Name: 治疗核黄素血小板制品和紫外线光:对有效性高滴度细菌污染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 了解核黄素与紫外线光处理血小板制品的病原体灭活技术，评估其对高滴度细菌污染的减少效果。该方法可有效降低细菌负荷并保障血液成分质量，为输血安全提供重要技术支持。

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作者无致谢。

1. 细菌悬液的制备：
<ol>
	<li>从划线培养的平板中，用无菌接种环无菌地挑取单个菌落，接种于含有100 ml适当生长培养基的250 ml无菌瓶中（见表1）。</li>
	<li>将瓶子置于摇床培养箱中，在适当条件下（见表1）培养1–2天，期间定期检查菌体生长情况。摇床转速设为140 RPM。</li>
	<li>将细菌悬液无菌转移至两个无菌的50 ml锥形离心管中，在23 °C条件下以3,000 × g离心20分钟。</li>
	<li>吸除上清液，每份菌体沉淀用15 ml无菌蛋白胨水重悬，必要时涡旋混匀。将重悬后的菌液合并至同一管或容器中。</li>
	<li>按照第4节方法对储备菌液进行三重复滴定，以确定其滴度。</li>
	<li>如需暂存，可在4 ± 2 °C冰箱中冷藏保存最多2周。使用前需重新测定滴度，参见步骤4.8。</li>
</ol>
2. 血小板制品制备：
<ol>
	<li>在经认证的血库采集一份标准的单采人类血小板制品。该血小板制品必须符合以下采集规格：体积为 90–360 ml，浓度为 0.8–3.8 × 106 血小板/µl。
	<ol>
		<li>确保血小板制品在用于病原体灭活处理前已静置至少 2 小时。在这 2 小时内，将制品储存在 22 ± 2 °C 的血小板孵育箱中且不进行振荡。2 小时后，确保血小板制品在 22 ± 2 °C 的血小板孵育箱中进行振荡。采集后最多在 22 小时内使用该制品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 3 ml 注射器抽取 2 ml 样本，测定血小板制品的 pH22C。使用血气分析仪确保制品的 pH 值 >6.6。使用同一份样本，通过血液学分析仪测定血小板制品的血小板浓度。确保制品符合 0.80–3.8 × 106 血小板/µl 的采集浓度要求。</li>
	<li>目视评估血小板制品的涡旋现象。若制品评分为“0”涡旋，则该制品将被弃用。</li>
	<li>将血小板袋置于直接的白光光源下，轻轻挤压血小板袋。目视观察血小板样本的涡旋模式，并按以下标准进行评分。 
	注：2 – 正向涡旋：整个血袋内可见明显的非均一性涡旋，对比强烈。1 – 中间涡旋：仅在少数区域可见一定程度的非均一性，且对比度较差。0 – 负向涡旋：挤压血小板袋前后均保持浑浊的均一状态。</li>
</ol>
3. 核黄素和紫外光处理过程：
<ol>
	<li>使用无菌管路对接装置，将血小板制品转移至核黄素和紫外光照射及储存袋中。转移完成后，使用管路封口机移除空的血小板采集袋，并将空袋作为生物危害废物丢弃。</li>
	<li>从避光外包装中取出一个35 ml的500 μM核黄素储备液袋。将核黄素试剂盒无菌对接至处理与储存袋的进液管路，让其内容物流入血小板制品中。</li>
	<li>将核黄素袋/处理与储存袋组件悬挂在核黄素袋上，轻轻挤压，将处理与储存袋中的残余空气排入核黄素袋中。确保同时将少量血小板制品也挤入核黄素袋内，以冲洗残留的核黄素进入血小板制品中。让核黄素与血小板混合液回流至处理与储存袋，然后夹闭进液管路。使用管路封口机移除空的核黄素袋，并将其作为生物危害废物丢弃。</li>
	<li>在照射与储存袋的进液管路上无菌对接一段带雌性注射器接头的6”管路。将一个10 ml注射器筒（移除活塞）连接到雌性注射器接头上。</li>
	<li>通过移液器无菌加入5 ml储备细菌至注射器筒中。打开进液管路夹子，使细菌流入血小板制品中。通过让部分血小板制品反流回10 ml注射器筒中，冲洗注射器筒内残留物。随后移除10 ml注射器筒。</li>
	<li>无菌连接一个30 ml注射器，至少冲洗进样口两次，以确保储备细菌充分混入血小板制品中。混合均匀后，使用洁净的5–10 ml注射器抽取2 ml处理前样品。使用新的注射器确保接种或取样步骤中引入的任何空气均被排出。
	<ol>
