Name: 成人人成纤维细胞的推导和他们直接转换成可扩展的神经祖细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: 了解如何将成人皮肤成纤维细胞直接重编程为诱导神经祖细胞，用于再生医学和神经退行性疾病研究。该方法比传统iPSC技术更快速、更安全，可生成患者特异性神经元和胶质细胞。

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我们感谢维尔茨堡大学干细胞与再生医学团队所有成员提供的有益建议，以及 Martina Gebhardt 和 Heike Arthen 提供的出色技术支持。本工作得到了德国研究基金会（DFG）（ED79/1-2）、德国联邦教育与研究部（BMBF）（01 GN 0813）、巴伐利亚州诱导多能干细胞研究网络“forIPS”以及“Stiftung Sibylle Assmus”基金会的资助。图1 使用 Servier Medical Art 制作，可从 www.servier.com 获取。

本研究中使用的人成纤维细胞取自皮肤钻孔活检，获取样本前已获得受试者知情同意，并经德国维尔茨堡大学伦理委员会批准（伦理报告编号：96/11，日期：2011年6月10日）。
1. 穿孔活检
<ol>
	<li>消毒患者皮肤。使用0.5至1 ml盐酸甲哌卡因在将取活检的皮肤部位（优先选择较少日晒的区域）进行皮内麻醉，用无菌3 mm活检打孔器制备皮肤活检样本，用含1 µl/1 ml庆大霉素的DPBS冲洗活检组织，并去除脂肪组织。用含庆大霉素的DPBS冲洗活检组织两次，彻底吸除DPBS，覆盖Dispase II（2.4 U/ml），于16–18小时孵育&#160;在 4 °C。</li>
	<li>吸弃Dispase溶液，用DPBS洗涤两次，并用镊子去除表皮。将活检组织用DPBS洗涤两次，加入2 ml胶原酶II型（500 U/ml CDU），转移至15 ml离心管中，并补加胶原酶至总体积5 ml。于37 °C、5% CO₂条件下孵育45分钟。2.</li>
	<li>离心5分钟（180 × g），弃上清。将沉淀重悬于10 ml DMEM-FCS-庆大霉素培养基（含10% FCS，1 µl/ml 庆大霉素）中，再次以180 × g离心5分钟。弃上清，将沉淀重悬于1.5 ml DMEM-FCS-庆大霉素培养基中，转移至T25贴壁细胞培养瓶，于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2.</li>
	<li>每3天更换一次培养基。</li>
	<li>大约2周后，当细胞在皮肤组织周围生长至融合时，使用胰蛋白酶/EDTA（0.05%）进行细胞传代：用DPBS洗涤细胞一次，在37 °C、5% CO₂条件下孵育5分钟2 加入2 ml胰蛋白酶/EDTA（0.05%）后，加入2 ml DMEM-FCS-庆大霉素培养基，转移至15 ml离心管中，于180 × g离心5 min；弃上清，将沉淀重悬于适量DMEM-FCS-庆大霉素培养基中。</li>
	<li>每隔3天更换一次培养基，进一步扩增细胞rd 细胞汇合后按上述方法进行传代和分瓶；传代2次后可停止添加庆大霉素。</li>
	<li>在将细胞用于直接转化实验之前，需通过标准检测方法排除支原体污染。</li>
	<li>当细胞扩增完成后，可直接开始转化，或使用10% DMSO和90% FCS将细胞冻存。细胞应在-80 °C保存2天，随后转移至液氮中进行长期保存。</li>
	<li>为制备转化，用 DPBS 洗涤细胞一次，吸除 DPBS，加入 2.5 ml 胰蛋白酶/EDTA（0.05%）。于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟2轻轻敲击培养瓶以脱离细胞，加入2.5 ml成纤维细胞培养基（DMEM含L-谷氨酰胺 + 10% FCS + 1%非必需氨基酸 + 1%丙酮酸钠）重悬细胞&#160;转移至15 ml离心管中，180 × g离心5分钟，吸除上清液。用1 ml成纤维细胞培养基重悬细胞 &#160;用移液器反复吹打以形成单细胞悬液。</li>
	<li>使用Fuchs-Rosenthal或Neubauer细胞计数板对细胞进行计数，并接种3 × 104 每孔接种细胞至24孔板。在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。2.</li>
</ol>
2. 人成纤维细胞的仙台病毒感染与转分化
注意：为确保安全，处理病毒的以下步骤必须在生物安全柜和层流罩内进行，并使用适当的个人安全防护装备，特别是外科口罩，以防止黏膜暴露。
<ol>
	<li>将细胞换入100 µl成纤维细胞培养基（步骤1.9）。解冻Oct4-、Klf4-、Sox2-和c-myc-仙台病毒的分装 aliquot，每种病毒分别重悬于1 ml成纤维细胞培养基中。按每个病毒MOI为3的量加入细胞中（病毒滴度因批次而异，但通常每种病毒的一个aliquot可用于24孔板中10个孔的感染），轻轻混匀。于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养2.</li>
