Name: 触发反应胶质细胞增生在体内由前脑锐器伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学习通过前脑锐器伤诱导成年小鼠反应性胶质细胞增生的方法。该手术技术无需额外设备即可创建机械性损伤，便于通过免疫组织化学和生化分析研究胶质瘢痕形成的细胞和分子机制。

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感谢凯瑟琳·克拉克提供技术支持。A.D.R.G. 的研究部分由项目 5K01MH097957-03 资助。

本方案使用混合C57BL/6背景的成年（3-4月龄）雄性小鼠。动物维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，并可自由获取食物和水。本方案中进行的所有操作均根据德雷塞尔大学机构动物护理和使用委员会批准的协议执行。
1. 手术区域准备
<ol>
	<li>用70%乙醇对手术台进行消毒，然后用吸水垫覆盖整个手术台面，并将手术器械放置在立体定位仪旁边。</li>
	<li>设置不带操作臂的立体定位设备。将加热垫置于立体定位仪上，并调节至37 °C。为避免动物过热，可在动物与加热垫之间放置一小片纸巾或手术垫。</li>
	<li>使用已灭菌的剪刀，将已灭菌的明胶海绵剪成小块，放入含有&#160;0.9%无菌生理盐水的无菌培养皿中，备用。 
	注意：使用已灭菌的器械和无菌手术用品，以维持无菌操作环境。在实验过程中或不同动物之间，根据需要将手术器械浸入玻璃珠灭菌器中10-15秒，进行重新灭菌。根据需要，用手揉搓70%乙醇以消毒，全程保持手套清洁。</li>
</ol>
2. 手术前小鼠的准备
<ol>
	<li>将小鼠从饲养笼中取出并称重（g）。</li>
	<li>将小鼠放入异氟烷诱导室，设置氧气流速为 2 L/min，异氟烷蒸发器浓度为 5%，以诱导进入手术麻醉状态，约需 3–5 分钟。观察呼吸减慢和身体不动，通过脚趾夹捏反射确认小鼠已完全麻醉。</li>
	<li>当小鼠完全麻醉后，将其固定于立体定位仪上，将鼻部放入与异氟烷管路相连的鼻锥中。将耳棒插入耳道并拧紧，确保头部稳定不动。</li>
	<li>剃除从一侧耳到另一侧耳、以及从两眼之间至耳后区域的头部毛发。</li>
	<li>使用异丙醇和聚维酮碘溶液交替擦拭皮肤进行消毒，每种溶液各擦拭三次。</li>
	<li>在双眼表面涂抹人工泪液，以防止手术过程中角膜干燥。</li>
</ol>
3. 手术步骤
<ol>
	<li>通过捏压小鼠脚趾或尾巴来监测麻醉深度。当小鼠无反应且呼吸缓慢均匀时，表明其已达到适当的手术麻醉平面。</li>
	<li>使用11号手术刀片，从眼睛后方开始，向接近两耳之间位置，沿矢状面一侧做一条单一、果断的皮肤切口。将皮肤向一侧推开，并用止血钳夹住右侧固定。</li>
	<li>使用11号手术刀片的钝面和棉签清除颅骨表面的覆盖膜。可选步骤：用浸有0.9%生理盐水的棉签擦拭颅骨表面，然后彻底晾干。</li>
	<li>使用小尺子，以冠状缝后方1 mm处标记开颅区域的前界，以矢状缝外侧1 mm处标记开颅区域的左边界（图1），并用永久性记号笔标出。随后，分别从矢状缝和冠状缝起向外4 mm处标记开颅区域的右界和后界（图1）。</li>
	<li>使用0.5 mm钻头，沿永久记号笔标记的轮廓缓慢钻孔，开始进行开颅操作。注意不要完全穿透颅骨。用5号镊子轻轻按压分离出的顶骨部分，薄弱区域会在压力下破裂。当钻薄的骨片在整个边缘区域均足够脆弱时，即可准备将其移除。 
	注意：若研究者在完整取出骨片时遇到困难，提示钻孔过程中骨片未充分变薄。建议在后续动物实验中进一步钻孔，以便更轻松地移除骨片。</li>