		<li>按照第4节方法对处理前样品进行滴度测定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从处理与储存袋上移除进液管路，并称量制品重量。</li>
	<li>将制品放入照射仪中，并按照屏幕提示启动标准血小板处理程序。
	<ol>
		<li>输入操作员ID。</li>
		<li>固定并将袋子安装到照射仪压板上。</li>
		<li>使用条形码阅读器或手动输入键盘，在照射仪中输入样品ID。</li>
		<li>扫描产品类型。</li>
		<li>关闭石英夹具。</li>
		<li>照射装置将自动递送6.24 J/ml的能量。典型处理时间为5–10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理完成后，在处理与储存袋的采样球管路上无菌对接一段带雌性注射器接头的6”管路。确保制品充分混匀后，连接一个5 ml注射器，抽取2 ml处理后样品。
	<ol>
		<li>按照第4节方法对处理后样品进行滴度测定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细菌滴度
<ol>
	<li>估算预处理和后处理样品的滴度，并准备相应数量的 5 ml 稀释管，用于对每个样品进行终点连续稀释。无菌操作下，向所需试管中各加入 1.8 ml 蛋白胨水。</li>
	<li>采用 10 倍系列稀释法对每个样品进行滴度测定。无菌操作下，将 0.2 ml 未稀释样品转移至第一个稀释管（10-1）中。涡旋混匀该稀释管，再从中转移 0.2 ml 至下一个稀释管。按所需稀释次数依次完成系列稀释。
	<ol>
		<li>无菌操作下，将每个待涂布稀释液的 100 µl 转移至适当的琼脂平板（表 1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌细胞涂布器，将样品均匀涂布于各琼脂平板表面。</li>
	<li>将平板倒置，并在适当条件下（表 1）培养 1–2 天，期间定期观察菌落生长情况。</li>
	<li>计数含有 30–300 个菌落的平板。菌落数超过 300 的平板记为“太多无法计数”（TNTC）；菌落数少于 30 的平板视为低于定量限（LOQ）。</li>
	<li>计算每个测试样品的滴度，并以 CFU/ml 记录结果。
	<ol>
		<li>使用以下公式计算 CFU/ml： 
		<img alt="菌落计数公式，CFU 计算方法，微生物分析，方程图示" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1"></li>
		<li>若最低稀释度平板上无菌落生长，使用以下公式计算检测限（LOD）： 
		<img alt="公式 N=log(P)/log(1-(v/V))；静态平衡；用于压力与体积分析的公式" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 2"> 
		以及 
		<img alt="检测限公式 LOD=log(N/V)，用于分析化学方程" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 3"> 
		其中： 
		N = 能够以足够置信度检测到产物中最低的颗粒数（CFU）。 
		P = 微生物未被检测到的概率；当检测置信度为 95% 时，P = 0.05。 
		V = 产物总体积（ml） 
		v = 涂布体积（ml）× 平板对应的稀释倍数</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阴性对照：将用于系列稀释的蛋白胨水各取 0.5 ml 涂布于两个琼脂平板上。使用与待测样品相同的平板类型。将平板倒置，并在适当条件下培养 1–2 天，期间定期观察菌落生长情况。
	<ol>
		<li>若任一琼脂平板上观察到菌落生长，则该瓶蛋白胨水必须弃用；且本研究结果亦无效。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阳性对照：对所用细菌标准菌种重新测定滴度。将平板倒置，并在适当条件下培养 1–2 天，期间定期观察菌落生长情况。该滴度应与记录的标准菌种滴度在 ±1.0 log CFU/ml 范围内，研究结果方可视为有效（见第 1.5 节）。</li>
</ol>

