隔离和卫星细胞的表征鼠头Branchiomeric肌肉

该程序的总体目标是从源自第一、第二和第四臂弓的代表性肌肉中分离卫星细胞，以便在细胞外基质上培养。凝胶斑点。这是通过首先解剖年轻成年大鼠的大屠杀、二腹肌和 levada vli 腭肌来完成的。

在第二步中，通过酶、消化和持续时间分离来自每个肌肉样本的卫星细胞。然后将细胞在细胞外基质凝胶上培养。最终，可以通过对感兴趣的肌肉标志物进行染色来跟踪卫星细胞培养物的肌生成的动态状态。

唇裂和腭裂是人类最常见的颅面畸形之一。当存在裂隙时，需要手术修复以闭合缺陷并允许正常的言语发育、纤维化和有缺陷的肌肉再生，但是，会阻碍软腭肌肉的功能恢复。腭裂修复后，您可以展示一种使用仅毫米大小的细胞外基质凝胶斑点涂层培养新鲜分离的卫星细胞的创新方法。

这避免了扩展的要求。安定这些细胞：在分离前一天，将 8 个孔室滑入 100 毫米培养皿中，并将培养皿转移到冷表面。10 分钟后，使用预装微量移液器向每个孔中分配一滴 10 μL 细胞外基质凝胶。

将玻片再冷却 7 分钟后，完全去除剩余的凝胶，并在第二天在 37 摄氏度下干燥孔过夜。为了解剖屠杀肌肉，从一只 9 周大的老鼠的头部中取出皮肤，并使用皮下注射针将头部固定在一侧。在硅胶垫上，隔离腮腺和面神经并去除腺体。

接下来，使用 15 号手术刀刀片，小心地去除面神经。确定咬肌的浅表头。接下来，使用直镊子在颧突处将肌腱与其起点分开，然后用解剖剪刀小心地切割肌腱。

使用手术刀解剖大屠杀的浅表头部，直到其插入下颌支外侧表面的角和下半部分。要解剖二腹肌的后腹部，请用针将头部固定在仰卧位，并去除覆盖在舌下腺和下颌下腺上的皮下脂肪。露出胃前肌肚和后肚，然后用直镊子夹住后腹部的前肌腱，切成，小心地解剖肌腱到鼓膜肌腱的起源。

要解剖 levada vli 腭肌，请定位茎拇样肌。横向拉动它并小心地去除肌肉组织。接下来，定位插入鼓膜 buller 的 levada vli palatino 的肌腱并仔细解剖。

然后从气管后面提起食管。确定插入 levada vli 上颚的软腭区域，并将肌肉切松。然后将肌肉浸入 70% 乙醇中，并将其转移到补充有抗生素的冰冷 PBS 中。

为了分离卫星细胞，将每块肌肉转移到六孔板的单个孔中，并将组织切成两毫米的小块。注意不要将肌肉切碎太多。接下来，将组织片段在 37 摄氏度下每孔 2.5 毫升 0.1% 链霉蛋白酶溶液中小心孵育 60 分钟，每 20 分钟轻轻摇动一次。

当纤维束在补充有马血清和抗生素的 2.5 毫升 DMEM 时表现出松弛的外观，并将消化的组织转移到单独的 15 毫升锥形管中。离心组织浆液并倒出上清液。然后向每管中加入 5 毫升培养基，并用 10 毫升塑料移液管匀浆组织。

再次离心组织并将上清液转移到新的 15 毫升锥形管中。然后向试管中再加入 5 毫升培养基，并再次对组织块进行三倍分级，直到碎片轻松通过移液器。再次离心后，将上清液拉入相应的试管中，并通过 40 微米过滤器将细胞悬液过滤到单独的 50 mL 试管中。

用 1 毫升 DMEM 清洗过滤器，以实现最大的细胞回收率。然后旋转细胞，将沉淀重悬于新鲜的培养基中，并对细胞进行计数以培养分离的卫星细胞。接下来，将细胞悬液稀释至每 10 微升培养基中 10 个细胞的 1.5 倍。

然后将 10 微升细胞添加到每个先前制备的细胞外基质凝胶点上，并在 6 小时后在 37 摄氏度下孵育凝胶。小心地向每个凝胶点添加 400 μL 培养基，然后将载玻片放回培养箱中。三天后，在分离后立即添加适当的培养基开始细胞分化。

超过 90% 的新鲜分离的卫星细胞表达 pack 7 到第 4 天，pack 7 和 MyoD 由来自所有肌肉群的卫星细胞表达。我的 OG 在第 7 天在所有肌肉群中都高度表达。在细胞外基质上接种 4 天后，凝胶斑点，增殖细胞开始融合并形成小的多核肌管，在第 7 天和第 10 天表达肌球蛋白重链。

长而组织良好的肌管在第 10 天很明显。也可以观察到 Myo 管抽搐。该方案允许研究源自 brer 头部肌肉的卫星细胞，并为治疗裂 PAL 提供了新的可能性。病人。