追踪药物诱导Colocalizational变化分析受体后内部贩运

以下实验的总体目标是定量评估靶标对的空间共定位，在这种情况下，检查药物诱导的受体运输。这是通过用药物处理活培养细胞以诱导改变的受体运输来实现的。作为第二步，靶受体和细胞内运输隔室的双重免疫标记允许接下来通过多通道共聚焦显微镜对靶对进行空间定位。

定量共定位分析用于测量在同一位置发现目标受体和隔室的趋势。结果显示基于受体和细胞内运输隔室共定位的药物治疗后受体运输的变化。与叠加共定位等现有方法相比，该技术的主要优点是它提供了共定位的量化测量，从而允许更强大的分析和更复杂的实验设计。

虽然这种方法可以提供对受体运输的见解，但它也可以应用于培养细胞中几乎两种蛋白质的空间共定位的变化。要开始此过程，请去除原始生长培养基，并将其替换为含有所选浓度的目标药物的培养基。接下来，在原始生长条件下孵育细胞，保持选定的处理持续时间。

孵育后，用 1 毫升洗涤缓冲液轻轻洗涤细胞，每次 3 次。用 300 微升 4% 对位甲醛的 0.1 摩尔 PBS 溶液在 37 摄氏度下固定细胞 10 分钟。然后用 1 毫升洗涤缓冲液再次洗涤细胞，每次 3 次。

随后，将细胞在 300 μL 封闭缓冲液中在室温下孵育 2 小时。然后，将细胞与一抗在 300 μL 抗体稀释剂中在 4 °C 下孵育 48 小时。然后用 1 毫升洗涤缓冲液轻轻洗涤细胞，每次 3 次。

接下来，将细胞与与 Fluor 偶联的二抗在 300 μL 抗体稀释液中室温孵育 1 小时，并保护细胞避光。1 小时后，用 1 毫升洗涤缓冲液轻轻洗涤细胞，每次 3 次。要从 24 孔板上取下盖玻片，请将板保持 45 度。

将一对细镊子的尖端放在盖玻片的顶部边缘与井底相接的位置。然后轻轻地将洗涤缓冲液中的盖玻片倾斜，使其远离井底。盖玻片将靠在井壁上，在那里可以很容易地用镊子去除。

然后使用 100 倍高放大倍率物镜将盖玻片，细胞朝下安装在带有防褪色封固剂的显微镜载玻片上。首先，使用 epi 荧光定位要成像的代表性细胞。接下来，配置图像捕获设置 Record 8 bit uncompressed tiff images of each labeled channel（记录每个标记通道的 8 位未压缩 tiff 图像），以按顺序对每个通道进行成像，并对最终图像进行平均 4 到 6 次扫描。

然后切换到共聚焦成像路径，并聚焦在通过细胞中心的 Z 平面上。优化每个通道的针孔激光功率和光电倍增管电压和偏移。记录这些设置并使用相同的设置对任何给定目标对标记的所有细胞进行成像。

在同一个 Replicate next 定位器细胞中，要使用高倍率物镜进行成像。使用落射荧光，切换到共聚焦成像路径，并聚焦在通过细胞中心的 Z 平面上（如果可用）。使用软件缩放裁剪功能将扫描区域限制为感兴趣的单元格。之后。

使用先前建立的设置捕获每个标记通道的图像，然后重复这些过程以对每个重复的每个条件 15 个或更多细胞进行成像。确保样本采集充足。在此过程中，打开图像 J 中单元格的图像对。使用图像颜色合并通道命令生成 RGB 图像。

然后在感兴趣的单元格周围绘制。使用图像 j 插件 SC 共定位来量化所选单元格中目标的共定位。记录所需的共定位测量并对每个图像单元重复该过程。

接下来，计算每个标记条件的每个重复的共同控制条件的记录共定位值的平均值。将均值乘以减 1 以产生每个标记条件下每个重复的偏移量。然后将每个标记条件中每个仿行的偏移量添加到该仿行中的每个共定位值。

这将对数据进行归一化，以便在每个标记条件的每个重复中，共同控制条件的平均共定位度量为零。之后，来自每个标记条件的所有重复的所有数据将允许分析跨重复的共定位变化 这里显示的是暴露于长期和急性药物治疗的背根神经节感觉神经元的原代培养物。然后对细胞进行 δ 阿片受体和具有不同一抗对的回收内体标志物的免疫标记，并通过双通道顺序共聚焦显微镜成像。

除了随后的定量共定位和分析外，还处理了这些代表性图像以生成此处所示的假彩色共定位图。在接受不同急性药物治疗的组之间比较 δ 阿片受体的平均共定位评分和早期内体回收内体和溶酶体受体与每个区室的标志物，并观察药物诱导的受体运输变化。在尝试此过程时，请务必记住获取高质量一致的显微照片，以便进行有效的定量分析。

观看此视频后，您应该对如何进行定量共定位分析有很好的了解。