	<li>24 小时后&#160;吸弃培养基，加入 500 µl 神经诱导培养基（1:1 DMEM/F-12 : Neurobasal，1x N2，1x B27，1% GlutaMAX，10 ng/ml hLIF，3 µM CHIR99021，2 µM SB431542），于 39 °C、5% CO₂ 条件下培养2 从现在开始，每隔一天更换一次培养基。</li>
	<li>感染后第6天，准备经层粘连蛋白包被的6孔板：将层粘连蛋白用DPBS稀释至1 µg/ml，每孔加入1 ml溶液，4 °C孵育24小时。</li>
	<li>感染后第7天，使用DPBS/EDTA消化细胞：吸除培养基，用DPBS洗涤细胞一次，然后加入500 µl DPBS/EDTA，于37 °C、5% CO₂条件下孵育10分钟2.</li>
	<li>加入500 µl DMEM/F12，将悬浮液从培养板中转移至15 ml离心管，于180 x g离心5分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，将沉淀重悬于1.5 ml神经诱导培养基中，接种至层粘连蛋白包被的6孔板，加入ROCK抑制剂Y27632至终浓度10 µM，于39 °C、5% CO₂条件下培养2.</li>
	<li>每隔一天更换一次培养基。</li>
	<li>从感染后第14天开始，将细胞在37 °C、5% CO₂条件下培养2神经上皮样细胞集落在感染后约第17天通过相差显微镜可见。感染后约第20天，集落应已足够大，可进行挑取。</li>
</ol>
3. 分离假定的iNPC克隆
<ol>
	<li>挑取前一天，用层粘连蛋白包被一块48孔板：将层粘连蛋白用DPBS稀释至1 µg/ml，每孔加入300 µl溶液，4 °C孵育24小时。一天后吸除孔板中的层粘连蛋白溶液，每孔加入200 µl神经诱导培养基。</li>
	<li>用DPBS洗涤含有待挑取克隆的6孔板一次，每孔加入2 ml DPBS。机械法挑取克隆：使用细针在克隆周围刮取，去除周围细胞；将200 µl移液器调至50 µl，使用相应的吸头挑取克隆。</li>
	<li>将每个克隆分别转移至一块经层粘连蛋白包被的48孔板的各个孔中，并通过上下吹打10次机械法制备单细胞悬液。向细胞中加入ROCK抑制剂Y27632，终浓度为10 µM。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养2天。每隔两天更换一次培养基，直至细胞达到80–90%汇合度（约3–4天）。</li>
</ol>
4. iNPCs 的扩增与冷冻保存
<ol>
	<li>iNPCs的传代与扩增
	<ol>
		<li>吸去培养基，用DPBS洗涤细胞。吸去DPBS，加入200 µl DPBS/EDTA，于37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟，随后加入200 µl DMEM/F12，将悬液从培养板中转移至15 ml离心管中，以180 × g离心5分钟。</li>
		<li>吸去上清液，将沉淀重悬于0.5 ml神经诱导培养基（步骤2.2）中，接种至经层粘连蛋白包被的12孔板，并向培养基中加入ROCK抑制剂Y27632，终浓度为10 µM，于37 °C、5% CO2条件下培养。当细胞融合度达到80–90%时，可进一步扩增或按以下方法冻存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>iNPCs的冻存
	<ol>
		<li>吸去培养基，用DPBS洗涤细胞。吸去DPBS，加入300 µl DPBS/EDTA，于37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟，随后加入300 µl DMEM/F12，将悬液从培养板中转移至15 ml离心管中，以180 × g离心5分钟。</li>
		<li>吸去上清液，将沉淀重悬于0.5 ml商用NSC冻存培养基中。将细胞悬液转移至冻存管，放入细胞冻存盒中。于-80 °C保存2天后，转移至液氮中进行长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. iNPCs 的分化
<ol>
	<li>向神经元谱系分化
	<ol>
		<li>将细胞培养于如上所述的层粘连蛋白包被的培养板上。当细胞融合度约为70%时，更换为神经分化培养基（DMEM/F-12，1× N2，1× B27，300 ng/ml cAMP，200 µM 维生素C，10 ng/ml BDNF，10 ng/ml GDNF）。每两天更换一次培养基，持续三周。分化期间不要传代细胞。</li>
		<li>三周后，细胞应表达神经元标志物TUJ1。为进一步获得更成熟的神经元及神经元亚型，可继续分化长达3个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向胶质谱系分化
	<ol>