	<li>使用装有23 G针头的10 ml注射器，滴加少量0.9%生理盐水，润湿已分离的骨片及钻孔区域。</li>
	<li>将操纵臂连接至立体定位仪设备上。将新的11号手术刀片安装到探针夹持器上，使刀片锋利边缘朝向前脑方向（头侧）。 
	注意：尽管刀片在穿入过程中，头侧和尾侧组织分别接触刀片的锋利和钝边，但由此产生的机械损伤在整个损伤范围内是相似的。我们在反应性胶质增生的主要特征（包括GFAP表达上调或细胞增殖）方面，未观察到头侧与尾侧切片之间存在明显差异。</li>
	<li>将操纵臂移开操作区域，小心使用5/45角度镊子抬起已分离的骨片。将镊子尖端插入骨片侧面，利用杠杆作用一次性完整地撬起并移除残留的骨片。 
	注意：操作时需小心，避免刺伤脑组织或扰动颅骨下方的硬脑膜。</li>
	<li>取一小块浸湿的可吸收明胶海绵，放置于暴露的脑组织表面，以防止脑组织干燥，并吸收可能存在的血液。</li>
	<li>明胶海绵放置妥当后，将操纵臂移至操作位置，并调整刀片使其对准明胶海绵上方开颅区域的中心。移除明胶海绵，缓慢降低刀片，直至刀尖接触硬脑膜但未穿破硬脑膜。使用立体定位仪垂直臂上的游标尺标记背腹向坐标。</li>
	<li>通过操纵臂，将刀片精确地缓慢下放3 mm进入脑组织。此过程需借助操纵臂上的游标刻度完成。让刀片在原位停留5–10秒。随后，将带有刀片的立体定位臂从前脑向后脑方向来回移动三次，在每次移动至末端前，确保刀片到达开颅区域的头侧和尾侧边界。 
	注意：插入刀片前不需预先切除硬脑膜。与厚度约为80 μm的大鼠硬脑膜7相比，小鼠硬脑膜明显更薄（仅数个细胞层厚），在刀片插入过程中不会产生明显阻力。为确保每只动物受到一致的损伤，每次实验均应使用新的手术刀片。</li>
	<li>缓慢抬起立体定位臂，将刀片从脑组织中退出。刀片取出后，立即在脑表面放置另一块明胶海绵，以吸收任何多余的血液或液体。</li>
	<li>同时，取下立体定位臂，并丢弃11号手术刀片。待出血停止后，移除明胶海绵。</li>
	<li>使用不可吸收缝线（如Ethilon或Prolene）缝合皮肤以关闭切口。缝线应在术后9–10天拆除。</li>
	<li>将小鼠放回其饲养笼中，置于加热垫上缓慢恢复，并密切监测是否有任何痛苦迹象。在停止异氟烷麻醉后，小鼠通常在2–5分钟内恢复意识。在动物恢复胸卧位之前，不得无人看护。</li>
	<li>皮下注射0.5–1 ml乳酸林格液，以确保动物充分水合。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>手术后密切监测动物，直至从麻醉中恢复，然后将其送回种群。
	<ol>
		<li>为减轻术后疼痛和不适，手术结束后立即通过腹腔注射给予0.05–0.1 mg/kg的丁丙诺啡。</li>
		<li>术后观察动物2–3天，注意是否存在严重痛苦迹象，如活动受限、缺乏理毛行为或体重减轻。若动物出现上述任何痛苦迹象，应实施安乐死并从研究中剔除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为检查受损组织的组织病理学，采用标准心脏灌注法对动物实施安乐死。
	<ol>
		<li>简言之，使用过量的氯胺酮/赛拉嗪麻醉动物，随后经心脏灌注15–20 ml&#160;0.9% NaCl，或直至肝脏血液完全清除，实验结束时再灌注60 ml&#160;4%多聚甲醛。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取出脑组织，在4%多聚甲醛中后固定2–4小时，然后转移至30%蔗糖溶液。使用冷冻切片机将脑组织切成40–60 µm切片，并按照标准组织学或免疫组织化学流程处理，或参照Garcia8,9所述方法进行。</li>
</ol>

