Name: 无胸腺大鼠模型工程前交叉韧带移植评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习利用大鼠模型评估组织工程移植物用于前交叉韧带重建的方法。本方案涵盖可降解聚合物支架的制备、植入及16周后的组织学与生物力学分析，为ACL修复研究提供经济高效的体内评估平台。

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作者感谢 Gabriel Arom 和 Michael Yeranosian 在本项目早期版本中提供的技术贡献。本项目由 OREF 临床科学家培训基金（NL）、H H Lee 外科研究基金（NL）、退伍军人事务部 BLR&amp;#38;D 优秀研究奖 1 I01 BX00012601（DM）以及肌肉骨骼移植基金会青年研究者奖（FP）资助。

注意：所有动物手术在实验开始前均已获得当地兽医人员和动物使用委员会的批准。
1. 静电纺丝聚己内酯支架的制备
<ol>
	<li>称取医用级酯封端聚（ε-己内酯）颗粒，并溶于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中，配制质量分数为10%的PCL聚合物溶液。将溶液置于搅拌器上搅拌至少3小时，以确保形成均一溶液。</li>
	<li>使用电纺丝技术将PCL溶液制备成高度取向的PCL纤维套管，用于支架的构建。
	<ol>
		<li>在开启风机的化学通风橱中准备静电纺丝装置。该装置由一个大型丙烯酸盒构成，作为静电纺丝过程的隔离真空环境，盒体设有入口，用于引入由电压源驱动的PCL溶液、电机驱动的收集转轴以及真空接口。用乙醇彻底清洁丙烯酸盒，并用Parafilm膜覆盖所有表面，以去除可能影响静电纺丝产物质量的杂质。</li>
		<li>将约3 ml上述溶液装入带有钝头18 G、1½英寸针头的10 ml注射器中。通过推动注射器排出所有气泡。将注射器固定在可编程注射泵中。将针头穿过亚克力箱上的小孔插入，针头末端约½英寸留在亚克力箱外，用于连接电压源导线。</li>
		<li>使用30 mm的旋转车床芯轴作为高度取向PCL纤维的收集器；用一条薄铝箔紧密包裹芯轴。将芯轴固定在盒子另一侧距注射器针头约15 cm处的电机上。</li>
		<li>将塑料软管插入真空接口，并连接至通风橱的真空源。打开真空源，用盖子盖住亚克力盒。</li>
		<li>将可编程注射泵的输注速率设置为 2.5 ml/hr。启动电机，使心轴以 3,450 rpm 运转，并使用鳄鱼夹将电压源的正极引线连接到箱体外的针尖处。</li>
		<li>一旦开始注入PCL溶液，立即打开电压源并将工作电压设为20 kV。</li>
		<li>注入溶液12分钟，使用0.5 ml的PCL溶液形成均匀的套管。 
		注意：平均每根套管所含的静电纺丝材料足以制成两张六条形片材，可共制备三块四层支架。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 VersaLaser Cutter 2.3 在低真空条件下，以 10.0 keV 的着陆电压、6.4 mm 的工作距离和 3.0 的探针直径，将 PCL 套管进行激光切割，形成多个小片。 
	注意：本示例中，采用计算机辅助设计指导切割，制备出多片尺寸为1.5 mm × 35 mm × 150 µm的支架，孔径为150 µm，孔面积占比15%，且孔分布均匀。</li>
	<li>使用等离子清洗仪对PCL支架进行等离子体刻蚀，通过离子加速诱导PCL表面产生亲水性。设置真空度为450 mTorr，在高功率（29.6 W）条件下处理支架30秒。</li>
