Ex Vivo 利用共聚焦宏观成像技术观察出生后小脑颗粒细胞迁移

本实验的总体目标是在活体脑切片中观察迁移的神经元。首先从出生后第10天（P10）的大鼠中分离出小脑，随后制备急性小脑切片，并用荧光探针标记神经元。

然后通过大视野共聚焦成像或共聚焦显微镜进行延时实验。最后一步是在生成的视频中追踪神经元。最终，利用离体显微技术揭示内源性因子或调节神经元迁移的有毒物质所起的作用。

与共聚焦显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于，宏观共聚焦成像能够扩大视野，使脑切片可直接放置于插槽中进行观察。我最初产生这一方法的想法，源于在转移和稳定脑切片以进行共聚焦显微镜实验时遇到了困难。首先，获取一只断头的P10大鼠幼崽头部的颅骨，使用精细虹膜剪从颅骨基部向颅骨前部区域小心地进行两侧切口。然后用两把3号镊子移除已解剖的颅骨，打断脑组织与颅骨之间的任何粘连。

现在，用刮勺的一端将脑组织取出，放入含有2毫升冰上预冷的HBSS的35毫米培养皿中。接着，在体视显微镜下，使用两把3号镊子通过D型撕裂法从脑组织中分离出小脑。再用刮勺将小脑转移至另一个含有冰冻缓冲液的新培养皿中。

然后使用相同的工具，去除并弃去残留的脊髓和软膜。准备一个3号刀柄，安装15号手术刀片。在体视显微镜下，用刀片沿小脑蚓部与右侧半球之间进行切割。

进行振动切片时，在样品台滴加一滴氰基丙烯酸盐胶水，等待15至25秒，使溶剂蒸气挥发，然后将小脑转移至样品台。接着，将小脑边缘固定在样品台上，静置10秒。现在使用操作器，将样品台插入缓冲槽中，使小脑的横轴与刀架垂直。

务必使用铝制扳手固定组织块。然后小心地用HBSS覆盖小脑，并在冷却浴中加入碎冰。切片时，将清洁的刀片放置到位，使其刃口正好位于样本后缘的后方。

将此位置定义为开始冰冻的起点。然后使用前进指令，将终点定义为刚刚越过样本前缘的位置。现在将切片厚度设置为180微米。

然后将切片速度设为2.5，频率设为八，开始对样本进行切片。每只小脑最多收集五片切片。使用截短的宽口公猪玻璃移液管逐片拾取切片。

将切片转移至含有冰上预冷的HBSS的培养皿中。在体视显微镜下收集切片后，使用两把5号镊子小心去除脑膜。同时，轻轻分离LOE，以利于探针的加载。

切片后，使用截短的宽口移液管将切片连同部分 HBSS 转移至六孔板中，每孔最多放置三个切片。随后，吸除各孔中的培养基，每孔加入含有 10 µM 荧光染料的 5 毫升负载溶液，避免光照，用铝箔覆盖六孔板。然后将六孔板置于摇床上，设置转速为 35 RPM。

将培养板在室温下孵育10分钟，使染料标记细胞孔中的细胞。随后，像之前一样将切片转移至具有3微米孔径的Transwell小室膜上。然后吸去加样培养基，仅保留切片。

现在取出插入物和切片，向孔中加入 1.9 毫升 DMEM 培养基以充满孔板。然后将插入物放回，并再加入 100 微升 DMEM 培养基以覆盖组织。将此样本孵育 2 小时，之后即可观察到颗粒细胞。

将无盖的培养板转移至共聚焦显微镜的环境培养室中，并保持恒定的气体流动。然后在共聚焦显微镜的培养板插件上放置玻璃盖玻片，以进行延时成像实验。在继续后续操作前，让细胞在培养室中额外孵育两小时。

为了观察组织切片中颗粒细胞的迁移，使用488纳米的光照射样本，并采用2倍干式物镜。使用ImageJ检测500至530纳米范围内的荧光发射信号。对于延时成像序列中的每一幅图像，采用标准差模式进行Zack投影处理，并调整每幅图像的对比度和亮度，使标记的颗粒细胞易于观察。随后，从粒子分析菜单中选择手动追踪插件。

使用插件在时间序列图像中依次点击每个标记细胞体的中心点。然后将原始追踪数据导出至电子表格以进行进一步分析。利用一个智能的自制工具对来自 Image J 的导出原始追踪数据进行重新整理，该工具可通过程序识别每个细胞及其对应的位置信息。

计算每个细胞的总迁移距离和平均迁移速度。在出生后早期的小脑中，颗粒细胞在穿过不同皮层时，其迁移方式和速度表现出显著变化。本研究观察了PM大鼠小脑组织切片中CTG标记的颗粒细胞。

如所述，颗粒细胞在分子层中以平均每小时18微米的速度进行径向迁移。随后使用另一样本测试了预期可改变迁移速率的药物的作用。将pay cap 38加入培养基后，导致颗粒细胞在分子层中的迁移速度下降了79%，降至每小时2.5微米。

给予PI one（一种内源性TPA抑制剂）后，颗粒细胞的迁移速度从对照组的正常速度降低了78%，降至每小时4.2微米。观看本视频后，您应能够充分理解如何在发育中的理论气球模型中追踪细胞。在尝试该实验操作时，重要的是要牢记为细胞迁移及其后续发育提供适当且恒定的环境参数。

该技术为神经科学领域的研究人员探索大脑中的嗅觉加工过程铺平了道路。