<ol><li>Hamby, M. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+as+therapeutic+targets+for+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes as therapeutic targets for CNS disorders.</a> Neurotherapeutics. 7 (4), 494-506 (2010).</li>
<li>Bush, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+infiltration%2C+neuronal+degeneration%2C+and+neurite+outgrowth+after+ablation+of+scar-forming%2C+reactive+astrocytes+in+adult+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Leukocyte infiltration, neuronal degeneration, and neurite outgrowth after ablation of scar-forming, reactive astrocytes in adult transgenic mice.</a> Neuron. 23 (2), 297-308 (1999).</li>
<li>Faulkner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+protect+tissue+and+preserve+function+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).</li>
<li>Okada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+Stat3+or+Socs3+discloses+a+dual+role+for+reactive+astrocytes+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury.</a> Nature Medicine. 12 (7), 829-834 (2006).</li>
<li>Voskuhl, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Astrocytes+Form+Scar-Like+Perivascular+Barriers+to+Leukocytes+during+Adaptive+Immune+Inflammation+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive Astrocytes Form Scar-Like Perivascular Barriers to Leukocytes during Adaptive Immune Inflammation of the CNS.</a> Journal of Neuroscience. 29 (37), 11511-11522 (2009).</li>
<li>Burda, J. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Gliosis+and+the+Multicellular+Response+to+CNS+Damage+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reactive Gliosis and the Multicellular Response to CNS Damage and Disease.</a> Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).</li>
<li>Maikos, J. T., Elias, R. A., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+dura+mater+from+the+rat+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of dura mater from the rat brain and spinal cord.</a> Journal of neurotrauma. 25 (1), 38-51 (2008).</li>
<li>Garcia, A. D., Doan, N. B., Imura, T., Bush, T. G., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP-expressing+progenitors+are+the+principal+source+of+constitutive+neurogenesis+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GFAP-expressing progenitors are the principal source of constitutive neurogenesis in adult mouse forebrain.</a> Nat Neurosci. 7 (11), 1233-1241 (2004).</li>
<li>Garcia, A. D., Petrova, R., Eng, L., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+discrete+populations+of+astrocytes+in+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates discrete populations of astrocytes in the adult mouse forebrain.</a> J Neurosci. 30 (41), 13597-13608 (2010).</li>
<li>Amat, J. A., Ishiguro, H., Nakamura, K., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+diversity+and+kinetics+of+proliferating+microglia+and+astrocytes+following+cortical+stab+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Phenotypic diversity and kinetics of proliferating microglia and astrocytes following cortical stab wounds.</a> Glia. 16 (4), 368-382 (1996).</li>
<li>Hozumi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+prosaposin+ameliorates+spatial+learning+disturbance+and+reduces+cavity+formation+following+stab+wounds+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Administration of prosaposin ameliorates spatial learning disturbance and reduces cavity formation following stab wounds in rat brain.</a> Neuroscience letters. 267 (1), 73-76 (1999).</li>
<li>Ness, R., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+cells+modulate+the+neurite+growth+promoting+properties+of+astrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal cells modulate the neurite growth promoting properties of astrocytes in vitro.</a> Glia. 19 (1), 47-57 (1997).</li>
<li>Byrnes, K. R., Fricke, S. T., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+differences+between+rats+and+mice+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+magnetic+resonance+imaging+%3A+JMRI%22%5BJournal%5D)">Neuropathological differences between rats and mice after spinal cord injury.</a> Journal of magnetic resonance imaging : JMRI. 32 (4), 836-846 (2010).</li>
<li>Steward, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neurotrauma+research%3A+opportunities+and+potential+pitfalls+of+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neurotrauma research: opportunities and potential pitfalls of murine models.</a> Experimental neurology. 157 (1), 19-42 (1999).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Hanisch, U. -K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li>
<li>Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debris+clearance+by+microglia%3A+an+essential+link+between+degeneration+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration.</a> Brain. 132 (2), 288-295 (2008).</li>
<li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+Barrier+to+Regeneration+in+the+CNS%3A+Activated+Macrophages+Induce+Extensive+Retraction+of+Dystrophic+Axons+through+Direct+Physical+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Another Barrier to Regeneration in the CNS: Activated Macrophages Induce Extensive Retraction of Dystrophic Axons through Direct Physical Interactions.</a> Journal of Neuroscience. 28 (38), 9330-9341 (2008).</li>
<li>Ip, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Cells+Contribute+to+Myelin+Degeneration+and+Axonopathic+Changes+in+Mice+Overexpressing+Proteolipid+Protein+in+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immune Cells Contribute to Myelin Degeneration and Axonopathic Changes in Mice Overexpressing Proteolipid Protein in Oligodendrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 26 (31), 8206-8216 (2006).</li>
<li>Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+systemic+inflammation+to+chronic+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Contribution of systemic inflammation to chronic neurodegeneration.</a> Acta neuropathologica. 120 (3), 277-286 (2010).</li>
<li>McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chondroitin+sulfate+proteoglycans+neurocan+and+phosphacan+are+expressed+by+reactive+astrocytes+in+the+chronic+CNS+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.</a> Journal of Neuroscience. 19 (24), 10778-10788 (1999).</li>
<li>Silver, J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+beyond+the+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regeneration beyond the glial scar.</a> Nature reviews. Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 32 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Buffo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+progeny+of+reactive+gliosis%3A+A+source+of+multipotent+cells+in+the+injured+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and progeny of reactive gliosis: A source of multipotent cells in the injured brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3581-3586 (2008).</li>
<li>Sirko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+glia+in+the+injured+brain+acquire+stem+cell+properties+in+response+to+sonic+hedgehog.+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. [corrected].</a> Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

