重组流感疫苗的嵌合体小鼠模型鼻腔给药研究黏膜免疫

该程序的总体目标是描述一个评估疫苗特异性适应性免疫的生理启动的系统。首先，使用反向遗传学生成含有特定免疫原性肽的减毒活流感疫苗，然后使用鸡胚繁殖病毒。接下来，从接种疫苗的小鼠的淋巴结中收获细胞，并使用传真分析来跟踪树突状细胞迁移。

在下一次检测中，标记对免疫原性肽反应的 CD 8 阳性 T 细胞并将其注射到接种疫苗的小鼠中，然后进行传真分析以测量这些细胞的增殖，从而更详细地分析免疫反应。通过将表达白喉毒素受体的骨髓细胞注入受照射的同源小鼠中，然后暴露于白喉毒素中来制作竞争性骨髓钟声镜。成功耗竭后，对小鼠进行免疫接种并使用标记抗体和四聚体鉴定 CD 8 阳性 T 细胞。

识别特异性肽。这种方法可以帮助回答疫苗学领域的关键问题，例如疫苗如何在神经水平上发挥作用，这是疫苗的主要细胞和分子靶点，最重要的是，我们如何改进当前的预防策略。演示该程序的是 Sanmen Medina。

我们的实验室经理和我 对于这个方案，使用冷适应菌株生成一种再分类的感冒适应流感疫苗。A 安娜堡 6 60。作为背景与血凝素和 A PR 8 34 菌株的修饰神经氨酸酶偶联。

神经氨酸酶基因的蛋白茎序列的一部分被编码鸡肽 syn 粪便的短 CDNA 序列取代。该肽在 H 2 BMHC 类别中具有高度免疫显性。C 57 black 的 1 个限制反应 6 只小鼠，并作为可追溯元件发挥作用。

首先，在含有 10% 胎牛血清和 1% 笔链球菌的 DMEM 的六孔板的每个孔中接种 1、000、002 93 个 T 细胞。接下来，制备足够的质粒转染混合物，每孔 100 μL。混合每种质粒的一小克，并在另一支试管中加入预热的 opti MEM 细胞培养基至 50 μL。

加入两倍体积的脂质切除术 2000，对应于要转染的质粒总量，并在将转染混合物添加到细胞中之前，用 opti MEM 将试管加满至 50 μL。让它在室温下静置 30 分钟。然后向每个孔中加入 100 μL 转染混合物，并将板移至培养箱中 16 小时。

第二天，将培养基更换为含有 0.3% BSA 和 1% pen strep 的 DMEM。然后将细胞移至 33 摄氏度和 5% 二氧化碳 5 小时。五个小时后。

在补充 Tripsin 的 DMEM 中添加 100 万个流感允许 MDCK 细胞的叠加层。在 33 摄氏度的孵育方案下将共培养物维持 2 到 3 天，以产生和扩增病毒。然后，使用 5 分钟的 260 G 旋转清除碎片。然后收集上清液，在无菌条件下接种 9 至 10 天龄的鸡胚蛋。

为此，请在蛋壳顶部打一个孔，然后以 100 x 10 x 或 1 x 稀释度添加病毒。用棉签用融化的蜡盖住蛋壳，并将接种的鸡蛋在 33 摄氏度下孵育三天。稍后，从受感染的鸡蛋中收集 Alan Toic 液。

用 70% 乙醇清洗蛋壳。打开鸡蛋，在上部有一条非常轻微的裂缝，然后用无菌镊子去除 Alan Toic 膜。使用 10 毫升移液器收集尽可能多的液体。

通常为 6 至 10 毫升。在 4 摄氏度下以 260 gs 离心液体 10 分钟，然后将清除的 Alan Toic 液体转移到新试管中。麻醉供体小鼠并通过手术进入纵隔后，使用弯曲的镊子收获淋巴结。

将淋巴结转移到含有 1 毫升 DMEM 的 6 孔板中。去除淋巴结周围的任何结缔组织或脂肪组织后，用一根针固定淋巴结，然后用另一根针将其掰开。这应该会导致细胞从淋巴结中爆发到培养基中以收集细胞。

首先，将所有组织材料通过 70 微米尼龙过滤器，以获得可直接离心的细胞悬浮液。将细胞沉淀重悬于 2 mL RBC 裂解缓冲液中。让裂解反应在室温下进行 3 分钟，最后加入 2 mL 冰冷的 PBS，然后根据文本方案对细胞进行染色。

确保在抗体孵育前使用板轻弹去除并丢弃 super name。来自市售 TCR 转基因小鼠的标记供体 T 细胞在 1 毫升 PBS 和 5 微摩尔 CFSE 中孵育 500 万个细胞。让孵化在 20 摄氏度下在黑暗中进行 37 分钟。

然后以每 100 微升 PBS 200 万个的浓度收集细胞，并通过眶后窦注射向受体同源小鼠注入 100 微升推注。三到五天后，对小鼠实施安乐死，收获纵隔淋巴结并准备用于流式细胞术的单细胞悬液。如故。

然后通过在抗体混合物中对单细胞悬液进行染色来识别供体细胞。用于分析。保持流式细胞仪的 FL 一个通道打开以确定 CFSE 的稀释曲线。

在去除和消毒安乐死小鼠的胫骨和股骨后，将它们收集在那里的 DMEM 培养皿中。用锋利的剪刀剪断骨头末端，并将骨髓冲洗到 DMEM 中。现在使用标准方法，使用铯 1 37 源辐照器照射 6 至 8 周龄雌性小鼠 照射小鼠 2 至 4 小时后，麻醉小鼠并通过眶后窦注射 200 万个细胞在 100 微升 PBS 中移植供体骨髓细胞在接下来的两周内， 在小鼠的饮用水中每公斤供应 2.5 至 5 毫克的 Baal。

从接种疫苗前两天开始，将 50 纳克 DT 稀释在 50 微升 PBS 中，逐滴直接给药到麻醉小鼠的鼻孔中。接种疫苗后继续这种治疗 3 天。有关生成最终鼠标模型的详细信息，请参阅文本协议。

麻醉下使用鼻内注射用重组减毒活流感接种小鼠。在 50 微升 PBS 中，从 200 微升移液器中输送 1000 PFU 疫苗，通过在双向启动子的控制下转染编码流感病毒八个片段的质粒，可以生成重组减毒活流感疫苗。感冒适应流感疫苗通常包含感冒适应毒株的六个片段，以及所选流感毒株的 HA 和 NA，例如 H one N one。

冷适应允许在 33 摄氏度（小鼠和人类上呼吸道的温度）下限制病毒复制，但不允许在下呼吸道复制，因此不会导致肺炎融合。PCR 用于用可追踪的 OVA 衍生肽替换病毒神经氨酸酶茎中的保守区域。在接种疫苗后 3 至 6 天之间将可追溯肽模型接种到小鼠体内。

在肺引流淋巴结中检测到可追踪的 syn fecal 蛋白。多参数流式细胞术用于实时量化疫苗衍生的抗原呈递。同样，输注 syn 粪便特异性 T 细胞可以量化疫苗特异性 CD 8 T 细胞反应，以评估疫苗接种过程中的基因特异性功能。

使用了结合 DTR 技术和竞争性骨髓 kyira 的小鼠模型。因此，在对疫苗接种的免疫反应过程中，基因功能的丧失针对特定细胞区室。观看此视频后，您将很好地了解如何分析参与宿主疫苗诱导免疫调节的分子和生理途径。

此外，该技术将为确定疫苗的细胞靶标提供新的见解，从而进一步评估新的疫苗平台。