	<li>在无菌环境中，将支架浸入70%乙醇中。</li>
	<li>用胶原蛋白包被各个支架，以促进细胞黏附和增殖 体内.
	<ol>
		<li>通过将8:1:2.5的无菌混合液（含Purecol胶原蛋白3 mg/ml标准溶液、10×PBS和0.1 N NaOH）按1:9比例用1×PBS在4 °C条件下稀释，制备胶原蛋白包被溶液。充分混匀以确保溶液均匀。</li>
		<li>将上述胶原溶液以薄层包被于单个1.5 mm × 35 mm × 150 µm的支架上，在无菌环境中干燥24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用5-0 Vicryl缝线，采用Krackow缝合法将四个1.5 mm × 35 mm × 150 µm的支架堆叠并固定，制备出厚度为0.6 mm的多层胶原涂层支架，即可用于植入。</li>
</ol>
2. 大鼠手术方案
<ol>
	<li>将大鼠放入吸入式麻醉室，以每分钟2升的氧气流速输送2%异氟烷进行麻醉。通过按压后肢足部并观察是否有反应，确认大鼠已充分麻醉。</li>
	<li>在非无菌操作台处，皮下注射25 mg/kg氨苄西林和0.03 mg/kg布托啡诺。</li>
	<li>在眼睛上涂抹眼用软膏。剪除手术侧后肢的毛发，并使用氯己定和70%乙醇交替擦拭三次，对术区进行消毒处理。</li>
	<li>将大鼠转移至手术台，置于加热垫上以防止低体温。固定鼻罩，并通过鼻罩持续以每分钟2升氧气流速输送2%异氟烷维持麻醉。以无菌方式覆盖手术巾，仅暴露手术肢体。&#160;</li>
	<li>开始手术前，先通过按压后肢足部无反应来确认麻醉深度足够。</li>
	<li>在膝关节内侧做一条长约2 cm的纵向切口，切口中心位于髌骨水平。将皮肤向侧方牵开，使切口正对膝关节中心。</li>
	<li>使用手术刀在髌骨内侧稍偏处做内侧髌旁关节囊切开术，切口向上延伸至股四头肌肌腱连接处，向下延伸至髌腱在胫骨结节的附着点。注意避免损伤髌腱或股四头肌腱。</li>
	<li>在髌腱外侧稍偏处沿关节囊做一条长约1 cm的纵向切口，将髌骨向侧方松解。</li>
	<li>确保膝关节处于伸展位。使用精细剪刀从外侧向内侧穿过髌骨下方，反复张开剪刀数次，使伸肌装置可向两侧移动。</li>
	<li>屈曲膝关节的同时将髌骨向外侧移位，以暴露膝关节内部。确保清楚显露股骨髁间窝及股骨髁。使用手术刀在髁间窝处横断前交叉韧带（ACL）和后交叉韧带（PCL）。</li>
	<li>将直径1.6 mm的克氏针装入电动钻。将克氏针尖端置于髁间窝内的ACL起点处，向股骨上外侧方向钻孔，并观察其在股骨外侧的出针点，必要时用手术刀清除软组织。反复进出克氏针数次，确保移植物通道通畅。</li>
	<li>将克氏针置于胫骨平台上的ACL止点处，向胫骨前外侧近端方向钻孔，并观察其在胫骨前外侧近端的出针点。必要时使用手术刀清除软组织，确保克氏针穿出胫骨的位置完全可视。</li>
	<li>将短型Keith针（理想长度不超过2英寸）穿过股骨骨隧道。将移植物一端的两根缝线穿入Keith针的针眼内，利用该针将移植物一端拉过股骨隧道。</li>
	<li>重复上一步操作，将移植物另一端穿过胫骨隧道。</li>
	<li>使用4-0 Vicryl缝线，以“8”字缝合法将移植物的股骨端固定于周围骨膜或其他软组织上。在膝关节伸直位手动张紧移植物，再以“8”字缝合法将移植物的胫骨端固定于周围骨膜或其他软组织上。</li>
	<li>使用剪刀剪除两端多余的移植物组织，每端保留1–2 mm超出“8”字缝合线的部分。</li>
	<li>伸直膝关节并复位髌骨。使用4-0 Vicryl缝线做单个“8”字缝合，关闭内侧关节囊，防止髌骨向外侧半脱位。</li>
