工程三维细胞化胶原凝胶的血管组织再生

该程序的总体目标是设计用于血管组织再生的管状结构。这是通过首先使用成型技术将 1 型胶原蛋白和平滑肌细胞结合在圆柱形几何形状中来实现的。第二步是在专门设计的静态生物反应器中成熟构建体。

接下来，小心收获成熟的构建体，并使用旋转壁生物反应器将内皮细胞放置在构建体的管腔上。最终，进行组织学、代谢测定和机械测试以评估这些管状结构的特性。这项技术的独创之处在于，它只需一步即可将细胞和胶原蛋白结合，无需任何额外的物理或化学处理，即可产生具有目标机械性能的组织工程构建体。

此外，由于专门设计的夹具允许作和端部链接，因此可以轻松作结构。这种方法可以深入了解细胞和细胞外基质在血管组织再生的生长和重塑过程中的相互作用。此外，它还可以应用于许多目标组织，例如肌腱、皮肤移植物、心脏补片和神经系统。

要开始制造和组装静态生物反应器，如随附的文本协议中所述，包括有关储液器和纱布、握把制造、心轴帽以及外壳模具组装和灭菌技术的详细信息。接下来，在 175 平方厘米的组织培养瓶中扩增猪主动脉平滑肌细胞，直到它们达到 90% 汇合。使用标准培养技术，收获细胞，然后以每毫升 400 万个细胞的浓度重悬于完全培养基中。

接下来，混合一份缓冲溶液、两份无菌胶原蛋白溶液（每升 4 克）和一份细胞悬液。按此顺序测量混合物的 pH 值，并确保其在 pH 7.0 和 7.4 之间。然后将细胞胶原蛋白混合物轻轻倒入组装好的外壳模具复合物中。

确保混合物中没有气泡。让胶原蛋白凝胶在无菌环境中在室温下静置 1 小时。一小时后，取下外壳管，小心地将构建体转移到含有 35 毫升预热培养基的储液槽中。

将构建体在垂直位置孵育一到两周的静态成熟。每两天更换一次培养基，从下隔膜端口吸出旧培养基，并用等量的新鲜培养物重新填充储液槽。中等。如果需要，在前 12 小时内和之后每 24 小时一次，在每次培养基更换时收集 1 毫升旧培养基和新鲜培养基进行生化分析。

在无菌条件下从培养基中取出构建体，并将其正交放置在扫描激光干涉仪的路径中，以在静态成熟一到两周后测量构建体的厚度。将生物反应器转移到细胞培养罩中，轻轻地从其心轴上取下构建体。释放后，将其放入直径为 100 毫米的培养皿中，该培养皿中含有 40 毫升新鲜培养基。

接下来，设置一个微型机械测试仪，配备 5 到 10 牛顿的称重传感器和手柄，这些夹具延伸到保持在 37 摄氏度的 PBS 浴中。从培养皿中取出构建体，并将其连接到用于纵向测试的专用夹持装置上，并设计为连接到构建体的纱布部分而不会压碎凝胶。使用特氟龙胶带防止在测试过程中夹持装置滑动。

然后将结构安装到微型机械测试仪上。接下来，在纵向上进行疲劳测试，首先将结构拉伸到其初始标距长度并保持 10 分钟。然后以每秒 5% 的速率施加 30 个 10% 循环应变的循环。

通过 10% 循环应变的增量步骤增加应变，直到样品无法在圆周方向上进行测试。首先将样品切成 10 毫米长的环形结构。然后将环安装到不锈钢棒上，以代替夹具。

与纵向测试一样，首先，将结构拉伸至其初始标距长度并保持 10 分钟。接下来，以每秒 5% 的速率施加 30 个 10% 循环应变的循环。一旦结构成熟并将其从心轴上取下，将两端连接到储液器的结构固定并将其放入储液器组件中。

如下所示。用 30 毫升培养物填充储液池的外部。中等。接下来，用蛋白质混合物填充构建体管腔体积的 75%，然后闭合构建体的两端。

为避免蛋白质溶液泄漏，将生物反应器置于培养箱内，并以 4.02 乘以 10 的速度将生物反应器旋转至负 5 GForce 一小时，以便在腔内包被时用蛋白质涂覆管腔表面。收获使用标准技术培养的人脐静脉和 tial 细胞，当它们达到 90% 汇合度时，Resus 悬浮细胞并补充 M1 99 培养基。接下来，将人脐静脉和尿路上皮细胞观察到构建体的管腔中。

密度为每平方厘米 1000 个细胞，关闭构建体的上端以避免细胞溶液泄漏。将托管在旋转壁生物反应器培养物中的构建体以 4.02 乘以 10 的恒定旋转方式孵育两天，直至负 5G 力。在血管结构的静态成熟过程中，细胞隆起结构的外径迅速减小。

如图所示，在静态培养的第一天，构建体的直径减少了其初始值的 60%。到第 7 天，结构已经减少了近 85%结构的纵向和周向应变循环都遵循胶原蛋白基结构的典型粘弹性。总体而言，在相同应变范围内，与圆周方向相比，结构在纵向上更强，对内皮结构进行的 Massen tricone 染色显示高度均匀的内皮。

平滑肌细胞表现出纺锤形形态，似乎均匀地分散在壁上，而内皮细胞似乎在管腔侧分布良好。在他的发展之后。这项技术为生物力学和再生医学领域的研究人员探索工程组织和天然组织的机械行为铺平了道路。

观看此视频后，您现在应该对血管结构如何快速设计马并最终变得足够坚固以处理和用于动态器中的机械调节有了很好的了解。我们希望我们的努力和结果让您相信细胞外基质模型中细胞在生物功能组织发育方面的巨大潜力。