用于评估人工前交叉韧带移植物的无胸腺大鼠模型

以下实验方案的总体目标是利用啮齿类动物模型评估用于前交叉韧带替代的组织工程移植物。该目标通过两个步骤实现：首先制备一种可生物降解的聚合物支架；第二步，将该支架植入大鼠膝关节内。

16 周后，从支架中形成的新生韧带被取出用于组织学分析。最终，通过检测胶原的生物力学强度，以评估这些组织工程移植物在前交叉韧带重建中应用的质量。与其它支架评估方法相比，该技术的主要优势在于，该模型使支架暴露于复杂的体内环境，同时相比大型动物模型更具成本效益且更易于操作。

该模型有助于回答组织工程领域的一些关键问题，例如，人工构建的支架将如何与体内环境整合以形成新生韧带？该技术可为前交叉韧带（ACL）重建提供新的治疗策略。由于小型动物模型是临床转化的第一步，因此该方法可用于评估我们特定的支架材料。

该方法也可应用于其他组织工程支架，例如含有细胞和生长因子的支架。我们通过改进纽约特殊外科医院 Scott Rodeo 博士及其同事所采用的方法，对手术技术进行了优化。由于电纺丝和手术操作步骤仅通过书面说明难以掌握，因此对该方法的可视化演示至关重要。

在进行聚己内酯支架的静电纺丝时，需要一个带有聚己内酯溶液入口的大丙烯酸箱、一个由电机驱动的收集转轴，以及一个置于化学通风橱内并由电压源供电的真空口，以作为静电纺丝过程的隔离真空环境。在开始操作前，需用70%乙醇彻底清洁箱子，并用Parafilm膜覆盖所有表面，以去除可能影响电纺产品质量的杂质。

然后打开风扇，将3毫升新配制的聚己内酯聚合物装入带有18号钝端针头的10毫升注射器中。排除所有气泡后，将该溶液固定在可编程注射泵上，并将针头通过入口插入亚克力箱内，针头约有半英寸留在箱外。接下来，用一条薄铝箔紧密包裹旋转车床芯轴，并将芯轴固定在箱体另一侧的电机上，使其距离注射器针头约15厘米，作为收集器；再将塑料软管插入真空口。

然后将软管连接到通风橱的真空源并打开。现在用盖子盖住亚克力箱，并将可编程注射泵的输注速率设置为 2.5 毫升每小时。接着将负极导线接地，启动电机使心轴以 3,450 转每分钟运转，并使用鳄鱼夹将电压源的正极导线连接到箱外的针尖处。

开始注入聚己内酯溶液后，启动电压源并将其设置为20千伏的工作电压。注入12分钟后，0.5毫升聚己内酯溶液将形成均匀的套管。关闭所有设备，包括电压源、电源、电机、真空泵和注射泵。

从电机上取下心轴，将聚合物套管从心轴上取下，进行一次横向切割，得到矩形的电纺膜。然后用激光切割该膜以形成多个小片，再将这些小片裁切成条状，每四层叠在一起，缝合形成支架，然后开始手术。首先，通过施加后肢足部压力无反应来确认麻醉效果充分。

然后，在膝关节内侧、髌骨水平处做一条长两厘米的纵向切口，必要时将皮肤向外侧牵开。接着，使用手术刀在髌骨内侧做内侧髌旁关节囊切开术，切口向上延伸至股四头肌肌腱连接处，向下延伸至髌腱在胫骨结节的附着点。现在，在髌腱外侧的膝关节囊处做一条长一厘米的纵向切口，以将髌骨向外侧松解。

然后确保膝关节处于伸展状态，将一把精细剪刀从髌骨外侧向内侧下方穿过，并开合剪刀数次，以便在屈曲膝关节时可将伸展机制向两侧移动。将髌骨向外侧移位，以暴露膝关节内部，确认可清晰看到髁间窝和股骨髁。随后在髁间窝处横断前交叉韧带和后交叉韧带。

现在将连接在电钻上的1.6毫米克氏针尖端置于股骨髁间窝的前交叉韧带（ACL）起点处，在助手稳定膝关节的同时，向上外侧钻入。然后将克氏针来回穿入穿出数次，以确保移植物通道通畅。观察克氏针在股骨外侧的穿出点，必要时使用手术刀清除任何阻碍的软组织。

当骨隧道通畅后，将克氏针置于胫骨平台胫骨髁间隆起处的前交叉韧带（ACL）止点位置，并在助手稳定膝关节的同时向侧方钻入。随后使用手术刀必要时清除前外侧近端胫骨表面的软组织，以充分暴露克氏针穿出胫骨的位置。接着，将一根长度不超过两英寸的短型Keith针穿过股骨骨隧道。然后将移植物一端的两根缝线穿入缝合针的针眼，利用该针将移植物的一端拉过股骨隧道。

然后使用缝合针，借助4-0 Vicryl缝线，将移植物的另一端穿过胫骨隧道。接下来，将移植物的股骨端以“8”字缝合法固定于周围软组织，同时保持膝关节伸直，以在移植物上施加手动张力。再用另一个“8”字缝合法将移植物的胫骨端固定于周围软组织，用剪刀剪去两端多余的移植物，每端保留1至2毫米超出缝线部分。

最后伸直膝关节并复位髌骨。使用4-0薇乔缝线，以单个8字缝合关闭内侧关节囊，防止髌骨外侧半脱位，然后用连续皮下缝合的5-0单乔或薇乔缝线关闭皮肤。重建术后16周，对膝关节切片进行组织学分析显示，支架基质已大量被成纤维细胞浸润，并分泌嗜酸性胶原，与骨隧道整合良好。

在本实验中，动物处死后立即评估关节的生物力学特性。所有测试样本均在拉伸试验产生的低位移曲线条件下发生中部实质断裂。针对每组样本计算了断裂载荷和刚度。

植入后16周，电纺聚合物移植物的峰值载荷和刚度较植入后立即测试时大约增加了一倍。尽管这些数值仍低于正常的前交叉韧带。一旦掌握该动物手术技术，手术可在约15分钟内完成。在实施该操作时，重要的是要注意进行良好的关闭缝合，确保从外部看不到任何缝线。

完成此操作后，可进行其他终点分析，例如额外染色和生化检测。该技术为组织工程领域的研究人员评估多种前交叉韧带重建移植物方案奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备用于前交叉韧带重建大鼠模型植入的聚合物支架。

请注意，操作活体动物可能存在风险，在进行本实验时，应始终遵守兽医建议并佩戴个人防护装备等预防措施。