	<li>使用连续皮内缝合的5-0 Monocryl或Vicryl缝线关闭皮肤，注意避免缝合到深层肌肉组织，且皮肤闭合后不应看到外露缝线。</li>
	<li>术后每12小时皮下注射一次布托啡诺，共持续三天。每次注射时检查手术部位是否有渗出或伤口裂开。术后最初几天出现跛行和轻度肿胀属正常现象，但任何术后异常应及时与兽医人员共同处理。&#160;动物可在术后2周恢复群养，此时手术切口应已完全愈合。</li>
</ol>
3. 数据采集方案
<ol>
	<li>处死时，将大鼠单独置于密闭的 CO2 室内窒息，随后进行开胸手术。</li>
	<li>通过髋关节分离，采集手术重建侧和对侧肢体。
	<ol>
		<li>对于重建侧肢体，通过精细解剖去除所有软组织，包括后交叉韧带以及手术破坏后残留的天然前交叉韧带（ACL），仅保留股骨、胫骨和移植物。</li>
		<li>对于对侧肢体，通过精细解剖去除所有软组织，仅保留天然 ACL 以及股骨和胫骨。</li>
		<li>使用旋转工具（如 Dremel）从股骨-移植物-胫骨复合体的每一端去除骨组织，仅保留近端 ¾ 至 1 cm 的骨段。</li>
		<li>在此过程中及整个生物力学测试期间，应定期并频繁地用生理盐水喷洒韧带区域，以防止采集的膝关节组织干燥，避免因脱水导致测试结果出现假性改变。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于组织学分析时，将每个膝关节单独置于 4% 多聚甲醛溶液中，在 25 °C 下固定 48 小时。随后将膝关节浸入 Immunocal 脱钙液中，以完成彻底脱钙；该过程取决于样本的钙化程度，可能需要长达五天。每日检查各样本以评估脱钙进展，因脱钙不完全会降低样本质量。脱钙完成后，按需进行切片、贴片和染色。</li>
	<li>进行生物力学测试，以评估组织工程韧带的功能能力。
	<ol>
		<li>分别用 28 G&#160;镀锌钢丝缠绕每根骨的骨骺，以固定股骨和胫骨。此操作旨在防止样本在骨端而非目标韧带处发生过早拉伸断裂，从而避免生物力学测试数据失真。</li>
		<li>将股骨嵌入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥混合物中。具体操作为：混合骨水泥的两种组分后，立即使用其黏稠状态将股骨固定于金属夹具中，使骨的骨干完全被骨水泥包裹，而骨骺及其附着的韧带自由伸出。让其通过自发的自由基聚合反应逐步由黏稠状态转变为面团状，最终形成固化的坚硬基质。 
		注：该过程需数分钟，可通过手动触摸由剩余水泥制成的小团块来监测；在放热聚合反应期间温度会短暂升高，材料固化后温度将回落至室温。</li>
		<li>对胫骨进行相同的水泥包埋操作，但在操作过程中需保持膝关节韧带处于 20° 屈曲状态，以满足理想的力学测试条件。</li>
		<li>将包埋好的股骨-移植物-胫骨复合体安装至拉伸测试装置上，并准备记录从开始施加拉力直至样本断裂期间的载荷与位移随时间的变化。本示例中使用的是配备 1 kN 载荷传感器的 Instron Model 5564 测试仪。</li>
		<li>以 0.5 N/min 的加载速率对移植物预加载至 2 N，随后以 0.5 mm/sec 的应变速率进行至断裂测试。测试过程中需确保韧带在实质中部发生断裂，且股骨和胫骨固定牢固，未发生过早断裂，以免对被测韧带的生物力学特性产生不准确评估。</li>
		<li>利用所得的载荷-位移曲线计算被测韧带的断裂载荷和刚度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