<ol><li>Brecher, M. E., Hay, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+contamination+of+blood+components%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacterial contamination of blood components.</a> Clin. Microbiol. Rev. 18 (1), 195-204 (2005).</li>
<li>Brecher, M. E., Holland, P. V., Pineda, A. A., Tegtmeier, G. E., Yomtovian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+bacteria+in+inoculated+platelets%3A+implications+for+bacteria+detection+and+the+extension+of+platelet+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Growth of bacteria in inoculated platelets: implications for bacteria detection and the extension of platelet storage.</a> Transfusion. 40 (11), 1308-1312 (2000).</li>
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</ol>

本文所有作者目前均受雇于Terumo BCT，即Mirasol PRT系统的开发与制造商。&#160; 本视频文章的出版费用由Terumo BCT支付。

细菌筛查已成为血库机构的常规做法，对于许多地区而言，这是预防细菌污染血小板输注的主要方法。尽管细菌筛查通常能够拦截大多数快速生长的革兰氏阴性菌，如S. marcescens、E. coli和E. cloacae，但在检测生长缓慢的革兰氏阳性菌方面存在困难，例如S. aureus、Streptococcus spp.和S. epidermidis8。遗憾的是，这三种革兰氏阳性菌占所有污染血小板制品的50%以上，输注含有这三种微生物的血小板产品已导致患者死亡1。
细菌筛查依赖于血小板制品中的细菌滴度足够高，以确保在典型的4–8 ml筛查样本中至少含有一个细菌。如果细菌滴度不足以使细菌进入4–8 ml的采样体积中，则该单位产品会被错误地标记为阴性，并被放行用于输注。一种替代的细菌筛查方法是采用一种可对所有血小板单位实施的主动处理流程，使污染的微生物失去功能。
本研究中，有意在血小板单位中加入高滴度的细菌，以检测核黄素联合紫外线照射病原体灭活技术的总体灭活能力。尽管本研究中测试的细菌负荷远高于献血时血液制品中通常存在的水平，但该研究有助于证明，核黄素联合紫外线照射技术可显著降低受污染血小板单位中活菌滴度，降低幅度达2.6至5.4个对数级（即污染细菌减少99.7%–99.9996%）（图2）。为获得准确的对数级降低值，操作人员在执行细菌滴度检测步骤时，必须具备良好的无菌操作技术和精确的移液技能。进行连续稀释时若移液不精确，可能导致误差累积，从而造成滴度测量结果不准确。
本研究收集的数据支持了先前关于核黄素与紫外线的研究，该研究针对低水平、具有临床相关性的菌血症（&#60;20 CFU/单位）对系统进行了验证。先前的研究旨在模拟实际的临床污染事件，结果表明，在为期7天的血小板储存期间，核黄素联合紫外线处理能有效阻止细菌生长。基于先前研究数据的建模分析表明，当前对血小板制品细菌污染的风险估计值可能由此降低高达98%8。与细菌筛查方法相比，核黄素和紫外线处理具有更优的表现；当使用具有临床相关性的细菌负荷进行挑战时，细菌筛查方法仅显示出66%的检出有效性8。
与所有技术一样，使用PRT处理血小板制品以预防由细菌污染血小板单位引起的并发症也存在局限性。PRT系统对细菌芽孢无效，且不能灭活内毒素，因此即使PRT系统能够灭活高滴度的革兰阴性菌，残留的内毒素仍可能导致受者发生脓毒性休克。PRT最好在储存早期进行，以防止细菌增殖至高滴度。
综上所述，如这两项研究的综合结果所示，核黄素联合紫外线照射处理在降低革兰氏阴性与革兰氏阳性微生物的细菌负荷方面具有显著效果，可能为细菌筛查提供一种可行的替代方案。常规对血小板制品进行核黄素和紫外线照射处理，还可进一步降低病毒和寄生虫等其他经血传播病原体的潜在传播风险。