钻孔过程中必须避免损伤颅骨或其下方的硬脑膜。钻孔时应使用轻柔的压力，以确保不穿透颅骨。此外，在抬起颅骨片时需格外小心，防止硬脑膜随骨片一同被掀起。
本文所述的前脑穿刺损伤模拟了中枢神经系统（CNS）的穿透性损伤。尽管其临床可转化性不如FPI或CCI等创伤性脑损伤（TBI）模型，前脑穿刺损伤模型仍可作为研究由明确CNS损伤所触发的多种生化、细胞或分子事件的有力工具。尽管已有研究报道大鼠在双侧穿刺损伤后3周出现认知功能缺陷11，但需注意的是，本文所描述的单侧穿刺损伤模型最适合用于研究损伤后的细胞反应。诸如反应性胶质增生和瘢痕形成等神经病理学过程的基本特征可被直接观察和研究。与引起弥散性和广泛性神经病理改变的FPI或CCI模型不同，该模型的局部胶质细胞活化和病变有利于在同一动物体内比较损伤与未损伤半脑。此外，脑膜细胞在损伤部位浸润进入中枢神经系统，为研究这些细胞与局部反应性星形胶质细胞之间的相互作用提供了机会。事实上，此类相互作用在瘢痕组织形成中至关重要，并已被证明可负向调控反应性星形胶质细胞对轴突再生的支持能力12。
<p class...

开发治疗中枢神经系统损伤的有效疗法面临的主要挑战之一，是对创伤所引发的复杂多细胞事件理解尚不充分。反应性星形胶质细胞正日益被视为新型治疗策略中一个极具前景的靶点1。尽管历史上曾认为反应性星形胶质细胞不利于神经修复，但现在已认识到，它们是包含抑制炎症过程、限制继发性损伤和神经退行性变在内的复杂多细胞神经保护反应中的关键组成部分2-6。虽然反应性胶质增生的神经病理学特征早已被明确定义，但调控该过程的细胞与分子机制及其多样的下游效应仍知之甚少。阐明驱动反应性胶质增生的机制以及后续发生的细胞和分子事件，是制定策略以促进其神经保护作用、同时减轻其有害效应的重要一步。
本文演示了一种通过刺伤损伤在成年小鼠前脑诱导严重反应性星形胶质细胞增生的方法。与其他创伤性脑损伤（TBI）模型（如控制性皮质冲击（CCI）或液体冲击损伤（FPI））不同，后两者需要专用设备来制造损伤，而前脑刺伤仅需使用立体定位仪固定头部和11号手术刀片即可完成。因此，前脑刺伤损伤模型对缺乏制造FPI或CCI损伤所需专用设备的各类实验室而言更具可及性。本文所述方法可使研究人员可靠且可重复地触发强烈的胶质细胞增生反应，以研究后续的细胞与分子事件。动物在手术后恢复良好，接受前脑刺伤损伤的个体可在无需特殊护理的情况下长期存活，并可重新放回动物群中用于急性、中期或慢性研究。尽管与FPI或CCI等TBI模型相比，刺伤所致前脑损伤的临床可转化性较低，但它仍是一种简单而有效的实验模型，可用于研究创伤后中枢神经系统中反应性胶质增生及其他神经病理事件的基本生物学机制。