前交叉韧带损伤是骨科运动医学手术中常见的一种病症，目前可用于重建的治疗选择有限。为了开发一种合适的组织工程前交叉韧带替代物以促进韧带再生 体内，需要一个合适的动物模型。本研究描述了一种可生物降解的工程化移植物的制备方法及其 体内 使用无胸腺大鼠中可重复的前交叉韧带重建模型进行移植。该模型可用于评估由不同生物材料构成的组织工程前交叉韧带移植物，包括细胞移植物以及含有生长因子的移植物。
在本项研究中，我们测试了一种具有定向排列纤维的无细胞静电纺聚己内酯移植物。既往关于组织工程韧带重建的研究已植入过编织型或挤出型移植物，所用材料包括丝素蛋白、聚左旋乳酸（PLLA）和聚氨酯等多种物质。27-29这些材料均未能同时实现移植物的成功整合以及前交叉韧带力学性能的再现7尽管许多聚合物具有用于韧带重建的潜力，但本研究选择了聚己内酯（PCL），因其具有生物惰性、无毒且降解缓慢的特性 体内，并可轻松制造成所需的构型30PCL 还具有优异的机械强度，在机械应力下表现出很小的塑性变形<su...

前交叉韧带（ACL）断裂是膝关节最常见的韧带损伤之一1。由于断裂的前交叉韧带无法在无手术干预的情况下自行愈合，患者在日常生活活动及体育运动方面的受限情况促使每年超过17.5万名患者接受手术治疗2，每年的医疗费用估计高达10亿美元3。目前，前交叉韧带重建手术通常采用自体肌腱或异体肌腱移植。尽管自体和异体移植均可取得较高的成功率，但这些重建方式均存在严重的并发症风险4。自体移植物存在供区并发症问题，且来源有限，尤其在再断裂或多韧带损伤的情况下更为明显。另一方面，异体移植物则与移植物整合延迟、不良炎症反应、理论上的感染风险以及供体组织来源有限等问题相关5。非降解性合成移植物于20世纪70年代和80年代被开发出来，但因早期移植物断裂、异物反应、骨溶解和滑膜炎等问题而受到限制6。由于上述严重问题，目前在美国尚无任何合成移植物可用于临床。
由于现有移植物选择存在上述局限性，以及生物学、工程学和再生医学领域的最新进展，人们对韧带组织工程解决方案在前交叉韧带（ACL）移植中的应用产生了极大兴趣。目前的组织工程技术采用可降解的生物材料和合成材料，以促进宿主组织长入，同时避免永久性合成材料植入所带来的局限性7。
聚己内酯（PCL）是一种可生物降解的聚合物，已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于多种医学用途，包括防粘连屏障和伤口敷料8，已广泛应用于血管、骨、软骨、神经、皮肤和食管组织工程等多种领域5,9-16良好的生物相容性，相对较长 体内 半衰期适中、具有足够的机械强度以及高弹性，使该聚合物在组织工程中广受欢迎。在啮齿类动物伤口愈合模型中，植入的静电纺丝PCL被证实无免疫原性，且能整合入局部组织而无不良反应。13电纺PCL的SEM图像如图所示 图1.
根据当前美国食品药品监督管理局（FDA）的监管标准，聚己内酯（PCL）或任何其他经工程化构建的前交叉韧带（ACL）移植物若要进入美国的临床试验，必须先在小型和大型动物模型中验证其有效性和安全性。此外，体内（in vivo）环境通常能够增强体外（in vitro）组织工程ACL移植物的性能。已有研究报道了一种使用自体趾长屈肌腱进行ACL重建的大鼠模型，该模型中，天然ACL被切断，钻通股骨和胫骨隧道，并通过缝线将移植物穿入并固定到位17-22。本文将描述对该模型的一种改进，用于评估工程化ACL替代物，而非基于自体移植物的重建方法（图2）。
尽管韧带组织工程已有多种动物模型，但与较大的动物模型相比，大鼠具有多项优势。这些优势包括更易于饲养和操作、伦理问题较少以及成本较低17,23。此外，大鼠模型已被广泛用于骨科组织再生研究，包括软骨、肌腱和骨组织工程24。特别是选择无胸腺裸鼠，因其缺乏细胞介导的免疫反应25，使得该模型未来有望植入异种供体细胞，以进一步增强组织工程移植物的效果。在本方法学论文中，我们描述了在无胸腺大鼠前交叉韧带重建模型中，无细胞可生物降解聚合物移植物的制备及外科植入过程。

