利用小鼠胚胎胸腺定植前体细胞的表征 体内 和 体外 检测方法

本实验的总体目标是分析E13或E18胸腺定植前体细胞所产生T细胞的表型动力学特征及其数量变化。首先从E13、E14和E18小鼠胚胎中分离胸腺叶；第二步，将E14胸腺叶进行辐照处理，随后用流式分选的E13或E18细胞在悬滴系统中接种48小时，以实现胸腺叶的重建。

在最后一步中，将定植的叶状组织移植到成年CD3基因敲除小鼠的肾包膜下。最终，可通过流式细胞术检测嵌合动物血液中E13和E18胸腺定植前体细胞的子代细胞的存在情况。与现有的体外T细胞培养于基质细胞上的方法相比，该技术的主要优势在于，它结合了三维实验体系中由明确前体细胞实现完整T细胞成熟的方法，并将胸腺器官样培养物移植至完整受体小鼠体内，从而能够评估胸腺切片前体细胞及其子代细胞的分化潜能与功能特性。

作为一名具有啮齿类动物外科手术专长的研究工程师，我将演示以下操作步骤：在层流罩内，于移植实验前两天，用70%乙醇擦拭一只怀孕雌性小鼠的腹部，并沿腹中线纵向切开皮肤，将皮肤向两侧拉开以暴露切口，然后使用镊子和剪刀切开腹膜，注意避免接触消化道。接下来，取出双角子宫，并用剪刀将其与阴道分离。随后，将子宫置于一个90 × 15毫米的培养皿中，培养皿内含有40至50毫升DPBS溶液，并在每个胚胎的蜕膜之间进行横向切割。

使用精细尖头剪刀和精细镊子，沿胎盘与卵黄囊之间的区域剪开子宫肌层膜，取出每个胚胎。随后去除羊膜，保留胚胎，并将胚胎置于一个新的含有HBSS加1%FCS的培养皿中。为分离胸腺，将胚胎逐一置于双目放大镜下，仰卧位放置。

然后沿胸骨软骨纵向插入一把镊子，使用弯头镊子夹住并撑开胸廓网格。将胸壁拉向一侧，以观察气管两侧的胸腺叶。接着用精细镊子夹住胸腺下方，小心摘除每一片胸腺叶，并将其置于含有1毫升HBSS加1% FCS的培养皿中。

接下来，使用两把精细镊子去除周围结缔组织，注意不要损伤小叶。然后将小叶在含有1% FCS的3毫升HBSS中洗涤，以去除红细胞，开始进行胎鼠胸腺器官培养照射。所用E14胸腺小叶如前所示，来自CD45.2胚胎。

让叶状组织静置约三小时。然后离心收集 freshly sorted E 13 或 E 18 胸腺定植前体细胞。将沉淀重悬于培养基中，最终浓度为每 35 微升培养基含 500 个细胞。

然后，在60孔Terasaki培养板的每隔一个孔中加入35微升细胞悬液，并将一个经辐照的叶组织置于每滴液体的表面。盖上培养板，将其倒置，使细胞在重力作用下沉降到液滴的顶端；轻轻敲击倒置培养板的上表面，促使组织叶滑移至液滴的顶端边缘。随后，将倒置的培养板置于含37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育48小时。

在胸腺叶被定植后，通过观察受体动物是否缺乏反射反应来确认其麻醉水平。然后在每只眼睛上涂抹一滴眼膏，并将小鼠置于层流罩下右侧卧位。接着剃除后肢关节上方的手术区域毛发。

接下来，戴上一副无菌手套，并用70%乙醇和10%碘伏溶液对手术区域进行消毒。使用手术刀穿过皮肤组织做一道1.5厘米的切口，随后切开肌肉组织。现在轻轻按压切口两侧，使肾脏从腹腔中部分挤出，并用生理盐水保持肾脏湿润。

用棉签将肾脏固定于腹膜后腔外，使用两把精细镊子在肾包膜上制造一个2至3毫米的孔。然后轻轻撑开包膜切口，将最多六个胸腺叶移植物缓慢滑入肾极边缘下方，随后将肾脏放回腹膜后腔。先缝合肌肉和筋膜，再用单独的外科结缝合皮肤。

然后用10%碘伏溶液润湿伤口，并将小鼠置于37°C的加热垫上，持续监测动物状态和手术伤口，直至其完全恢复，以确定耗竭内源性胸腺细胞、促进定植前体细胞发育的最佳方法。在本实验中，比较了经辐射处理或五天脱氧鸟苷处理后，定植胸腺叶中T细胞重建水平的差异。尽管在培养第9天时，两种处理组定植淋巴细胞的数量无明显差异，但在第12天，辐射处理组的胸腺叶中T细胞数量多于脱氧鸟苷处理组，因此辐射处理更有利于胸腺定植后T细胞的发育。为研究E13和E18期胸腺定植前体细胞的发育潜能，本实验采用E14期经辐射处理的胸腺叶，并接种等量的上述两种前体细胞。结果显示，E13期胸腺定植前体细胞产生的胸腺细胞和双阳性T细胞少于E18期胸腺定植前体细胞。

然而，成熟 CD3 阳性细胞的频率增加，并且仅在 E13 胸腺定植前体细胞的子代中检测到树突状上皮 T 细胞的产生，以分析 E13 和 E18 胸腺定植前体细胞的体内潜能。将分别定植了这两类前体细胞的胸腺叶移植至 CD3 基因敲除受体的肾包膜下。正如刚刚所展示的，结果符合预期：E13 胸腺定植前体细胞比 E18 前体细胞更快地产生 T 细胞，尽管总体而言，E13 胸腺定植前体细胞定植动物体内循环 T 细胞的数量显著较低。该技术建立后，为发育免疫学领域的研究人员探索某些严格起源于胚胎的 T 细胞亚群特性提供了途径，这些研究是在哺乳动物模型中进行的。

观看本视频后，您应能充分理解如何在自然环境乃至竞争性条件下，追溯 Timex 定植前体细胞及其子代细胞的分化与功能通路。