		<li>更换为胶质诱导培养基（1:1 DMEM/F-12 : Neurobasal，1× N2，1× B27，10 µM β-巯基乙醇，100 µM 非必需氨基酸，1.5 mM L-谷氨酰胺，5 µg/ml 胰岛素，40 ng/ml T3），并加入20 ng/ml EGF以诱导细胞向胶质前体细胞分化。每两天更换一半培养基，补充新鲜培养基，持续约2周。在此期间，当细胞达到100%融合时，以1:3比例传代，并在含有10 µM ROCK抑制剂Y27632的条件下进行。</li>
		<li>两周后，进一步将细胞分化为星形胶质细胞：当细胞接近融合时，更换为市售的星形胶质细胞培养基，每两天更换一次培养基。约7天后，细胞开始表达星形胶质细胞标志物（例如，GFAP）。若在分化过程中细胞达到100%融合，需以1:2比例传代，并在含有10 µM ROCK抑制剂Y27632的条件下进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文展示了人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的无外源基因神经前体细胞及其分化后代细胞的方法，该方法可作为细胞替代疗法或药物筛选分析的潜在基础。通过强制表达谱系特异性转录因子，已实现体细胞向神经前体细胞（NPCs）的直接谱系转化26,33,34。然而，在许多情况下，转分化实验使用的是胎儿成纤维细胞33,34。对于生物医学应用而言，使用这类细胞并不适宜，因为该细胞来源限制了其在自体细胞替代疗法中的临床应用。最近有研究报道，可从更容易获取的组织（如造血细胞）中生成神经前体细胞43,44。通过可诱导过表达八个外源基因，已成功从鼠源血液来源的B细胞中建立三向分化潜能的神经干细胞系43。此外，Castano 等报道了一种利用Sox2和c-myc-Sendai病毒诱导人造血细胞生成神经前体细胞的方法44。该方案可实现从CD133+脐血细胞快速高效地生成神经细胞。然而，当将其应用于成人外周血单个核细胞转化时，转化效率较低，且所获得细胞系的扩增能力极为有限44。因此，迄今为止在人类...

2006年，山中伸弥及其同事首次证明了将体细胞重编程为多能状态的可能性1。这种去分化过程通过在小鼠成纤维细胞中过表达四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc实现。所获得的所谓诱导性多能干细胞（iPSCs）在功能上与胚胎干细胞（ESCs）相当，因此可被分化为成体生物体的所有细胞类型。一年后，人类成纤维细胞也被成功重编程为iPSCs2。动物模型实验表明，iPSC来源的细胞通常可用于细胞替代治疗，例如帕金森病（PD）3-5。然而，iPSCs的应用仍存在若干局限性，阻碍了其治疗潜力的充分发挥。首先，将细胞重编程为多能状态并进行后续质量控制通常是一个耗时且效率低下的过程，需要进行大量且成本高昂的细胞培养操作。其次，在生物医学应用前，iPSCs必须被重新分化为目标细胞类型，而分化细胞群体中残留的多能细胞具有显著的致瘤潜能，因此在细胞移植后存在较高风险6。第三，重编程过程通常通过慢病毒或逆转录病毒感染来诱导重编程因子的表达，这些病毒整合到宿主基因组中可能导致插入突变和/或转基因的非预期再激活7,8。为此，已开发出非整合型系统，将重编程因子递送至靶细胞，从而最小化插入突变和转基因再激活的风险。这些无转基因方法的示例包括使用非整合型腺病毒或仙台病毒进行细胞重编程9,10、基于DNA的载体11，或无DNA的方法，如合成mRNA转染12或重组蛋白转导13,14。另一种有前景的获得无转基因iPSC的方法是使用loxP修饰的慢病毒重编程载体，并通过Cre-loxP DNA重组系统随后删除转基因15,16。
一种更为直接的用于细胞替代治疗的神经细胞生成方法是将成纤维细胞直接转化为终末分化神经元17-20。Vierbuchen 等 报道，过表达转录因子 Ascl1、Brn2 和 Myt1l 可使小鼠成纤维细胞生成 20% 的神经元17。2011 年的研究表明，同样的三种转录因子联合过表达 NeuroD1 可实现人成纤维细胞向神经元的转分化19。在双重 SMAD 和 GSK3β 抑制条件下，过表达 Ascl1 和 Ngn2 也可将人成纤维细胞诱导为神经元20。值得注意的是，成纤维细胞向神经元的直接转化产生的是非增殖性的终末分化细胞群体，无法进一步扩增和进行生物样本库保存。
最近，有研究报道了将成纤维细胞直接转化为可增殖的神经干细胞/前体细胞群体。21-26为便于表述，本报告中将所有这些细胞类型统称为诱导性神经前体细胞（iNPCs）。Han 等 过表达 Brn4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 以生成诱导性神经前体细胞（iNPCs）。与来源于原代组织或 pluripotent 细胞的神经干细胞类似，这些 iNPCs 具有三向分化潜能，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞21我们的研究团队报道了一种略有不同的重编程方案，该方案涉及Sox2、Klf4和c-Myc的过表达，并仅诱导Oct4表达5天。采用此方法，我们能够从鼠胚胎和成体成纤维细胞中生成稳定增殖的诱导性神经前体细胞（iNPCs），且这些细胞中的重编程因子完全沉默。