血小板、血浆、浓缩红细胞和全血制品的输注在现代医学中发挥着重要作用，可用于治疗多种疾病、补充重要体液，并最终挽救生命。血小板是一种细胞类制品，可从全血中分离后汇集为可输注剂量，也可通过血小板单采术采集获得。血小板在体内的主要功能是在伤口部位止血并维持止血功能。血小板计数低（血小板减少症）的患者易发生自发性出血，需输注血小板以使血小板计数恢复至正常范围。采集后的血小板最长保存时间为5至7天，保存条件为22 ± 2 °C，并需持续轻柔振荡。
尽管血小板输注具有挽救生命的作用，但由于这些制品可能被寄生虫、细菌和病毒污染，受血者仍面临轻微风险11。病毒核酸扩增检测（NAT）的应用已显著降低了主要经血传播病毒（如丙型肝炎病毒（HCV）、乙型肝炎病毒（HBV）和人类免疫缺陷病毒（HIV））的传播风险5。加拿大血液服务中心最近一项发表的研究估计，HIV、HCV和HBV的残余风险分别为每800万次献血中1例、每670万次献血中1例以及每170万次献血中1例15。
尽管细菌在公众中通常受到的关注较少，但血小板制品中细菌污染的发生率估计高达1:1,0007，由于每年有数百万份血小板制品被输注，许多受血者因此暴露于败血症等可能危及生命的并发症风险之中6。研究表明，污染发生时的细菌负荷较低，&#60;100 菌落形成单位（CFU）/制品2,16，但由于血小板制品富含营养且在室温下储存，污染的细菌在输注前可大量增殖至危险水平。目前，防止细菌污染制品进入受血者的唯一获批方法是使用基于培养的检测系统和快速床旁检测。简而言之，在基于培养的系统中，血小板制品在22 °C下于振荡器上储存12–24小时，以促进制品中细菌的增殖；随后从血小板制品中取出4–8 ml样本，接种至含有营养培养基的培养瓶中。将培养瓶放入仪器中，由仪器监测细菌生长情况。若仪器检测到培养瓶中有细菌生长，则发出警报，相应血小板单位即被废弃。尽管该方法对生长迅速的微生物检测效果相对较好，但许多生长缓慢的菌种无法增殖至足够高的滴度而被检出，从而可能导致假阴性单位被放行用于输注7,12,14,16,22。与基于培养的检测系统不同，快速床旁检测通常在血小板储存后期进行，此时细菌负荷已显著增加。由于床旁检测的灵敏度低于基于培养的系统，需达到较高滴度才能可靠检出细菌，通常需达到 ≥1 × 103 CFU/ml17。然而，此类检测可在采样后1小时内提供结果。这些检测方法在性能上的差异曾导致假阴性制品被放行，进而引发受血者致命性败血反应9。
应对血小板制品细菌污染问题的另一种方法是常规采用病原体灭活工艺，该工艺可直接灭活污染的细菌，而非试图检测其存在。研究表明，使用核黄素作为光敏剂并结合紫外线照射，可降低多种经血液传播的病原体（包括细菌）的感染性3,4,8,10,19-21。采用核黄素与紫外线进行病原体灭活具有无毒性和非致突变性，且经核黄素和紫外线处理的血液成分已被证实对输血受者以及血液制品操作人员均是安全的18。简而言之，核黄素分子可与细菌、寄生虫、病毒及任何有核细胞（例如 白细胞）中的核酸（DNA 和 RNA）结合。紫外线照射可激活核黄素，导致核酸功能基团（主要是鸟嘌呤碱基）发生化学改变，从而阻断核酸的复制和/或转录，使病原体失活13。由于血小板和红细胞为无核细胞，不含核酸，因此不受核黄素化学反应的影响。
先前关于核黄素和紫外光技术的研究采用了一种实验设计，旨在模拟被具有临床相关细菌载量污染的血小板制品，并针对一组特定细菌进行了评估&#60;20 个菌落形成单位/产品8本研究的目的是评估核黄素与紫外线照射法对高滴度细菌污染的处理效果（&#62;1.0 × 105 CFU/ml）的血小板制品中，以测定系统对细菌的总体灭活能力。数据基于血液安全监测研究的收集结果1，本研究选择了一组常见的革兰阴性菌和革兰阳性菌进行评估，包括以下物种： 表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，缓症链球菌，化脓性链球菌，粘质沙雷菌，小肠结肠炎耶尔森菌，北美布鲁菌，蜡样芽孢杆菌 （营养体形态），大肠杆菌，铜绿假单胞菌 和 肺炎克雷伯菌. 所有生物，除了 B. cereus，购自ATCC，并优先选择那些已确认自血液成分中分离出的细菌菌株。 B. cereus 本研究中检测的菌株是从受污染的血小板制品中内部分离得到的临床菌株。

