胸腺表征祖定居在小鼠胚胎使用在体内和在体外测定
2015年6月9日
本文描述了体内和体外方法，通过分析其 T 细胞后代的生成动力学、表型和数量来表征胸腺沉降祖细胞。
该程序的总体目标是分析 E 13 或 E 18 胸腺沉降祖细胞产生的 T 细胞的产生和数量的表型动力学。这是通过首先从 E 13、E 14 和 E 18 小鼠胚胎中分离胸腺叶来实现的。在第二步中，照射 E 14 胸腺叶，然后用流式分选的 E 13 或 E 18 细胞在悬滴中定植 48 小时。
在最后一步中，将定植的叶移植到成年 CD 三基因敲除小鼠的肾包膜下。最终，流式细胞术可用于评估嵌合动物血液中是否存在 E 13 和 E 18 胸腺沉降祖细胞后代。我们现有方法的这种技术的主要优势，如在 ine so 细胞上进行体外 T 细胞培养，是该技术结合了允许在三维测定中从确定的祖细胞完全成熟的 T 细胞的方法与在完整受体小鼠中嫁接胸腺器官器官培养物的方法，允许评估胸腺切片祖细胞和后代的分化和功能。
作为一名具有啮齿动物外科专业知识的研究工程师，我将在层流罩中演示移植实验前两天，用 70% 乙醇在怀孕雌性小鼠的腹部用 70% 乙醇在皮肤中线做一个纵向切口，拉开皮肤打开切口，然后用镊子和剪刀打开腹膜，不接触消化道。接下来，拉出双裂子宫，用剪刀将其与阴道分开。然后将子宫放入含有 40 至 50 毫升 DPBS 的 90 x 15 毫米培养皿中，并在每个胚胎的蜕膜之间横向切割。
用一把细尖剪刀和细镊子去除子宫的肌肉膜，在胎盘和卵黄囊之间切割，取出每个胚胎。然后取出保留胚胎的羊膜，并将胚胎放入含有 HBSS 和 1%FCS 的新培养皿中。为了分离胸腺，一次将一个胚胎放在双目放大镜下的仰卧位。
然后沿胸骨软骨纵向插入一把镊子，用弯曲的镊子捏住并打开胸腔网格。将胸壁拉到一边，以观察气管两侧的胸腺叶。然后用细镊子捏住胸腺下方，小心地去除每个叶，并将它们放入含有 1 毫升 HBSS 和 1%FCS 的培养皿中。
接下来，使用两个细镊子去除周围的结缔组织，而不会损坏叶。然后在 3 毫升 HBSS 加 1% FCS 中洗涤肺叶以消除红细胞，开始对胎儿胸腺器官进行照射。E 从 CD 45.2 胚胎中分离的 E 14 个胸腺叶，如刚刚所示。
让耳垂静置约三个小时。然后旋转新鲜分选的 E 13 或 E 18 胸腺沉降祖细胞。将沉淀重悬于培养基中，至终浓度为每 35 μL 培养基 500 个细胞。
然后将 35 微升细胞悬液滴入 60 孔 Terasaki 板的每隔孔中，并在每滴表面放置一个辐照叶。关闭板并将其倒置，让细胞在重力作用下到达液滴的顶端极，轻轻撞击倒置板的上侧，迫使裂片滑到液滴的顶端边缘。然后将倒置板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育 48 小时。
胸腺叶定植后，通过缺乏反射反应来验证受体动物的麻醉水平。然后在每只眼睛上滴一滴眼膏，并将鼠标放在层流罩下的右侧。然后剃掉后腿关节正上方的手术区域。
接下来，戴上一副无菌手套，用 70% 乙醇和 10% IOD DY DER 溶液对手术区域进行消毒。用手术刀在皮肤组织上切开 1.5 厘米，然后在肌肉组织中切开。现在对切口的两侧施加轻微的压力，将肾脏挤出腹腔，并用生理盐水保持肾脏湿润。
在腹膜后腔外用棉签维持肾脏，并用两把细镊子在胶囊上打一个 2 到 3 毫米的孔。然后，保持胶囊壁打开，小心地将六个胸腺叶移植物滑到肾极边缘下方，并将肾脏放回腹膜后腔中。缝合神经症肌肉，然后用单独的外科医生打结缝合皮肤。
然后用 10% 碘化物聚维酮溶液润湿伤口，将小鼠放在 37 摄氏度的加热垫上，监测动物和手术伤口，直到它们都完全恢复，以确定消耗内源性胸腺细胞以培养定植祖细胞的最佳方法。在本实验中，比较了放疗或 5 天脱氧 guine 治疗后定植胸腺叶中 T 细胞重建的水平。虽然在培养第 9 天定植淋巴细胞的数量没有明显差异，但照射的叶比第 12 天用脱氧 guine 处理的叶含有更多的 T 细胞，这使得照射成为促进胸腺定植后 T 细胞发育的首选治疗方法，以研究 E 13 和 E 18 胸腺沉降祖细胞的发育潜力这里， 如观察所示，E 14 辐照的胸腺叶被相同数量的两种祖细胞定植，E 13 胸腺沉降祖细胞产生的胸腺细胞和双阳性 T 细胞比 E 18 胸腺沉降祖细胞少。
然而，成熟 CD 3 阳性细胞的频率增加，并且仅在 E 13 胸腺沉降祖细胞的后代中检测到树突状上皮 T 细胞的产生 分析 E 13 和 E 18 胸腺沉输祖细胞的体内潜力 用每种类型的祖细胞定植的胸腺叶被移植到 CD 3 敲除受体的肾包膜下。正如刚才所展示的那样。E 13 胸腺沉降祖细胞比 E 18 祖细胞更快地产生 T 细胞，尽管 E 13 胸腺沉降祖细胞定植动物中循环 T 细胞的数量明显较低，但在其发展之后，这项技术为发育免疫学领域的研究人员探索 T 细胞亚群的特性铺平了道路， 其中一些是哺乳动物模型中的严格胚胎起源。
看完这个视频，你应该对如何在自然环境和竞争条件下追踪 Timex 定居祖细胞及其后代的差异和功能途径有一个很好的了解。
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概述
本文描述了通过体内和体外技术分析胸腺定居祖细胞及其T细胞后代的方法。研究重点是这些祖细胞产生的T细胞的动力学、表型和数量。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 胸腺定居祖细胞在T细胞发育中起着关键作用。
- 了解它们的动力学和分化对免疫学研究至关重要。
- 该研究利用小鼠胚胎来探索这些祖细胞。
- 现有的方法通常无法完全成熟来自已定义祖细胞的T细胞。
研究目的
- 表征胸腺定居祖细胞。
- 分析它们的T细胞后代的产生和表型。
- 改进现有的体外T细胞培养方法。
使用的方法
- 从E 13、E 14和E 18小鼠胚胎中分离胸腺叶。
- 对E 14胸腺叶进行辐射，然后用流式分选的E 13或E 18细胞进行定植。
- 将定植的叶片移植到成年CD三敲除小鼠的肾包膜下。
- 使用流式细胞术评估嵌合动物血液中T细胞后代的存在。
主要结果
- 该方法允许来自已定义祖细胞的完整T细胞成熟。
- 成功评估了胸腺祖细胞的分化和功能。
- 在嵌合小鼠中证明了E 13和E 18后代的存在。
- 增强了对T细胞发育动力学的理解。
结论
- 该技术提供了研究T细胞成熟的新方法。
- 它将体外和体内方法结合起来，进行全面分析。
- 研究结果有助于理解胸腺祖细胞的生物学。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding thymic progenitor kinetics enables predictive modeling of T-cell reconstitution in lymphopenic settings, informing cell therapy design. The method bridges in vitro progenitor assessment with in vivo functional validation, reducing mechanistic ambiguity in early immunotherapeutic target validation. This supports de-risking of hematopoietic stem cell and progenitor-based strategies by clarifying developmental timelines and subset-specific output.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of progenitor-intrinsic differentiation potential by isolating E13 and E18 thymic settling progenitors to assess autonomous T-cell lineage commitment.
