Name: 隔离和卫星细胞的表征鼠头Branchiomeric肌肉 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学习从大鼠头部鳃弓肌肉中分离卫星细胞并进行体外培养的技术。该方法通过酶消化获取细胞，在细胞外基质凝胶上培养，用于追踪肌源性分化过程，为肌肉再生和腭裂治疗研究提供可靠模型。

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本研究由荷兰科学研究组织（NWO）的Mosaic基金（017.009.009）和AO基金会青年研究者启动基金（S-13-167C）资助。Z.Y.R. 由美国国立卫生研究院（NIH）基金（编号 # AG021566、AG035377、NS090051）支持。

本文所述所有实验均经奈梅亨拉德堡德大学当地动物实验伦理委员会批准，符合荷兰法律法规（RU-DEC 2013-205）。
1. 细胞外基质凝胶点
<ol>
	<li>分离前一日执行以下步骤：
	<ol>
		<li>在 4 °C 下解冻一份细胞外基质凝胶（100 µl），至少放置 1.5 小时。用含 4,500 mg/L 葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺和 110 mg/L 丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）将凝胶按 1:10 比例稀释。细胞外基质凝胶始终需保持在 4 °C。注意：温度的急剧变化会导致包被不均和晶体形成。</li>
		<li>将稀释后的细胞外基质凝胶溶液置于冰上 15 分钟。</li>
		<li>将 20 µl 微量移液器预冷 10 分钟。</li>
		<li>将 8 孔腔室载玻片放入 100 mm 培养皿中，并将培养皿转移至低温表面（例如 冷冻包）上放置 10 分钟。</li>
		<li>使用预冷的微量移液器，在每个孔中加入 10 µl 细胞外基质凝胶液滴。将培养皿继续保留在低温表面上至少 7 分钟以上（图 1A）。</li>
		<li>彻底移除残留的细胞外基质凝胶（图 1B），并在 37 °C 下过夜干燥各孔。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 头部肌肉（咬肌、二腹肌和腭帆提肌）的解剖
<ol>
	<li>解剖前，准备50 ml含2%青霉素-链霉素（P/S）的磷酸盐缓冲液（PBS），置于冰上保存。</li>
	<li>安乐死一只成年早期大鼠（9周龄）后，使用CO2/02，切断头部并去除头部的皮肤。将头部转移至含有2% P/S的冰冻PBS中，置于50 ml离心管内。</li>
	<li>咬肌（源自第一鳃弓）
	<ol>
		<li>将头部一侧朝上置于硅胶垫上，并用皮下注射针固定图2A).</li>
		<li>识别腮腺和面神经（图2A暴露覆盖腺体的深筋膜。切开筋膜，使用解剖剪将腺体摘除。辨认外耳道。从茎乳孔处追踪面神经，并用15号刀片小心分离并切除颞支、颧支和颊支。</li>
		<li>通过去除筋膜，游离咬肌的浅层部分。辨认咬肌的浅层与深层部分。追踪浅层部分，直至其止于上颌骨颧突的厚而腱性的腱膜。</li>
		<li>用直镊子将肌腱从其在颧突处的起点分离。使用15号手术刀片或解剖剪将其切断，并小心抬起（图2B).</li>
		<li>用15号刀片解剖咬肌浅头，直至其在下颌支外侧面的下缘和后角处的止点。图 2C）。现在，彻底移除肌肉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二腹肌后腹（源自第2鳃弓）nd 鳃弓
	<ol>
		<li>将头部置于硅胶垫上呈仰卧位，并用皮下注射针固定图 3A).</li>
		<li>去除覆盖在下颌下腺和舌下腺上方的皮下脂肪。接着使用解剖剪去除浅筋膜及腺体。暴露二腹肌（前腹和后腹）。</li>
		<li>用直镊夹住茎突舌骨肌前侧肌腱，将其剪断，并仔细分离至其在鼓泡上的起点图3B对侧同样操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腭帆提肌（来源于第4鳃弓）
	<ol>
		<li>分离二腹肌后腹后，定位茎突舌骨肌，将其向外侧牵拉，并小心将其去除（图4A).</li>
		<li>定位止于鼓泡的腭帆提肌肌腱（图 4A）。小心解剖，并在其两侧进行切割。</li>
		<li>寻找气管以及位于其后方的食管。抬起食管，暴露咽部和喉部。</li>
		<li>定位并解剖咽上缩肌区域。辨认腭帆提肌，并在两侧将其切断。图4B). 
注意：解剖后，立即在体视显微镜下小心去除每块肌肉的肌腱和结缔组织。将所有样本迅速浸入70%乙醇中，随后转移至含有2%青霉素/链霉素的冰冻PBS溶液中，置于15 ml离心管内。
</li></ol>
</li>
</ol>
3. 卫星细胞的分离
<ol>
	<li>对三组肌肉进行以下准备步骤以分离SC：