<table><tbody><tr><td>米拉索尔照明仪</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>米拉索尔处理/储存袋</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>血液学分析仪</td><td>贝克曼库尔特</td><td>Ac&amp;bull;T diff&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>血气分析仪</td><td>西门子</td><td>RapidLab 1265&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>无菌对接装置</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>血小板孵育箱</td><td>Helmer</td><td>PC2200</td><td></td></tr><tr><td>轨道振荡孵育器</td><td>Lab-Line</td><td>4628</td><td></td></tr><tr><td>干式孵育箱</td><td>费舍尔</td><td>Iso-temp</td><td></td></tr><tr><td>II级A/B3型生物安全柜</td><td>Thermo-forma</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>管路封口机</td><td>Sebra</td><td>Smart Sealer II</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>IEC</td><td>Centra GP8R</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>30 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 稀释管</td><td>VWR</td><td>211-0058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Gilson</td><td>P-200</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Rainin</td><td>R-200</td><td></td></tr><tr><td>重复移液器</td><td>Eppendorf</td><td>4780</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;micro;l 滤芯吸头</td><td>Costar</td><td>4810</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 一次性血清移液管</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 一次性血清移液管</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>35 ml 500 &amp;micro;M 核黄素</td><td>Terumo BCT</td><td>35 mL 500 &amp;micro;M&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>含5%马血的布鲁氏菌琼脂</td><td>BBL</td><td>221547</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸液</td><td>Teknova</td><td>B9993</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨水</td><td>BD</td><td>257087</td><td></td></tr><tr><td>胰酶大豆肉汤</td><td>BD</td><td>299113</td><td></td></tr><tr><td>胰酶大豆琼脂</td><td>Remel</td><td>R01917</td><td></td></tr><tr><td>热灭活马血清</td><td>吉布科</td><td>26050</td><td></td></tr></tbody></table>

核黄素联合紫外光处理血小板制品：对高滴度细菌污染的灭活效果

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

血小板制品被细菌污染长期以来一直被视为重要的输血风险，这与其捐献后的储存条件有关。血小板制品通常在22 °C条件下置于振荡摇床中保存，这种环境可能促进细菌生长。尽管进入血小板制品中的细菌总量极低，但在输注前这些细菌可能大量增殖，从而导致严重的不良反应事件。本研究旨在评估一种基于核黄素的病原体灭活工艺对一组已知常见血小板制品污染菌的灭活效果。该菌株组合包括以下微生物：S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa 和 K. pneumoniae。每单位血小板均接种高浓度细菌，并在处理前后分别取样。采用终点稀释法进行菌落形成单位测定，以确定处理前和处理后的细菌滴度。通过从处理前滴度中减去处理后滴度计算对数减少量。观察到的对数减少值如下：S. epidermidis 4.7 log（99.998%）、S. aureus 4.8 log（99.998%）、S. mitis 3.7 log（99.98%）、S. pyogenes 2.6 log（99.7%）、S. marcescens 4.0 log（99.99%）、Y. enterocolitica 3.3 log（99.95%）、B. neotomae 5.4 log（99.9996%）、B. cereus 2.6 log（99.7%）、E. coli ≥5.4 log（99.9996%）、P. aeruginosa 4.7 log（99.998%）以及 K. pneumoniae 2.8 log（99.8%）。本研究结果表明，该工艺可能有助于降低与细菌污染相关的严重输血不良事件的风险。