<table><tbody><tr><td>立体定位仪</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726049</td><td></td></tr><tr><td>高速微型钻</td><td>Harvard Apparatus</td><td>724950</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢手术刀片，#11</td><td>MedVet</td><td>JOR581S</td><td></td></tr><tr><td>5/45度角镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>明胶海绵，12 cm × 7 mm</td><td>Fisher</td><td>NC9841478</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 GFAP 抗体</td><td>DAKO</td><td>&amp;nbsp;Z033429-2</td><td>稀释比例 — 1:20,000（明场）；1:1,000（荧光）</td></tr><tr><td>羊抗 BrdU 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab1893</td><td>稀释比例 — 1:20,000（明场）；1:500（荧光）</td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗兔 IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000&amp;nbsp;</td><td>稀释比例 — 1:400（明场）</td></tr><tr><td>生物素标记的兔抗羊 IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-6000</td><td>稀释比例 — 1:400（明场）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td>稀释比例 — 1:400（明场）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 标记的驴抗羊 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-21099</td><td>稀释比例 — 1:1,000（荧光）</td></tr><tr><td>DAPI 核酸染色剂</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>稀释比例 — 1:1,000（荧光）</td></tr><tr><td>醋酸克雷斯紫</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td>稀释比例 — 1%（明场）</td></tr></tbody></table>

诱导反应性胶质增生 体内 由前脑刺伤损伤引起

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

中枢神经系统（CNS）损伤后，星形胶质细胞会发生一系列生化、形态和分子水平的改变，统称为反应性星形胶质增生。反应性星形胶质细胞具有促炎和保护双重作用，分别抑制和促进神经修复。目前对反应性星形胶质增生多种功能特性的潜在机制尚不完全清楚。深入理解这些机制对于开发治疗中枢神经系统损伤的治疗策略至关重要。本文展示了一种通过前脑刺伤法在成年小鼠前脑诱导反应性星形胶质增生的方法。该损伤模型操作简单、结果可靠，仅需使用立体定位仪和手术刀片即可造成损伤。刺伤模型作为前脑损伤的研究手段已被广泛确立，适用于研究多种神经病理学结果，如神经元变性、神经炎症以及血脑屏障（BBB）的破坏。因此，前脑刺伤损伤模型是一种强有力的工具，可用于广泛探究中枢神经系统对创伤的响应。

由于接受该手术的动物无需特殊的术后护理，因此可根据研究需要调查损伤后的急性或慢性病理变化，灵活设置短期或长期的存活时间。损伤后 2-3 天即可观察到反应性胶质增生的主要特征，例如 GFAP 的上调以及胞体肥大。反应性星形胶质细胞增殖的高峰期出现在损伤后第 3 至 5 天10。下图所示的代表性结果来自 7 天前接受过穿刺损伤的动物。
通过尼氏染色可以观察前脑刺伤后前脑的一般形态和皮层细胞结构（图2）。尽管刀片轨迹在损伤中心区域最为明显，但皮层细胞结构的破坏可揭示受损组织的头端和尾端范围。通过GFAP免疫组织化学染色可观察到反应性星形胶质细胞（图3）。需要注意的是，在无损伤情况下，许多皮层星形胶质细胞不表现出可被免疫组织化学检测到的GFAP水平。然而，损伤同侧半脑中GFAP表达显著上调，而在对侧半脑中仍保持相对较低水平（图3），提示反应性星形胶质细胞局限于损伤同侧半脑。需注意的是，尽管损伤同侧皮层组织中GFAP表达明显上调，但其他星形胶质细胞标志物（如S100β）...