	<ol>
		<li>配制7.5 ml含0.1%蛋白酶的DMEM溶液。用0.22 µm滤器过滤该溶液。在分离前，于37 °C水浴中预热10分钟。</li>
		<li>配制35 ml DMEM培养基，添加10%马血清（HS）和1%青霉素-链霉素（P/S）。同样在37 °C水浴中预热。</li>
		<li>配制15 ml培养液，成分为DMEM添加20%胎牛血清（FBS）、10% HS、1% P/S和1%鸡胚提取物（CEE）。在37 °C水浴中预热。</li>
		<li>用HS预包被六支塑料移液管（10 ml），并在使用前干燥至少10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在超净工作台中，将每块肌肉转移至6孔板的一个孔中。使用解剖剪将肌肉剪成约2 mm大小的小块。注意不要过度剪碎组织。</li>
	<li>向每个孔中小心加入2.5 ml 0.1%蛋白酶溶液，在37 °C孵育60分钟。分别在20、40和60分钟时轻轻摇动培养板。注意：确切的孵育时间取决于动物的年龄和品系等因素。</li>
	<li>在显微镜下观察。检查肌肉碎片，当肌纤维束呈现松散外观时，停止酶消化（图5）。</li>
	<li>加入2.5 ml DMEM，添加10% HS和1% P/S。转移至15 ml离心管中，在400 × g下离心5分钟。倾倒弃去上清液。</li>
	<li>加入5 ml DMEM，添加10% HS和1% P/S。用10 ml塑料移液管反复吹打至少20次（吹打混匀），以均质化组织。</li>
	<li>在200 × g下离心4分钟。收集上清液并转移至15 ml离心管中。</li>
	<li>加入5 ml DMEM，添加10% HS和1% P/S。再次用10 ml塑料移液管吹打，直至组织碎片能顺利通过移液管。</li>
	<li>在200 × g下离心4分钟，将上清液收集至15 ml离心管中。</li>
	<li>将细胞筛（40 µm）置于50 ml离心管上，将含有解离细胞的上清液转移至滤网上。用1 ml DMEM冲洗，以最大程度回收细胞。</li>
	<li>在1,000 × g下离心10分钟，用移液器弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于300 µl培养液中，用血细胞计数板计数细胞。</li>
</ol>
4. 卫星细胞在细胞外基质凝胶点上的分化
<ol>
	<li>将细胞悬液稀释，以获得每10 µl培养基中含有1.5 × 103个细胞的悬液。</li>
	<li>用胶带固定腔室载玻片的盖子，并在载玻片底面用黑色记号笔标记位置。</li>
	<li>使用微量移液器将10 µl细胞悬液滴加至细胞外基质凝胶点上。在显微镜下检查细胞悬液滴是否准确置于标记点上。于37 °C孵育6小时。</li>
	<li>小心加入400 µl培养基（DMEM补充20% FBS、10% HS、1% P/S和1% CEE），于37 °C孵育3天。 
	注意：此时新分离的施万细胞（SC）经历了严重损伤（酶消化和剧烈吹打），需要时间恢复。在最初三天内不要扰动细胞。此后可根据实验类型更换培养基。 
	细胞外基质凝胶点可用于高密度接种（1.5–2.5 × 103/20 µl）以进行分化检测。培养基（DMEM补充20% FBS、10% HS、1% P/S和1%鸡胚提取物）可每隔三天更换一次。</li>
	<li>或者，若需进行扩增和传代，请按以下步骤操作：
	<ol>
		<li>在4 °C下解冻一份细胞外基质凝胶（500 µl），时间不少于1.5小时。按1:10比例用DMEM稀释，并参照第1.1.1点的建议操作。</li>
		<li>将一支10 ml移液管于4 °C预冷10分钟。</li>
		<li>将三个T75培养瓶置于冷表面（例如冷冻包）上10分钟。</li>
		<li>使用预冷的移液管向每个培养瓶中加入1 ml细胞外基质凝胶。检查确保表面完全覆盖。将培养瓶继续置于冷表面上至少7分钟（图1A）。</li>
		<li>用10 ml移液管彻底移除残留的细胞外基质凝胶，并在37 °C干燥培养瓶1小时。</li>
		<li>计数后，将新分离的SCs重悬于10 ml培养基（DMEM补充20% FBS、10% HS、1% P/S和1%鸡胚提取物）中，接种至预先包被的T75培养瓶中。</li>
		<li>三天后更换培养基（此后每隔三天更换一次），直至细胞融合度达到80%。传代时，用PBS洗涤T75培养瓶三次，然后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育3分钟。加入9 ml培养基（DMEM补充20% FBS、10% HS、1% P/S和1%鸡胚提取物）终止消化，离心（200 × g，5分钟）。弃去上清液。计数后，将1 × 106个细胞重悬于1,000 µl培养基中并冻存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