<table><tbody><tr><td>医用级酯端聚（&amp;epsilon;-己内酯），颗粒状（分子量 = 110,000）</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel 可吸收聚合物</a></td><td></td><td>根据所需分子量定制合成的聚合物</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>105228</td><td>PCL 聚合物的溶剂</td></tr><tr><td>18 G × 1&amp;#189;" 斜角针头</td><td>BD Medical</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>远程灌注/抽取可编程注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702101</td><td></td></tr><tr><td>VersaLaser VLS2.30 激光雕刻机</td><td>Microgeo USA</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>扩展型等离子清洗机 115&amp;nbsp;V</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>胶原蛋白包被前进行等离子刻蚀以实现表面改性</td></tr><tr><td>PureCol 胶原标准溶液，3&amp;nbsp;mg/ml</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5015-A</td><td>按 8:1:2.5 比例混合 PureCol、10× PBS 和 0.1&amp;nbsp;N NaOH，再以 1× PBS 稀释至 1:9</td></tr><tr><td>缝线，5-0 Vicryl</td><td>Henry Schein</td><td>1086471</td><td></td></tr><tr><td>缝线，4-0 Vicryl</td><td>Henry Schein</td><td>6540072</td><td></td></tr><tr><td>尖头解剖剪刀（直型；4.5&amp;nbsp;英寸）</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>盐酸布诺啡</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9275</td><td>术中及术后镇痛使用剂量为 0.03 mg/kg</td></tr><tr><td>氨苄西林，注射用</td><td>Henry Schein</td><td>1185678</td><td>术中皮下注射 25 mg/kg</td></tr><tr><td>K 型钢针，1.6 mm</td><td>Spectrum Surgical</td><td>SI040062</td><td></td></tr><tr><td>Keith 针，直型 1&amp;#189;"</td><td>Delasco Dermatology Lab &amp;amp; Supply</td><td>KE-112</td><td></td></tr><tr><td>Immunocal 脱钙溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9491030</td><td></td></tr><tr><td>Opticryl 丙烯酸树脂骨水泥（PMMA）（单体与聚合物）</td><td>US Dental Depot</td><td>OPTICRYL 100410&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instron Model 5564 万能材料试验机</td><td>Instron</td><td>5564</td><td>任何性能相当的拉伸测试装置均可使用</td></tr></tbody></table>

用于评估人工前交叉韧带移植物的无胸腺大鼠模型

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

前交叉韧带（ACL）断裂是一种常见的韧带损伤，由于ACL在无干预情况下愈合能力差，常需手术治疗。目前的治疗策略包括使用自体移植物或同种异体移植物进行韧带重建，但两者均存在相应的局限性。因此，人们越来越关注设计一种可用于ACL重建的组织工程移植物。本文描述了一种用于ACL组织工程的静电纺丝聚合物移植物的制备方法。该聚己内酯移植物具有生物相容性、可生物降解性、多孔性，并由取向排列的纤维组成。由于评估此类移植物需要动物模型，本文介绍了一种用于ACL重建的关节内裸鼠模型，可用于评估组织工程移植物，包括接种异种细胞的移植物。文中展示了术后16周的代表性组织学和生物力学测试结果，以植入后立即检测的移植物和对侧天然ACL作为对照。本研究提供了一种可重复的动物模型，用于评估组织工程ACL移植物，并展示了再生医学方法在治疗ACL断裂中的潜力。

根据单名外科医生完成的92例大鼠手术经验，从切开到伤口缝合完成的平均手术时间为16.9分钟，标准差为4.7分钟。处死时，大鼠体重为356 ± 23 g。所有大鼠均耐受手术良好，未出现任何并发症。术后即刻观察到大鼠可在手术侧肢体负重，但表现出轻微跛行。术后一周时，所有大鼠均已恢复正常行走，无明显跛行。在研究期间，所有动物体重稳步增加，摄食、排尿和排便习惯均未见异常。临床观察显示，术后未出现明显的伤口裂开、红斑、肿胀、积液或引流现象。
上述92例大鼠手术并非主要为本方法学论文的目的而进行，而是用于测试各种工程化移植物条件。尽管详细的力学测试和组织学结果不在本文讨论范围内，但更多细节可参见Leong et al.26发表的论文。简而言之，在重建术后16周，对膝关节切片进行组织学分析显示，支架基质已大量被分泌嗜酸性胶原的成纤维细胞浸润，并与骨隧道实现了良好整合（图3）。此时，支架已完全被吸收，未观察到任何聚合物残留。此外，术后16周的CD68巨噬细胞标志物免疫组织化学染色显示炎症反应极轻微（图4</s...