本文介绍了一种在成年小鼠中制造前脑刺伤损伤的详细方案。该刺伤可诱导严重的反应性胶质增生及胶质瘢痕形成，随后可通过标准免疫组织化学方法进行检测。

中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞会发生一系列生化、形态和分子水平的改变，统称为反应性...

以下实验的总体目标是通过在成年小鼠前脑制造机械性损伤，诱发反应性星形胶质增生，以研究反应性胶质增生所涉及的细胞与分子过程。该实验通过实施开颅手术，随后将无菌手术刀片插入前脑深部3至4毫米、长度同样为3至4毫米处，造成损伤。动物可在急性或慢性时间点存活，实验结束时收集其组织进行分析。接下来的组织可用于组织学、生物化学或分子生物学检测，以研究驱动反应性星形胶质细胞增生的分子和细胞过程。结果显示，该操作可引发强烈的反应性胶质增生，表现为GFAP显著上调以及反应性星形胶质细胞的增殖。与流体冲击损伤或控制性皮层冲击等其他方法相比，该技术的主要优势在于无需额外设备即可轻松诱导并研究反应性胶质增生。开始此操作时，先用70%乙醇对手术台进行消毒，然后在整个手术台上铺上吸水垫，并将手术器械摆放在手术台上。接下来，安装立体定位仪（不带操作臂）。将加热垫放置在立体定位仪框架上，并将其温度设置为37摄氏度。将一小片纸巾或手术垫放置在加热垫上，以避免动物过热。然后将明胶海绵切成小块，放入含有0.9%无菌生理盐水的无菌培养皿中，备用。在此步骤中，将一只完全麻醉的小鼠置于立体定位仪框架中。将小鼠的鼻子固定在与异氟烷连接的鼻罩中。接着拧紧耳杆，确保头部稳定。从眼睛水平线到耳朵水平线之间剃除头部毛发。然后使用异丙醇和聚维酮碘溶液交替擦拭三次，对皮肤进行消毒。随后，在双眼涂抹眼药膏以防止角膜干燥。通过夹捏动物的脚趾或尾巴来监测其麻醉深度。当小鼠无反应且呼吸缓慢均匀时，表明其已处于适当的手术麻醉状态，此时应从眼睛后方开始，沿近乎两耳之间的一点作一个坚定的矢状方向皮肤切口。将皮肤移开，并在显微镜下用止血钳夹住右侧固定。使用手术刀的钝边和棉签清除颅骨表面的覆盖膜。然后用浸有0.9%生理盐水的棉签擦拭颅骨，并使其完全干燥。使用小型直尺和永久性记号笔，在冠状缝前1毫米处标记开颅区域的前界，在矢状缝外侧1毫米处标记开颅区域的左边缘。接着，分别从矢状缝和冠状缝起测量4毫米，标记开颅区域的右侧和后侧边界。使用0.5毫米的钻头，沿着永久性记号笔的标记轮廓小心钻孔，注意不要完全穿透颅骨。用镊子轻轻按压顶骨的游离部分。当骨片周围已足够薄弱时，即可进行移除。现在使用带有23号针头的10毫升注射器，向分离出的骨骼及钻孔区域滴加少量0.9%生理盐水。将操纵臂连接至立体定位仪装置，然后将新的手术刀片安装到探针架上，刀刃朝向尾侧。将操纵臂移开，以免妨碍操作。使用弯头镊子小心地夹起骨片，将镊子尖端插入骨片侧面，一次性将其提起并移开。随后，将一小块浸湿的可吸收明胶海绵放置在暴露的脑组织上，以防止脑组织干燥，并吸收可能存在的血液。将凝胶泡沫放置于脑组织上后，移动操纵臂至相应位置。调整刀片使其对准凝胶泡沫中心。随后移除凝胶泡沫，并 lowering 刀片直至其尖端接触硬脑膜。在不刺破的情况下，使用体视定位仪垂直臂上的游标尺标记背腹向

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

触发反应胶质细胞增生<em&gt;在体内</em&gt;由前脑锐器伤

本视频演示了小鼠皮层刺伤损伤的操作过程，包括颅骨暴露和脑损伤的建立。该模型可诱导反应性星形胶质细胞增生，即星形胶质细胞的一种神经保护性反应，用于研究中枢神经系统创伤、炎症及修复机制。...