从一只9周龄的Wistar大鼠的不同鳃弓来源的头肌中分离出卫星细胞（SCs），并直接接种于细胞外基质凝胶点上进行培养，无需预先扩增和传代。分离后，对细胞进行计数，并以相同的细胞密度接种。平行分离三种不同肌肉时，该方法耗时约4小时。为避免培养污染，肌肉解剖后需用70%酒精快速清洗，此步骤至关重要。
在分离卫星细胞（SC）时，需将肌肉组织切成小块（约2 mm），但应避免过度剪碎，以免因细胞损伤导致细胞得率降低。此外，必须在显微镜下仔细监控酶消化的时间，以防止进一步损伤。消化的目的是使肌纤维解离。由于超过90%的分离细胞表达Pax7，因此无需进一步纯化（图6-8）。这避免了其他方法中所需的额外纯化步骤，例如在未包被的培养皿上预贴壁14,37,38、Percoll梯度离心39,40或荧光/磁珠细胞分选41,43。在吹打过程中，关键在于使组织碎片与移液器吸头开口之间产生剪切力，从而实现卫星细胞的机械性释放。若使用10 ml移液器（吸头内径：1 mm）吹打困难，可先使用5 ml移液器（吸头内径：2 mm）。或者，也可将玻璃巴斯德吸管在所需直径处剪断后使用。该方法简便、高效，可同时从多个肌肉样本中分离卫星细胞。
SC 培养板也可用明胶或胶原蛋白包被，但我们的前期研究表明，与胶原蛋白相比，细胞外基质凝胶更有利于维持成肌潜能38。使用毫米级大小的细胞外基质凝胶斑点（10 µl/Ø 2 mm 或 20 µl/Ø 4 mm），可在细胞数量有限的情况下研究 SC 的增殖与分化。与 24 孔板（Ø 15.6 mm）相比，进行分化实验所需的细胞数量约减少 8 至 20 倍，与 35 mm 培养皿（Ø 35 mm）相比则约减少 80 至 200 倍14,38。
由于细胞外基质胶价格昂贵，该方法也更具成本效益。此外，腔室载玻片可替换为塑料盖玻片，以进一步降低成本。制备细胞外基质胶点时，腔室载玻片需过夜干燥，此步骤至关重要。由于细胞外基质胶点呈透明状，必须在背光条件下于底部标记胶点位置。腔室载玻片固定于培养皿中，便于操作。该方法无需进一步扩增细胞培养，因此可研究较小肌肉或小块肌肉样本中的干细胞（SCs）。或者， 例如 若需要更多细胞用于PCR或肌肉构建，可将 freshly isolated SCs 按照上述方法先在T75培养瓶中进行扩增。
采用本方案分离的卫星细胞（SCs）在分离后不宜立即用于流式细胞术进一步纯化。蛋白酶K消化会导致细胞表面抗原发生广泛性降解14。用于细胞培养的马血清和胎牛血清在分离前必须经过充分表征，因为不同批次的血清对成肌细胞的增殖和分化具有差异性影响。
近年来，人们对来源于鳃弓和头部中胚层的肌肉（例如眼外肌）24 越来越关注。已有明确研究表明，头部肌肉与四肢肌肉具有显著不同的特性。来自老年动物的咬肌似乎比四肢肌肉更能保持其再生能力25,26。眼外肌中的干细胞（SCs）具有强大的增殖和分化能力，与头部其他肌肉的干细胞相当，且其移植潜能大于四肢肌肉的干细胞24。
不同肌群之间以及不同物种之间的肌纤维类型分布和肌球蛋白组成存在差异。人类第一鳃弓来源的肌肉包含慢肌纤维和快肌纤维（亚型IIA和IIX）、新生儿型肌球蛋白以及发育中心肌组织典型的肌球蛋白。在啮齿类动物中，这些肌肉约含有95%的快肌纤维（肌球蛋白IIA和IIb）44-46。对禽类肌肉的研究表明，来源于不同肌纤维类型的卫星细胞（SCs）其分化能力有所不同：来源于快肌纤维的SCs仅能分化为快肌纤维，而来源于慢肌纤维的SCs则可分化为两种纤维类型47。此外，快肌纤维中SCs所占比例低于慢肌纤维48,49。这表明，在开展颅面部肌肉相关研究时，必须考虑肌纤维类型的分布情况。与腭裂患者的肌肉类似，啮齿类动物的LVP几乎完全由快肌纤维组成50。因此，来源于LVP的SCs适用于腭裂领域的临床前研究。
本方案为研究源自鳃弓来源的头颈部肌肉或其他较小肌肉或小块肌肉样本的干细胞提供了新的可能性。这将有助于开发新的治疗方法，以改善唇腭裂等疾病中影响面部肌肉的再生，同时也可应用于其他影响较小肌肉的疾病。