动物模型是评估组织工程移植物的重要工具。本文介绍了制备用于前交叉韧带组织工程的静电纺可生物降解聚合物移植物的实验方案，以及在大鼠模型中进行移植手术的操作流程。

前交叉韧带（ACL）断裂是一种常见的韧带损伤，通常需要手术治疗，因为前交叉韧带在没有手术干预的情况下自我愈合能力较差……

以下实验方案的总体目标是利用啮齿类动物模型评估用于前交叉韧带替代的组织工程移植物。该目标通过两个步骤实现：首先制备一种可生物降解的聚合物支架；第二步，将该支架植入大鼠膝关节内。16 周后，从支架中形成的新生韧带被取出用于组织学分析。最终，通过检测胶原的生物力学强度，以评估这些组织工程移植物在前交叉韧带重建中应用的质量。与其它支架评估方法相比，该技术的主要优势在于，该模型使支架暴露于复杂的体内环境，同时相比大型动物模型更具成本效益且更易于操作。该模型有助于回答组织工程领域的一些关键问题，例如，人工构建的支架将如何与体内环境整合以形成新生韧带？该技术可为前交叉韧带（ACL）重建提供新的治疗策略。由于小型动物模型是临床转化的第一步，因此该方法可用于评估我们特定的支架材料。该方法也可应用于其他组织工程支架，例如含有细胞和生长因子的支架。我们通过改进纽约特殊外科医院 Scott Rodeo 博士及其同事所采用的方法，对手术技术进行了优化。由于电纺丝和手术操作步骤仅通过书面说明难以掌握，因此对该方法的可视化演示至关重要。在进行聚己内酯支架的静电纺丝时，需要一个带有聚己内酯溶液入口的大丙烯酸箱、一个由电机驱动的收集转轴，以及一个置于化学通风橱内并由电压源供电的真空口，以作为静电纺丝过程的隔离真空环境。在开始操作前，需用70%乙醇彻底清洁箱子，并用Parafilm膜覆盖所有表面，以去除可能影响电纺产品质量的杂质。然后打开风扇，将3毫升新配制的聚己内酯聚合物装入带有18号钝端针头的10毫升注射器中。排除所有气泡后，将该溶液固定在可编程注射泵上，并将针头通过入口插入亚克力箱内，针头约有半英寸留在箱外。接下来，用一条薄铝箔紧密包裹旋转车床芯轴，并将芯轴固定在箱体另一侧的电机上，使其距离注射器针头约15厘米，作为收集器；再将塑料软管插入真空口。然后将软管连接到通风橱的真空源并打开。现在用盖子盖住亚克力箱，并将可编程注射泵的输注速率设置为 2.5 毫升每小时。接着将负极导线接地，启动电机使心轴以 3,450 转每分钟运转，并使用鳄鱼夹将电压源的正极导线连接到箱外的针尖处。开始注入聚己内酯溶液后，启动电压源并将其设置为20千伏的工作电压。注入12分钟后，0.5毫升聚己内酯溶液将形成均匀的套管。关闭所有设备，包括电压源、电源、电机、真空泵和注射泵。从电机上取下心轴，将聚合物套管从心轴上取下，进行一次横向切割，得到矩形的电纺膜。然后用激光切割该膜以形成多个小片，再将这些小片裁切成条状，每四层叠在一起，缝合形成支架，然后开始手术。首先，通过施加后肢足部压力无反应来确认麻醉效果充分。然后，在膝关节内侧、髌骨水平处做一条长两厘米的纵向切口，必要时将皮肤向外侧牵开。接着，使用手术刀在髌骨内侧做内侧髌旁关节囊切开术，切口向上延伸至股四头肌肌腱连接处，向下延伸至髌腱在胫骨结节的附着点。现在，在髌腱外侧的膝关节囊处做一条长一厘米的纵向切口，以将髌骨向外侧松解。然后确保膝关节处于伸展状态，将一把精细剪刀从髌骨外侧向内侧下方穿过，并开合剪刀数次，以便在屈曲膝关节时可将伸展机制向两侧移动。将髌骨向外侧移位，以暴露膝关节内部，确认可清晰看到髁间窝和股骨髁。随后在髁间窝处横断前交叉韧带和后交叉韧带。现在将连接在电钻上的1.6毫米克氏针尖端置于股骨髁间窝的前交叉韧带（ACL）起点处，在助手稳定膝关节的同时，向上外侧钻入。然后将克氏针来回穿入穿出数次，以确保移植物通道通畅。观察克氏针在股骨外侧的穿出点，必要时使用手术刀清除任何阻碍的软组织。当骨隧道通畅后，将克氏针置于胫骨平台胫骨髁间隆起处的前交叉韧带（ACL）止点位置，并在助手稳定膝关节的同时向侧方钻入。随后使用手术刀必要时清除前外侧近端胫骨表面的软组织，以充分暴露克氏针穿出胫骨的位置。接着，将一根长度不超过两英寸的短型Keith针穿过股骨骨隧道。然后将移植物一端的两根缝线穿入缝合针的针眼，利用该针将移植物的一端拉过股骨隧道。然后使用缝合针，借助4-0 Vicryl缝线，将移植物的另一端穿过胫骨隧道。接下来，将移植物的股骨端以“8”字缝合法固定于周围软组织，同时保持膝关节伸直，以在移植物上施加手动张力。再用另一个“8”字缝合法将移植物的胫骨端固定于周围软组织，用剪刀剪去两端多余的移植物，每端保留1至2毫米超出缝线部分。最后伸直膝关节并复位髌骨。使用4-0薇乔缝线，以单个8字缝合关闭内侧关节囊，防止髌骨外侧半脱位，然后用连续皮下缝合的5-0单乔或薇乔缝线关闭皮肤。重建术后16周，对膝关节切片进行组织学分析显示，支架基质已大量被成纤维细胞浸润，并分泌嗜酸性胶原，与骨隧道整合良好。在本实验中，动物处死后立即评估关节的生物力学特性。所有测试样本均在拉伸试验产生的低位移曲线条件下发生中部实质断裂。针对每组样本计算了断裂载荷和刚度。植入后16周，电纺聚合物移植物的峰值载荷和刚度较植入后立即测试时大约增加了一倍。尽管这些数值仍低于正常的前交叉韧带。一旦掌握该动物手术技术，手术可在约15分钟内完成。在实施该操作时，重要的是要注意进行良好的关闭缝合，确保从外部看不到任何缝线。完成此操作后，可进行其他终点分析，例如额外染色和生化检测。该技术为组织工程领域的研究人员评估多种前交叉韧带重建移植物方案奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备用于前交叉韧带重建大鼠模型植入的聚合物支架。请注意，操作活体动物可能存在风险，在进行本实验时，应始终遵守兽医建议并佩戴个人防护装备等预防措施。