- Operational Value: Uses CD45 allotypic markers to distinguish progenitor inputs without genetic manipulation, preserving native phenotype for accurate functional comparison.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: The hanging drop colonization assay provides a standardized, reproducible 3D microenvironment to quantify progenitor engraftment and early thymic seeding efficiency.
- Operational Value: Allows side-by-side comparison of progenitor batches under identical stromal conditions, minimizing niche variability and improving assay consistency across runs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables longitudinal tracking of mature T-cell output in vivo via grafting into immunodeficient hosts, revealing delayed but expanded E18-derived peripheral T-cell reconstitution not seen in short-term cultures.
- Operational Value: Supports assessment of durable immune reconstitution, a key predictor for long-term efficacy in T-cell replacement therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This method situates progenitor characterization between early discovery (phenotypic screening) and preclinical validation, linking in vitro colony-forming potential to in vivo immune reconstitution metrics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing progenitor subsets for intrinsic differentiation kinetics and subset bias, such as dendritic epithelial T-cell generation.
- Screening: Delivers quantitative engraftment and early colonization metrics under controlled stromal conditions, enabling progenitor batch comparability.
- Analytics: Employs flow cytometry to measure progeny phenotype, frequency, and temporal dynamics in blood and grafts, providing multiparametric readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Connects progenitor input to functional T-cell output in vivo, enabling prediction of peripheral immune reconstitution kinetics and tissue colonization potential.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating hematopoietic or lymphoid progenitors across disease models, provided thymic stromal support and immunocompromised recipients are available.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking progenitor phenotype to defined T-cell outputs, including subset-specific maturation like dendritic epithelial T cells.
- Operational Value: Standardizes progenitor assessment via irradiation-conditioned thymic lobes and hanging drop colonization, improving inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions in progenitor-based therapies by predicting both speed and magnitude of T-cell reconstitution.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of progenitor sources based on developmental tempo and long-term output potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryo dissection, thymic lobe isolation, and sterile surgical grafting under kidney capsule.
- Dependent on access to irradiated fetal thymic lobes, flow cytometry for progenitor sorting, and immunocompromised recipient strains (e.g., CD3−/−).
- Necessitates standardized hanging drop incubation conditions (37°C, 5% CO2, 48h) to ensure consistent progenitor-thymic lobe interaction.
- Requires validation of graft survival and lymphocyte egress to accurately assess peripheral T-cell reconstitution over time.
- Limited to murine systems; extrapolation to human progenitors requires cross-species thymic stromal compatibility testing.