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

大约每500至1,000名新生儿中就有1例出现唇裂和/或腭裂（CLP），因此这是人类中最常见的先天性畸形1。软腭肌肉在言语、吞咽和吮吸过程中对软腭的功能至关重要。如果存在软腭裂，这些肌肉将异常地附着于腭骨的后端。
在说话时，软腭会上下移动，防止气流从鼻腔逸出。腭裂患儿缺乏这种控制功能，导致一种称为腭咽功能障碍2,3的现象。尽管治疗方案存在差异，软腭的外科修复通常在幼儿期（6–36 个月龄）进行4。软腭中异常附着的肌肉可通过手术矫正5–7，但仍有 7% 至 30% 的患者持续存在腭咽功能障碍2,3,8–10。
骨骼肌通过卫星细胞（SCs）的作用实现再生的能力已得到充分证实11,12。肌肉损伤后，卫星细胞被激活并迁移至损伤部位，随后增殖、分化并融合形成新的肌纤维或修复受损的肌纤维13。静息状态的卫星细胞表达转录因子Pax714,15，而其子代——增殖中的成肌细胞——则额外表达成肌决定因子1（MyoD）16。分化中的成肌细胞开始表达肌生成素（MyoG）17。成肌细胞终末分化的标志是肌纤维的形成以及肌球蛋白重链（MyHC）等肌肉特异性蛋白的表达16,18。
近年来，再生医学领域已采用多种策略来改善肢体肌肉的再生19-23。对鳃弓来源的头肌开展特定研究也具有重要意义，因为最近的研究表明，这些肌肉在多个方面与其他肌肉存在差异24。与肢体肌肉相比，有研究提示鳃弓来源的头肌所含的卫星细胞（SCs）较少25，再生速度较慢，且损伤后会形成更多的纤维结缔组织26。此外，鳃弓来源头肌中增殖的卫星细胞还表达其他转录因子。例如，Tcf21 是颅面肌发育相关的转录因子，在再生的头肌中高表达，而在再生的肢体肌肉中几乎不表达25。唇腭裂（CLP）患者的软腭肌肉通常比正常的腭肌更小且结构紊乱27,28。软腭肌肉中同时存在慢肌纤维和快肌纤维，但以慢肌纤维为主。相比之下，裂隙肌肉中快肌纤维比例更高，并且毛细血管供应较正常软腭肌肉减少29-31。快肌纤维更容易发生收缩引起的损伤31-33，而伴随的毛细血管供应不足也可能促进纤维化的发生34,35。上述种种因素可能导致唇腭裂手术修复后软腭肌肉再生不良36。鉴于此，建立一种用于分离和鉴定鳃弓来源头肌卫星细胞的实验方案至关重要。该方案为研究鳃弓来源头肌卫星细胞的生物学特性提供了可能，同时也有助于基于组织工程开发新的治疗方法，以促进CLP及其他影响颅面区域疾病的术后肌肉再生。
通常，卫星细胞（SCs）可在肌肉组织解离后获得14。为了从其微环境中释放卫星细胞，一般需要进行组织切碎、酶消化和吹打混悬。卫星细胞可通过在未包被的培养皿上预贴壁14,37,38、Percoll 梯度离心分离39,40，或荧光标记或磁珠细胞分选技术41-43进行纯化。本文介绍一种经济、快速的新方法，用于从年轻成年大鼠头部鳃弓肌中分离卫星细胞。该方法基于先前发表的方案14，并针对小量组织样本进行了特别优化。文中描述了来源于第1st、第2nd和第4th鳃弓的代表性肌肉中卫星细胞的分离过程。分离后，将少量卫星细胞培养于毫米尺寸的细胞外基质胶斑点上，以研究其分化能力。该策略避免了卫星细胞扩增与传代的需要。