22与iPSCs不同，iNPCs在移植后不表现出致瘤潜能27我们成功地在脱髓鞘动物模型——髓鞘缺陷大鼠中应用了转化后的细胞，证明了iNPCs具有临床应用价值22在此前，神经前体细胞只能从多能干细胞或原代神经组织中获得28-32iNPCs 是可稳定扩增的细胞，能够进行冷冻保存，并可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。研究人员已投入大量努力，致力于将直接重编程技术从鼠类细胞体系优化应用于人类细胞。23,26,33,342012年有研究发表指出，在成纤维细胞中过表达单一因子Sox2足以生成小鼠和人类的诱导性神经前体细胞（iNPCs）。33作者报道了由胎儿包皮成纤维细胞诱导生成人源iNPCs，并通过Sox2和Nestin染色对其进行表征。然而，用于重编程的起始细胞属于一种非常特殊的细胞类型，在临床实践中难以获得，且未通过动物模型移植实验对转化后的细胞进行功能性验证。一篇较近期的文献描述了通过过表达Sox2、c-Myc以及Brn2或Brn4，将人胎儿成纤维细胞转化为神经限制性前体细胞的方法。34生成的细胞系表现出自我更新能力，并可分化为多种终末神经元。然而，使用胎儿成纤维细胞存在不利因素，因为这些细胞来源具有异质性，且无法排除残留的 例如， 制备中的神经嵴干细胞。2014年，Zhu 等 报道了通过过表达 Sox2 与 Oct4 或仅过表达 Oct4，并在细胞培养基中添加小分子，实现人成体和新生儿成纤维细胞直接转化为三向潜能神经前体细胞。值得注意的是，根据他们的研究，仅过表达 Sox2 不足以诱导直接转化26。最近，Lu 等 报道称，通过仙台病毒介导Yamanaka因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc过表达24小时，随后通过升高温度使病毒失活，可生成具有扩增能力的三向分化潜能神经前体细胞23总之，尽管迄今为止发表的人细胞转分化方案普遍采用至少过表达一个或多个山中因子（Yamanaka factors），且通常以时间限制性方式进行，但目前尚无明确证据表明驱动体细胞直接转化为诱导性神经前体细胞（iNPCs）所需的最小分子因子组合。通过基因手段、合成mRNA转染或细胞渗透性蛋白实现Oct4的时间限制性过表达，同时持续表达Sox2、Klf-4和c-Myc，迄今仍未获得稳定的人源iNPC细胞系。因此，应用仙台病毒（Sendai virus）过表达全部山中因子，并通过加热灭活病毒以实现其活性的时间限制性调控，23 结合优化的神经培养基诱导条件22,31 迄今为止仍是首选策略。
多项研究表明，神经干细胞（NSCs）或其分化后的细胞在不同动物疾病模型中具有细胞功能。来源于人多能干细胞的神经前体细胞已被移植到神经炎症性疾病多发性硬化症的小鼠模型中35,36。2008年首次证实了人胚胎干细胞（hESC）来源的神经前体细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中的应用潜力35。研究人员将多能性神经前体细胞注射至小鼠脑室，移植后显著减轻了EAE的临床症状。Kim 等 从hESC诱导生成少突胶质前体细胞，并将其经脑室内移植至EAE小鼠体内。尽管移植物存活时间未超过10天，但小鼠的神经功能出现显著改善，且白质中促炎性免疫细胞数量减少36。干细胞疗法也已用于帕金森病的临床前研究，因为神经前体细胞（NPCs）已在相应的动物模型中成功应用。这些前体细胞可来源于胎儿脑组织37，或由多能干细胞分化而来38-40，亦可使用间充质干细胞41。2012年，我们证明小鼠诱导性神经前体细胞（iNPCs）在移植至髓鞘缺陷型（md）大鼠脑内后，能够产生蛋白脂质蛋白——主要的髓鞘蛋白成分22。该原理性实验证实了iNPCs的治疗应用潜力，并很快被另一项研究证实32。然而，人源iNPCs在治疗应用方面的全部潜力仍有待进一步探索。
本文展示了一种稳定且完整的流程，包括：（i）通过皮肤活检从成年患者体内分离人类原代细胞，（ii）将人类成纤维细胞直接转化为神经前体细胞状态，以及（iii）诱导性神经前体细胞（iNPCs）向神经元和胶质细胞谱系分化的潜能。采用本实验方案将有助于加快自体人类细胞在治疗应用中的生成速度。

<table><tbody><tr><td>星形胶质细胞培养基</td><td>ScienCell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>pfm medical</td><td>48301</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A6885</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon medchem</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II 