采用基于核黄素和紫外光的病原体灭活技术（PRT）评估了对11种不同细菌物种的灭活效果。这些细菌代表了血小板制品中较为常见的污染物，包括5种革兰氏阳性菌和6种革兰氏阴性菌。每种细菌至少检测了6份血小板制品，每份制品接种的细菌量足以达到目标浓度 &gt;1.0 × 105 血小板制品中细菌的最终滴度（CFU/ml）。处理前取样测定处理前滴度，随后立即对血小板制品进行核黄素联合紫外光处理。血小板制品处理后，观察到以下对数值降低： S. epidermidis 4.7 log（99.998%），金黄色葡萄球菌 4.8 log（99.998%），S. mitis 3.7 log（99.98%），S. pyogenes 2.6 log（99.7%），粘质沙雷菌 4.0 log（99.99%），小肠耶尔森菌 3.3 log（99.95%），B. neotomae 5.4 log（99.9996%），B. cereus 2.6 log（99.7%），大肠杆菌 ≥ 5.4 对数（99.9996%），P. aeruginosa 4.7 log（99.998％）和 K. pneumoniae 2.8 log（99.8％）（图2）。所有单位均符合上述核黄素和紫外光处理的系统规格。额外的降低测试已进行 S. pyogenes 使用来自血沉棕黄层的血小板。在减少程度上未观察到显著差异。 S. pyogenes 在白膜层来源的血小板与单采血小板之间的比较（数据未显示）。
<img alt="微生物生长条件表；包含生物体、ATCC、革兰氏类型、培养基、培养条件。" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 
表 1：使用核黄素和紫外光评估的细菌物种的生长条件。本研究选取了一组已证实可污染血小板制品的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。表中列出了用于扩增和滴定这些微生物的生长条件（温度和培养基类型）。
<img alt="Blood sterilization process diagram; riboflavin UV treatment; transfusion preparation steps." src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1：核黄素与紫外光病原体灭活过程. 将核黄素溶解于0.9%生理盐水中，理论浓度为 500 µM溶液经无菌连接后注入每份血小板制品中。将细菌无菌接种至每份血小板单位，随后以6.2 J/ml的紫外光能量（约6–10分钟）进行处理。在此 体外 治疗后对血小板制品进行取样，以测定最终的细菌滴度。
<img alt="细菌减少量图表；核黄素与紫外线处理，log10减少数据，不同菌种比较。" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2：使用核黄素与紫外线处理对不同细菌种类的灭活效果。采用核黄素联合紫外线照射以降低血小板制品中常见细菌污染物的载量。log10减少值为处理前平均滴度与处理后平均滴度之间的差值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

血小板制品的储存条件为细菌污染物的增殖提供了理想的环境，可使其达到危险水平。本研究旨在利用菌落形成实验，评估一种基于核黄素的病原体灭活工艺对人血小板制品中高滴度细菌污染的灭活效果。