<table><tbody><tr><td>25号皮下注射针头&amp;nbsp;G 0.5&amp;nbsp;×&amp;nbsp;25&amp;nbsp;m</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Braun</td><td>BC154R</td><td></td></tr><tr><td>直头显微镊</td><td>Braun</td><td>BD330R</td><td></td></tr><tr><td>外科手术刀片15号&amp;nbsp;</td><td>Swann-Morton</td><td>0205</td><td></td></tr><tr><td>70%酒精</td><td>Denteck</td><td>2,010,005</td><td></td></tr><tr><td>Permanox载片，8孔</td><td>Thermo Scientific</td><td>177445</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿（100 × 20 mm）</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>15 ml无菌锥形离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml无菌锥形离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛（40 &amp;mu;m）</td><td>Gibco</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>10 ml血清移液管</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>20&amp;nbsp;&amp;micro;l FT20</td><td>Greiner bio-one</td><td>774288</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel，无酚红</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>蛋白酶</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>10&amp;nbsp;KU</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基，含GlutaMAX补充剂和丙酮酸钠&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>3600511</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>鸡胚提取物</td><td>MP Biomedicals</td><td>2850145</td><td>20 ml</td></tr></tbody></table>

大鼠头部分支肌卫星细胞的分离与鉴定

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

纤维化及肌肉再生障碍可能阻碍腭裂修复术后软腭肌肉的功能恢复，导致持续存在的言语、吞咽和吸吮问题。体外培养系统可用来研究头颈部肌肉的卫星细胞（成肌干细胞），对于开发基于组织工程的新疗法以促进术后肌肉再生至关重要。这些系统将为腭裂患者的治疗提供新的前景。本文介绍了一种从头颈部肌肉中分离、培养和诱导卫星细胞分化的实验方案。该分离方法基于酶消化和吹打裂解以释放卫星细胞。此外，本方案包含一种创新性方法，即使用毫米尺度的细胞外基质凝胶涂层，该方法仅需少量卫星细胞即可进行分化检测。

