细胞亚群特性提供了途径，这些研究是在哺乳动物模型中进行的。观看本视频后，您应能充分理解如何在自然环境乃至竞争性条件下，追溯 Timex 定植前体细胞及其子代细胞的分化与功能通路。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

胸腺表征祖定居在小鼠胚胎使用<em&gt;在体内</em&gt;和<em&gt;在体外</em&gt;测定

我们提供了生成新生嵌合体的逐步操作说明，以及为进行双光子显微镜离体成像而进行的胸腺解剖与制备方法。...

利用双光子显微镜对小鼠胸腺进行原位成像

我们开发了用于胸腺活体成像采集的新型实验工具和方案。该技术将有助于识别胸腺内发生T细胞发育的“微环境”。...

利用双光子显微镜对小鼠胸腺进行活体成像

本视频展示了一种利用三维胸腺培养系统，从诱导多能干细胞（iPSC）来源的不成熟T细胞生成具有功能性的抗原特异性T细胞的实验方案。将iPSC来源的不成熟T细胞与内源性淋巴细胞耗竭的小鼠胎儿胸腺叶共培养后，T细胞成功成熟，形成CD8αβ+ MHC...

用于生成诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

小鼠胚胎干细胞可通过 OP9-DL1 共培养系统在体外分化为 T 细胞。in vitro...

T细胞的制备 体外 从小鼠胚胎干细胞

研究髓质胸腺上皮细胞 体外 在很大程度上并不成功，因为现有的二维培养系统无法模拟 体内 该3D培养系统——一种改良的皮肤类器官培养模型——在模拟胸腺上皮细胞（mTEC）的增殖、分化以及异位基因表达的维持方面表现出更优效果。...

支持髓质胸腺上皮细胞增殖、分化及异位基因表达的三维类器官共培养模型

本方案介绍了一种进行定量、单细胞分析的方法 原位...

小鼠植入前胚胎谱系特化过程中蛋白质表达的定量分析

尽管浸润性巨噬细胞持续从循环前体细胞招募至成体组织，但组织驻留巨噬细胞在发育过程中定植于组织，并在无前体细胞进一步输入的情况下长期维持。近期，组织驻留巨噬细胞的前体细胞已被鉴定。本文介绍了对组织驻留巨噬细胞前体细胞进行遗传谱系示踪的方法。...

通过流式细胞术鉴定小鼠胚胎中的红髓系祖细胞及其子代

本文介绍了一种利用酶联免疫吸附试验（ELISA）在小鼠中表征T细胞依赖性和非T细胞依赖性免疫球蛋白（Ig）同种型应答的实验方案。该方法可单独使用，也可与流式细胞术联合应用，有助于研究人员鉴定小鼠在接受T细胞依赖性和非T细胞依赖性抗原免疫后，B细胞介导的Ig同种型应答的差异。...

利用酶联免疫吸附测定法表征小鼠胸腺依赖性和非胸腺依赖性免疫球蛋白同种型应答

本实验方案的目的是通过激光扫描显微镜对植入小鼠眼前房的胸腺组织中的胸腺细胞进行纵向活体实时追踪。由于角膜透明且移植物具有血管化特性，可连续记录前体细胞的招募过程以及成熟T细胞的迁出过程。...

实时 体内 通过激光扫描显微镜追踪眼前房中的胸腺细胞

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本文提供了一种从鹌鹑和鸡胚胎中分离纯胚胎组织的方法，这些组织可被组合以形成体外嵌合器官。...

以胸腺为例的胚胎组织分离及鹌鹑-鸡嵌合器官的构建

了解胸腺定居祖细胞表征方法，用于免疫学与发育生物学研究，采用小鼠胚胎体内外联合实验技术。该方法通过流式分选与肾包膜移植实现T细胞完整成熟，助力深入探索T细胞发育动态机制。

利用小鼠胚胎胸腺定植前体细胞的表征体内和体外检测方法

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