在小鼠模型中制造皮层刺伤以诱导反应性星形胶质细胞增生

本文描述了一种利用果蝇幼虫腹神经索的损伤模型，用于研究中枢神经系统（CNS）的再生与修复。通过穿刺损伤，结合活体及固定样本的时间序列激光共聚焦显微镜成像，并利用专门开发的软件与遗传学工具进行定量分析，以探究中枢神经系统再生与修复的分子机制。...

一种用于研究中枢神经系统修复的损伤范式 果蝇

急性脑损伤是一种目前尚无有效治疗方法的严重创伤。多光子显微镜技术可实现对急性脑损伤在啮齿类动物中发展过程的纵向研究，并用于探索治疗策略。通过多光子显微镜研究的两种急性脑损伤模型包括 体内...

小鼠急性脑损伤后纵向双光子成像

表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内...

星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

双光子活体成像可用于研究骨髓嵌合动物在脊髓背柱受到创伤性脊髓 crush...

活体成像观察小鼠背柱 crush 损伤后轴突与小胶质细胞及巨噬细胞的相互作用

本系统性实验方案描述了一种新的重复性轻度创伤性脑损伤后创伤后癫痫的动物模型。第一部分详细介绍了使用改良的重物坠落模型诱导创伤性脑损伤的操作步骤。第二部分提供了用于单通道和多通道脑电图数据采集系统的外科手术方法指导。...

诱导重复性弥散性创伤性脑损伤小鼠模型中的创伤后癫痫

本方案描述了小鼠模型中的轻度创伤性脑损伤。具体而言，详细阐述了一步一步诱导轻度中线闭合性头部损伤的方法以及该动物模型的表征。...

小鼠轻度创伤性脑损伤的电磁控制闭合式头部模型

本研究展示了对小鼠施加重复性创伤性脑损伤，同时植入颅窗，以便后续通过双光子显微镜对神经元表达的EGFP进行活体成像。...

利用双光子显微镜对具有闭合性颅脑损伤及颅窗的小鼠进行荧光蛋白表达的活体成像

本方案描述了一种定制的超压空气系统，旨在诱导小鼠闭合式中枢神经系统（CNS）损伤，包括眼部、脑部和脊髓创伤。本方案的目标是为研究人员提供一个框架，以便轻松地根据其特定的中枢神经系统创伤研究需求对系统进行调整和扩展。...

中枢神经系统局灶性封闭系统损伤装置

简化的创伤性脑损伤（TBI）模型促进了治疗策略的开发。本方案概述了使用针头在小鼠大脑皮层制造刺伤损伤的方法，可用于分析出血和炎症反应。这种刺伤型TBI小鼠模型的优势在于无需特殊设备即可实施。...

用于研究创伤性脑损伤中出血与炎症的刺伤小鼠模型

此处，我们提供了一种详细的从小鼠眼球中分离视网膜的方法，适用于后续的长期研究 离体 实验。本方案旨在使这一技术要求较高的方法更易于研究人员掌握，以便利用在维持视网膜胶质细胞活性条件下所提供的研究路径 原位...

一个 离体 研究小鼠视网膜胶质细胞相互作用的外植体模型

学习通过前脑锐器伤诱导成年小鼠反应性胶质细胞增生的方法。该手术技术无需额外设备即可创建机械性损伤，便于通过免疫组织化学和生化分析研究胶质瘢痕形成的细胞和分子机制。

诱导反应性胶质增生体内由前脑刺伤损伤引起

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诱导反应性胶质增生 体内 由前脑刺伤损伤引起

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