采用本方案，咬肌（单侧）可获得 0.8–1 × 106 个细胞，二腹肌（后腹）可获得 1.5–2 × 105 个细胞，腭帆提肌可获得 1–1.5 × 105 个细胞。细胞得率取决于肌肉类型、动物品系及年龄。为比较三组肌肉，将 freshly isolated SCs 以相同细胞密度（1.5 × 103/10 µl）接种。分离后立即检测发现，超过 90% 的 freshly isolated 细胞表达 Pax7（图 6）。
第4、7和10天的培养物使用针对Pax7、MyoD、MyoG和MyHC的抗体进行免疫染色。每份培养物在20倍物镜下随机计数五个视野。第4天时，所有肌群均表达Pax7和MyoD（图6、7和8），然而咬肌和二腹肌来源的卫星细胞子代开始表达肌生成素的时间早于腭帆提肌（图9）。至第10天，所有组别中MyoG的表达均显著降低（图9）。接种于细胞外基质凝胶斑点数天后，增殖的细胞开始融合并形成表达肌球蛋白重链的多核肌管。在第7天可清晰观察到小型肌管（图10）。第10天时可观察到肌管的收缩颤动（视频1）。
<img alt="在实验台上使用培养皿进行静力学平衡实验装置；研究重量分布。" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：腔室载玻片中的细胞外基质凝胶点。（A）为便于操作，将8孔腔室载玻片放入100 mm培养皿中。每孔加入10 µl细胞外基质凝胶，并置于冷表面上（7 min）。（B）去除多余细胞外基质凝胶后的腔室载玻片。
<img alt="猪面部肌肉的运动神经支配；标注图示；神经通路的科学研究。" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2：咬肌的解剖。（A）动物头部的侧视图。耳（E）、腮腺（P）和面神经（VII）。（B）咬肌浅头（Ms）和颞肌（T）的腱性腱膜（Te）。用镊子将肌腱与其附着点分离。（C）小心地解剖肌肉，直至其在下颌支上的附着点。E：耳，P：腮腺，VII：面神经，T：颞肌，Ms：咬肌浅头，Te：肌腱，Mp：咬肌深头。
<img alt="显示腺体位置和肌肉结构的小鼠解剖图" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：二腹肌后腹的解剖。（A）动物头部呈仰卧位。定位下颌下腺（Sg）、咬肌（M）、面神经（VII）和胸锁乳突肌（SCM），移除下颌下腺。（B）定位二腹肌前腹（AD）和后腹（PD）。用直镊夹住后腹的前腱，将其切断，并小心剥离至其在鼓泡（ty）的起点。E：耳，Sg：下颌下腺，VII：面神经，M：咬肌，SMC：胸锁乳突肌，AD：二腹肌前腹，PD：二腹肌后腹，Ty：鼓泡。
<img src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4new.jpg" align="Figure 4" alt="果蝇唾液腺解剖示意图，显示解剖位置、标注及解剖刀。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图4：腭帆提肌的解剖。（A） 解剖下颌舌骨肌（后腹）后的总体观。可定位茎突舌骨肌（St）及腭帆提肌的肌腱。注意其后方走行的气管（T）和食管（Es）。（B） 抬起气管和食管后，暴露出咽部（P）。此时可见向侧方延伸至软腭的腭帆提肌。箭头指示已解剖出的咽上缩肌；注意两侧的腭帆提肌。E：耳，St：茎突舌骨肌，VII：面神经，M：咬肌，AD：二腹肌前腹，PD：二腹肌后腹，T：气管，Es：食管，P：咽，*腭帆提肌。
<img alt="组织学显微镜图像；组织样本观察；标记为A和B的两个区域。" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5： 肌肉组织在使用蛋白酶进行酶消化前（A）和消化后（B）的形态。请注意，酶消化后肌束呈现松散状态。
<img alt="荧光显微镜，DAPI Pax7标记，细胞核可视化，免疫荧光图像。" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig6highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6：Pax7免疫染色。 新鲜分离的卫星细胞（SCs），在分离结束时接种于细胞外基质凝胶上（初次组织消化后约6小时）。使用10X物镜随机选取五个视野进行计数，每个视野平均约210个细胞。约90%的细胞Pax7呈阳性。DAPI：蓝色，Pax7：红色。比例尺，100 µm。
<img alt="显示第4天和第7天Pax7、MyoD细胞分化的荧光显微镜图像和柱状图。" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7：Pax7 和 MyoD 免疫荧光染色。对第4、7和10天的培养细胞使用Pax7和MyoD抗体进行染色。(A–C) 和 (D–F) 分别为咬肌来源的第4天和第7天培养物的代表性显微图像。(G 和 H) 每个显微视野中Pax7+ 和 MyoD+ 核的数量被计数，并表示为总核数（DAPI）的百分比。DAPI：蓝色，Pax7：红色，MyoD：绿色。比例尺，100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="咬肌、二腹肌和腭帆提肌中肌细胞分化的柱状图；数据表。" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 8"> 
图 8：来自咬肌、二腹肌和腭帆提肌的单核细胞培养物中 Pax7±/MyoD± 细胞的分布情况。（A–C）第 4、7 和 10 天的培养物使用抗 Pax7 抗体及 MyoD 免疫染色进行染色。细胞总数基于细胞核总数（DAPI）。（D）Pax7±/MyoD± 细胞的数据量化结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="第4天和第7天DAPI与MyoG的荧光显微镜图像；MyoG+细胞百分比的图表与表格。" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 9"> 
图9：肌生成素免疫染色。 对第4、7和10天的培养物使用抗肌生成素抗体进行染色。(A–D) 来自腭帆提肌的第4天和第7天培养物的代表性显微照片。(E) 统计每个显微视野中MyoG+细胞核的数量，并以总细胞核数（DAPI）的百分比表示。(F) MyoG+细胞的数据量化结果。DAPI：蓝色，肌生成素：绿色。比例尺，100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="DAPI染色的细胞分化荧光显微图像，显示第4、7、10天的MyHC表达。" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图10"> 
图10：肌球蛋白重链免疫染色。 第4、7和10天的培养物用抗肌球蛋白重链（MyHC）抗体进行染色。图像为代表性的二腹肌（DIG）来源的第4、7和10天培养物的显微照片。在第7天可见小型肌管，而在第10天则可见长而结构清晰的肌管。比例尺，200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：肌管收缩。 显示了二腹肌肌肉第 10 天培养物中两个具有代表性的发生收缩的肌管视野示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">请点击此处查看该视频。</a>