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科研

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Bioengineering

生物工程

无胸​​腺大鼠模型工程前交叉韧带移植评估

本文描述了利用大鼠双侧髌腱缺损模型制备并评估脐带基质来源的间充质干细胞球体的方法。该模型具有可接受的发病率，并能够检测未治疗与治疗肌腱之间的差异，以及所测试的两种治疗方法之间的差异。...

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本文介绍了一种切断前交叉韧带（ACL）的手术方法，作为一种可靠的诱导啮齿类动物膝骨关节炎的模型，以及采集膝关节滑液、测量膝关节水肿和评估骨关节炎严重程度的方法。...

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用于评估承重区域骨替代材料性能的大鼠半节段性骨干骨缺损模型

该实验步骤展示了利用磁共振弹性成像技术，通过显微磁共振弹性成像（μMRE）对脂肪和成骨组织工程构建物的力学特性进行无创局部评估，从而监测其组织工程效果的方法学。...

磁共振弹性成像技术用于评估组织工程构建物生长的方法学

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手术获取、分离与 体外 用于组织工程应用的人前交叉韧带来源细胞的扩增

学习利用大鼠模型评估组织工程移植物用于前交叉韧带重建的方法。本方案涵盖可降解聚合物支架的制备、植入及16周后的组织学与生物力学分析，为ACL修复研究提供经济高效的体内评估平台。

用于评估人工前交叉韧带移植物的无胸腺大鼠模型

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