小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养条件下的神经分化

本实验的总体目标是在无血清的单层细胞培养条件下，将小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经谱系细胞。该过程首先用明胶包被培养容器；第二步，将胚胎干细胞重悬于分化培养基中形成单细胞悬液，并稀释至适当的接种密度。

最后一步，将细胞接种到包被有 gel ENC 的培养板上。最终，通过免疫荧光显微镜观察目标神经标志物，以确认分化是否成功。通常情况下，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为接种密度是否合适对获得良好的分化效果至关重要。

有多个因素会直接或间接地影响铺板密度。在铺板细胞前，将一份1%明胶置于37摄氏度水浴中加热至溶解。然后将明胶与500毫升预热的PBS混合，并用适量该溶液覆盖细胞培养容器底部，确保表面被充分包被，同时明胶正在完成包被过程。

用 PBS 将小鼠胚胎干细胞亚融合培养物冲洗两遍。然后向培养物中加入 1 毫升解离试剂。孵育 2 至 5 分钟后，轻敲培养容器，使单层细胞脱落形成单细胞悬液，并将培养物与细胞解离试剂共同收集至总体积为 10 毫升的培养基中。

将细胞转移至一个50毫升的锥形管中，在离心机中离心沉淀。随后小心吸除上清液，用10毫升预热的N2/B27培养基轻拍管壁重悬细胞沉淀。为避免产生气泡，立即计数细胞并记录浓度，然后根据表格要求，用预热的N2/B27培养基将细胞重悬至每孔每单位体积所需的适当细胞数量。

然后吸除培养容器中的明胶，接种细胞时不要晃动容器。将培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中。每1至2天更换一次培养基。

使用新鲜的 N two B 27 培养基，细胞将在 4 到 6 天内开始分化并表现出袜状一型表达，可用于免疫荧光成像染色。从培养物中移除分化培养基，并在 500 微升 4% 多聚甲醛中固定细胞 15 分钟，随后用含吐温的 2 毫升 PBS 洗涤并通透细胞两次。然后将细胞在室温下孵育 1 小时，以封闭非特异性结合位点。

在洗涤细胞后，于培养板摇床上用含血清的 PBS Tween 溶液中孵育一毫升。加入 500 µL 针对 βIII 微管蛋白的小鼠 IgG 抗体，于 4°C 在培养板摇床上过夜孵育。第二天。

洗涤细胞后，将样品在室温下避光、摇床上孵育一小时，加入荧光标记的抗-US IgG二抗。再次冲洗细胞，并在500微升DPI中染色五分钟。最后，再次洗涤细胞一次后，将其置于PBS Tween中，在4摄氏度下保存最多两周。

直至成像。在本实验中，使用带有内源性 SOX1 GFP 报告基因的小鼠胚胎干细胞来追踪神经分化。在第6天，对细胞进行固定并用神经元标志物 beta three tubulin 染色。

在最佳密度下，细胞会分化为神经前体细胞和神经元，而密度过高则会导致 SOX1 GFP 阳性细胞和 βIII 微管蛋白阳性细胞数量减少。细胞培养容器的体积也会影响最佳接种密度。例如，在 96 孔板中培养的细胞所需的细胞密度约为其他容器的 10 倍。

将细胞接种于六孔培养板中，以达到最佳及两种不同汇合度的细胞密度。在分化过程中，胚胎干细胞的形态逐渐发生变化。例如，在这些图像中，可以观察到在最佳细胞密度下接种后第1天至第6天细胞及克隆形态的变化。

第四天，细胞开始转变为神经前体细胞，这可通过 SOX1-GFP 报告基因发出的绿色荧光信号得以证实。到第六天，大多数细胞均呈 SOX1 阳性。尽管仍可能存在少量非神经细胞。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在单层细胞培养体系中启动小鼠胚胎干细胞的神经分化过程。