血小板制品因献血后储存条件的原因，其细菌污染问题长期以来一直被视为重要的输血风险。

本实验的总体目标是评估基于核黄素和紫外线的病原体灭活工艺在减少血小板制品中常见细菌污染物方面的效果。首先需制备高滴度的细菌储备液，其次获取人血小板制品并评估其细胞质量。接下来，将血小板单位加入核黄素，并接种已知浓度的细菌。最后一步是用紫外光处理该单位。最终，通过终点稀释涂板法检测处理前和处理后样品中的可存活细菌，比较其数量以测定细菌的减少程度。与现有的细菌筛选等方法相比，该技术的主要优势在于核黄素联合紫外光能够灭活其他病原体，如H-I-V、H-C-V、疟疾和巴贝西虫。该技术的意义不仅限于血液传播的病原体，因为它还能够灭活白细胞和捐赠的血液制品，而这些成分与输血相关的不良事件（如输血相关移植物抗宿主病）有关。我最初是在研究化合物——特别是光化学化合物与核酸相互作用的过程中，产生了利用该方法灭活血液中病原体的想法。该技术基于一个事实：病原体与红细胞、血小板及血浆蛋白不同，含有对疾病复制和传播至关重要的基因组核酸。因此，通过靶向存在于血液制品环境中的核酸化学结构，我们能够更选择性地灭活病原体，同时保持红细胞、血小板和血浆蛋白成分的质量。以下为该操作步骤的演示。今天由实验室科学家 Nick HOA 和实验室技术员 Denise Gilmore 进行操作。首先，准备一个无菌的 250 毫升瓶，内含 100 毫升适用于目标细菌的生长培养基。使用无菌接种环，从划线培养平板上挑取单个细菌菌落，接种至培养基中。接下来，将瓶子放入摇床培养箱中。设置摇床转速为 140 RPM，培养菌液一至两天。定期检查菌液的细菌生长情况。孵育后，将细菌悬液转移至两支无菌的15毫升锥形管中。在23摄氏度下，以3000 ×g离心20分钟。随后，吸除上清液，并用15毫升无菌肽水重悬细菌沉淀。涡旋振荡各管以促进悬浮，然后将重悬的细菌培养物合并，以浓缩储备培养物。取五支稀释管，每管加入1.8毫升肽水。取200微升未稀释样品加入第一管中，涡旋振荡该管，然后转移200微升至下一管。重复操作直至达到适当的稀释倍数。取每种稀释液100 µL，转移至相应的琼脂平板中。使用无菌涂布棒，均匀涂布，使样品在AER平板上分布均匀，作为阴性对照平板。将500微升肽水分别加入两个琼脂平板中。使用无菌细胞涂布器将样品在平板表面均匀涂布，将所有平板倒置，并在适当温度下孵育一至两天。若任一阴性对照平板上观察到菌落生长，则表明肽水已被污染，滴度无效。如果阴性对照平板结果为阴性，则计数所有菌落数在30至300之间的平板上的菌落。然后计算每个测试样本的滴度，并记录结果，以每毫升菌落数表示。将细菌培养物在4°C条件下冷藏保存，最多可保存两周。为确保准确性，使用前需重新测定培养物的滴度。获取一份标准的单采人类血小板制品，体积为90至360毫升，浓度为每微升0.80至380万个血小板。将血袋置于22摄氏度的血小板培养箱中静置至少2小时，随后在使用前以60 RPM轻轻振荡。取2毫升血小板制品样本，在22摄氏度下使用血气分析仪检测，确保pH值高于6.6。使用同一样本，通过血液学分析仪测定血小板浓度，确保其处于理想范围内。接下来，将血小板袋置于直接的白光光源下进行目视检查。轻轻挤压血袋并观察样品的旋涡状流动模式。若挤压前后样品仍呈现浑浊且不均匀的状态，则不得使用该血小板，并避免将其连接至管路对接装置。将血小板转移至含核黄素并用于紫外线照射及储存的血袋中。使用管路封口机移除空的血小板袋，并将其作为生物危害废物丢弃。接下来，打开500微摩尔核黄素储备液无菌外层避光包装。将核黄素袋连接至处理与保存袋的进液管路，然后将内容物排入血小板单元中。然后将处理袋组件悬挂在核黄素袋上。轻轻挤压，将处理袋中残留的空气压入核黄素袋中。用少量血小板制品冲洗残留的核黄素，使其流入血小板袋中。让核黄素和血小板溶液回流至处理袋中。然后夹闭进液管路。使用管路封口器取下空的核黄素袋，并妥善丢弃空袋。保持无菌。将一端带有雌性注射器接头的六英寸导管连接到照明和储存袋的进液管上。将一个10毫升的注射器筒连接到该导管上。随后，向注射器筒中加入5毫升细菌柄状体悬浮液。然后打开进液管夹，使细菌流入血小板制品中。通过让部分血小板制品回流，冲洗注射器筒。冲洗后，取下注射器筒。连接一个30毫升注射器，在产品充分混合后至少冲洗进样口两次。使用一个干净的5毫升注射器抽取2毫升预处理样品。使用新的注射器抽出引入袋中的任何空气。然后从处理袋上取下进液管，并称量血小板溶液。开始血小板处理时，首先输入操作员编号，然后将处理袋安装到照射仪板上。接下来，使用条形码读取器输入样本编号。输入产品类型，并将其重量输入软件。然后，闭合石英夹具，以自动递送每毫升6.24焦耳的紫外能量。典型处理时间为5至10分钟。同时，对经紫外线处理后的预处理样品进行滴定，对处理后样品进行滴定以检测细菌存活率，并对储备细菌培养物进行滴定作为阳性对照。储备培养物的滴定值应在其记录滴定值的±1个对数单位CFU/毫升范围内。采用核黄素和基于紫外线的病原体灭活技术工艺，评估了11种不同细菌种类的灭活效果。每种微生物至少评估了六个血小板制品，并对每个制品进行接种。在处理前以及使用核黄素和紫外光处理后，均采集样本进行检测；当初始细菌浓度足够高时，处理前样本的终末滴度超过每毫升10,000 CFU。与处理前溶液相比，经核黄素和紫外光处理后，所有细菌负荷均至少降低了2.6个对数单位，相当于减少了约400倍。在完成高滴度细菌的上述研究后，可进一步使用更具临床相关性的接种滴度进行额外研究。这些滴度实际上代表了捐献时产品中可能存在的细菌水平。低滴度接种研究的目的是评估该方法抑制细菌生长的能力，以及在室温下长期储存期间维持产品无菌培养状态的能力。随着该技术的引入，研究人员和医疗专业人员得以评估其对多种病原体的灭活能力，并利用该技术预防经输血传播的疾病。观看本视频后，您应能够充分理解如何测定经核黄素和紫外光处理的高污染血小板制品中细菌的对数减少量。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

治疗核黄素血小板制品和紫外线光：对有效性高滴度细菌污染

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核黄素联合紫外光处理血小板制品：对高滴度细菌污染的灭活效果

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