一种水生微生物宏蛋白质组学工作流程：从细胞到适用于串联质谱分析的胰蛋白酶肽段

本实验的目的是从海水中收集的微生物生物量中提取蛋白质和DNA，随后生成用于基于串联质谱的蛋白质组学分析的胰蛋白酶肽段。该过程首先裂解先前富集在滤芯过滤器上的细胞，第二步是使用超滤离心过滤装置浓缩细胞裂解液。

接下来，将裂解液分为两部分，分别用于蛋白质沉淀和DNA沉淀。最后一步是进行凝胶内胰蛋白酶消化蛋白质，并提取适合液相色谱-串联质谱分析的肽段。最终，可通过后续的生物信息学分析鉴定样品中表达的蛋白质，而分离得到的DNA可用于宏基因组和/或16S rRNA基因分析。

该技术相较于现有方法的主要优势在于，可从同一样本中同时分离蛋白质和DNA。首先，使用连接在滤柱离心装置鲁尔锁端的60毫升注射器，将RNA稳定化溶液从滤柱过滤单元推出，并收集至2毫升微量离心管中。随后，以17,000 × g离心10分钟，使样本中可能存在的细胞碎片沉淀。离心后，将上清液转移至10 K超滤离心过滤装置中，以截留样本中因细胞裂解而释放的蛋白质。

不要丢弃沉淀物。将超滤离心过滤装置在3,270 ×g条件下离心30分钟，或直至体积减少至约600 µL。同时，将P-10吸头的尖端熔化，并用其开口端堵住滤筒过滤装置非锁扣侧的一端。

这将确保在后续步骤中无提取缓冲液和生物样品损失。用一毫升SDS提取液重悬沉淀，并用移液器将其转移至原始的滤 cartridge 单元中。将P200吸头套在P1000吸头上，形成双层吸头进行移液，是向滤 cartridge 单元中加样的最简便方法。再向滤 cartridge 单元中加入额外的一毫升SDS提取液，使总体积约为两毫升。

封膜。将滤筒过滤装置的锁紧端关闭，并将滤筒过滤装置放入50毫升离心管中。接下来，在50毫升锥形管底部放入三团揉皱的实验室擦拭纸。

关闭管盖，将离心管放入杂交炉中，在室温下旋转孵育10分钟。10分钟后，将滤膜置于泡沫浮板上，并用5毫升注射器在锁紧端固定，然后在95°C水浴中孵育15分钟。随后让滤筒装置冷却，并在室温下旋转1小时。冷却后，使用60毫升注射器将SDS提取液细胞裂解物从滤膜中推出，收集至同一超滤离心过滤装置中。

与之前相同，向柱式滤器单元中加入1毫升新鲜的SDS提取液，手动混匀30秒。然后使用60毫升注射器将滤器中的内容物推入超滤离心过滤单元，进行冲洗，以确保所有蛋白质均已被去除并收集。将超滤离心过滤单元以3,270 ×g离心45分钟，或直至过滤单元内体积少于600 µL。

弃去滤过液，并用新鲜的SDS提取液补足超滤离心过滤装置的体积。将过滤装置在3,270 ×g条件下再次离心45分钟，然后重复此步骤两次。最后一次离心结束时，确保超滤离心过滤装置中的终体积不超过600 µL。

此时，测量浓缩液的体积，并将浓缩液均分为两份。其中一份用于DNA沉淀，另一份用于蛋白质沉淀。对于蛋白质沉淀，向一份体积的浓缩液中加入四倍体积的甲醇和丙酮（体积比为50:50），涡旋振荡10秒，于-20 °C过夜孵育。

第二天，将混合物在17,000 × g条件下离心30分钟，倾去上清液后，将沉淀在真空浓缩仪中干燥1小时。切勿过度干燥沉淀，以免难以重悬。

将沉淀重悬于25微升SDS提取液中。室温静置1小时后，通过反复吹打混匀。按照文本方案中的详细步骤，在生物安全柜中进行SDS-PAGE蛋白质电泳，以尽量减少污染，并在每个泳道10千道尔顿蛋白标记物下方切去多余的凝胶部分。

每条泳道将使用串联质谱仪进行分析。单独操作，将每条泳道切成1毫米×1毫米的方块，以增加表面积，并将该泳道的所有方块转移至低吸附的微量离心管中。对所有泳道重复此操作，可使用1%乙酸防止凝胶干燥而难以切割。

按照文本方案中所述进行凝胶内胰蛋白酶消化和肽段提取，或在SDS提取液中进行DNA沉淀，将浓缩组分加至500微升刻度线。此步骤仅用于增加溶液体积，便于后续操作。随后加入0.583倍体积的蛋白质沉淀试剂（如MPC蛋白沉淀试剂），并涡旋混匀。

将白色沉淀物在17,000 × g、4 °C条件下离心10分钟。离心后，将上清液转移至另一支1.5 mL微量离心管中，加入0.95倍体积的异丙醇，颠倒混匀30至40次，然后在4 °C、最大转速下离心10分钟，小心倾去并弃除上清液。随后用750 µL 70%乙醇将沉淀清洗两次。

用移液器尽可能去除乙醇，然后让沉淀物自然风干。切勿将DNA过度干燥，因为这可能导致干燥后难以重新溶解。将沉淀物悬浮于25 µL pH 8的低TE缓冲液中。

使用双链DNA检测试剂盒并按照制造商说明书对DNA进行定量。同时，取3 µL DNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测其质量。肽段样品进行串联质谱分析。每个样品产生超过23,000个质谱图，据此鉴定出肽段和蛋白质。

利用 blast P 与宏基因组分析仪相结合的方法分析了宏蛋白质组的分类学和功能组成。在数据集中，被归类为α-变形菌的蛋白质在软件包中所占比例最高，其中绝大多数被归类于 SAR11 支系。

α-变形菌门中的罗特分支也被大量检测到并成功鉴定，通常存在于表层水体中。与细菌疾病相关的蛋白质在表层和叶绿素最大值层之间的分布较为均匀，而鞭毛细菌蛋白质在叶绿素最大值层中的鉴定程度更高。

γ-变形菌蛋白质在水体中均匀分布，而β-变形菌蛋白质主要存在于表层。一旦掌握，该技术若操作得当，可在三天内完成。