本方案描述了从9周龄大鼠的鳃弓源性头肌中分离卫星细胞的方法。这些肌肉起源于不同的鳃弓。随后，将卫星细胞培养在毫米尺度的点状包被区域，以研究其分化过程。该方法避免了卫星细胞的扩增和传代。

纤维化和肌肉再生障碍可能阻碍腭裂修复后软腭肌肉的功能恢复，导致持续性……

本实验的总体目标是从来源于第一、第二和第四咽弓的代表性肌肉中分离出卫星细胞，并在细胞外基质凝胶点上进行培养。该过程首先解剖年轻成年大鼠的二腹肌、腭帆提肌和咬肌。第二步中，通过酶解消化及其作用时间，从每份肌肉样本中分离出卫星细胞。随后将细胞培养在细胞外基质凝胶上。最终，可通过针对目标肌肉标志物的染色，追踪卫星细胞培养物中成肌过程的动态变化。唇裂和腭裂是人类最常见的颅面部畸形之一。当出现裂隙时，需要通过手术修复来闭合缺损，以实现正常的语言发育。然而，纤维化和肌肉再生缺陷可能会阻碍软腭肌肉的功能恢复。在腭裂修复术后，您可以展示一种创新的方法，利用仅毫米大小的细胞外基质凝胶点状包被，对 freshly isolated satellite cells 进行原代培养。这可以避免需要进行扩增。在分离前一天，将八孔腔室载玻片放入直径100毫米的培养皿中，并将培养皿转移至低温表面。10分钟后，使用预装的微量移液器向每个孔中加入一滴10 µL的细胞外基质凝胶。将载玻片再冷却七分钟后，彻底去除残留的凝胶，并在37摄氏度下干燥凝胶孔，过夜。次日，解剖咬肌时，取一只九周龄大鼠，去除其头部皮肤，用皮下注射针将头部侧向固定。在硅胶垫上分离腮腺和面神经，并摘除腮腺。接下来，使用15号手术刀片，小心地分离面神经。辨认出咬肌的浅头部分。然后，用直镊子将肌腱与其在颧突处的起点分离，再用解剖剪小心地剪断该肌腱。使用解剖刀，分离咬肌的浅层部分，直至其在下颌支外侧面的下缘及下部的止点处。为解剖二腹肌的后腹，先用针将头固定于仰卧位，去除覆盖在下颌下腺和舌下腺表面的皮下脂肪。暴露二腹肌的前、后腹，然后用直镊夹住后腹的前部肌腱，小心地沿肌腱分离至其在鼓泡上的起点。为了分离提上颚肌，需先定位茎突咽肌。将其向外侧牵拉，并小心去除周围的肌肉组织。接着，定位提上颚肌止于鼓泡的肌腱，并仔细进行分离。然后从气管后方抬起食管。辨认出levator veli palatini 肌附着于软腭的部位，并将该肌肉切断分离。随后将肌肉浸入70%乙醇中，转移至含有抗生素的预冷PBS溶液中。为了分离卫星细胞，将每块肌肉转移至六孔板的各个孔中，并将组织切成约2毫米的小块，注意不要过度剪碎肌肉。接着，每孔加入2.5毫升0.1%蛋白酶溶液，在37摄氏度下轻轻振荡孵育60分钟，每隔20分钟轻柔摇动一次。当纤维束A部分呈现松散状态时，向每孔加入2.5毫升添加了马血清和抗生素的DMEM培养基，将消化后的组织转移至各自的15毫升锥形管中。离心收集组织悬液，弃去上清液。随后向每根试管中加入5毫升培养基，使用10毫升塑料移液管对组织进行匀浆处理。再次离心组织，将上清液转移至新的15毫升锥形管中。然后向管中再加入5毫升培养基，再次吹打组织块，直至碎片能顺利通过移液管。再次离心后，将上清液转移至相应编号的对应管中，并通过40微米滤网将细胞悬液过滤至各自的50毫升管中。为最大程度回收细胞，用一毫升 DMEM 清洗滤筛。然后离心收集细胞，将沉淀重悬于新鲜培养基中，并计数细胞以培养分离的卫星细胞。接着，将细胞悬液稀释至每 10 微升培养基含 1.5 × 10³ 个细胞。然后将10 µL细胞加入到每个预先制备的细胞外基质凝胶点上，6小时后将凝胶置于37 °C培养箱中孵育。小心地向每个凝胶点加入400 µL培养基，并将载玻片放回培养箱。三天后，在细胞分离后立即加入相应的培养基以启动细胞分化。超过90%的新分离的卫星细胞表达Pax7。到第4天，所有肌群来源的卫星细胞均表达Pax7和MyoD。在第7天，所有肌群中均高表达MyoG。接种于细胞外基质凝胶点上4天后，增殖的细胞开始融合并形成小型多核肌管，这些肌管在第7天和第10天表达肌球蛋白重链。到第10天时，可明显观察到长而结构良好的肌管。也可观察到肌管的收缩现象。本方案允许对源自颅面肌的卫星细胞进行研究，为唇腭裂患者的治疗提供了新的可能性。

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发育生物学

隔离和卫星细胞的表征鼠头Branchiomeric肌肉

本视频展示了通过组织解剖、酶消化以及后续的机械和离心纯化方法，从大鼠头部鳃弓肌组织中分离卫星细胞的过程。随后将细胞接种于经细胞外基质包被的培养孔中，使其分化为成肌细胞，并最终形成肌管和成熟的肌纤维。...

一种从大鼠头肌组织中分离卫星细胞的技术

肌纤维的分离与培养是金标准 体外...

分离与培养成年骨骼肌单个肌纤维及其卫星细胞

分离和培养静息状态的卫星细胞（一种肌肉干细胞群体）的纯细胞群体，对于理解肌肉干细胞生物学与再生机制，以及用于杜氏肌营养不良症和其他退行性疾病的干细胞移植治疗至关重要。...

肌肉卫星细胞的分离、培养与移植

体外培养系统已证明对我们理解脊椎动物肌发生过程至关重要。然而，关于非哺乳类脊椎动物骨骼肌的发育与生长，尤其是在基部分类群中，仍有许多未知之处。建立一种高效且稳定的原代培养方案，用于分离该组织中的成肌前体细胞（MPCs）——即具有自我更新能力的成肌祖细胞，并维持其自我更新、增殖和分化能力，有助于揭示脊椎动物各谱系中保守与分化的调控机制。...

从基础脊椎动物谱系制备原代成肌前体细胞/成肌细胞培养物

从人类肌肉中获得的主要贴壁细胞类型为成肌细胞和成纤维细胞。本实验通过基于CD56抗原的磁性激活细胞分选技术对细胞群体进行富集。随后使用特异性抗体进行免疫标记，并结合图像分析技术，实现对单个细胞胞质和细胞核特征的定量分析。...

人骨骼肌中初级成肌细胞和成纤维细胞的分离与定量免疫细胞化学表征

在此，我们介绍一种从成人肌肉组织中获取纯化人成肌细胞群体的方法。这些细胞可用于研究 体外 骨骼肌分化，特别是研究参与钙离子（Ca）相关过程的蛋白质2+...

人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

准确鉴定卫星细胞对于研究其在各种生理和病理条件下的功能至关重要。本文介绍了一种通过基于免疫荧光染色的方法在成年骨骼肌切片上鉴定卫星细胞的实验方案。...

利用Pax7和层粘连蛋白抗体通过免疫荧光鉴定骨骼肌卫星细胞

本文提出一种方法，可从纯合突变型Lamin...

单根肌纤维的分离与培养：早产后发育阶段Emery-Dreifuss型肌营养不良小鼠模型的研究

本方案描述了从小鼠单个骨骼肌中分离肌肉干细胞和纤维脂肪形成祖细胞的方法。该方案包括单块肌肉解剖、通过荧光激活细胞分选法分离干细胞、免疫荧光染色评估纯度，以及通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷掺入实验定量检测S期进入情况。...

从单个骨骼肌中分离静息态干细胞群体

本文介绍了一种高效的荧光激活细胞分选（FACS）方案，用于分离小鼠肢体肌肉卫星细胞，适用于通过靶点切割和核酸酶释放技术（CUT&amp;RUN）研究肌纤维中转录调控。...

一种高效的小鼠卫星细胞CUT&RUN分析方案（经FACS分离）

本方案通过组织解离、连续过滤、预贴壁及特定培养条件，提供了一种从成年和新生小鼠骨骼肌中分离和富集原代成肌细胞的标准化方法，可用于建立和维持由卫星细胞衍生的成肌细胞培养体系，以支持后续实验应用。...

分离骨骼肌卫星细胞以 体外 肌生成研究

学习从大鼠头部鳃弓肌肉中分离卫星细胞并进行体外培养的技术。该方法通过酶消化获取细胞，在细胞外基质凝胶上培养，用于追踪肌源性分化过程，为肌肉再生和腭裂治疗研究提供可靠模型。

大鼠头部分支肌卫星细胞的分离与鉴定

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