型</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>PAN&amp;nbsp;</td><td>P10-032100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>LifeTechnologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roth</td><td>4720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 抗体</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>LifeTechnologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>人白血病抑制因子（hLIF）</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Seralab</td><td>GEM-700-112-P</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 抗体</td><td>NeoMarkers</td><td>RM-9106-S</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>LifeTechnologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>LifeTechnologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>LifeTechnologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>LifeTechnologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>神经干细胞冻存培养基</td><td>Sigma</td><td>C6295</td><td></td></tr><tr><td>Oct4 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc9081</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 抗体</td><td>Covance</td><td>PRB-278P</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Invivogen</td><td>inh-sb43</td><td></td></tr><tr><td>仙台病毒：CytoTune 仙台重编程试剂盒</td><td>&amp;nbsp;LifeTechnologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Sox1 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF3369</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205725</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>TUJ1 抗体</td><td>Covance</td><td>MMS-435P-250</td><td></td></tr><tr><td>维生素 C</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>CAS 146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

通过成年皮肤成纤维细胞诱导生成&#160;诱导性多能干细胞（iPSCs），并进一步将其分化为体细胞，为获得可规避组织相容性障碍的自体移植材料提供了广阔前景。然而，由于存在致瘤风险和基因组不稳定性，细胞经历多能性状态并完全分化为特定谱系的过程，仍是iPSC技术向临床应用转化的主要障碍。近期，我们及多个研究团队发现，体细胞不仅可被重编程为iPSCs，还可利用特定因子直接转化为多种多能性体细胞干细胞，从而绕过多能性状态。特别是将人成纤维细胞直接转化为诱导性神经前体细胞（iNPCs），为细胞替代治疗、疾病建模及药物筛选等应用提供了全新的自体细胞来源。本文中，我们描述了通过皮肤活检获取成人原代人成纤维细胞，并通过限时表达Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc等确定因子，高效实现其直接转化为iNPCs的方法。诱导17天后可观察到Sox2阳性神经上皮样克隆，通过单克隆分离与扩增可高效建立iNPC细胞系。在诱导阶段精确调控病毒感染复数（MOI）并添加白血病抑制因子（LIF），是实现高达0.2%转化效率的关键因素。迄今为止，患者特异性的iNPC细胞系已成功扩增超过12代，且均一地表现出神经干细胞/前体细胞的形态学与分子特征，例如表达Nestin和Sox2。这些iNPC细胞系可进一步分化为神经元和星形胶质细胞，分别通过TUJ1和GFAP染色予以验证。综上所述，我们报道了一种稳定、高效的方案，用于从人成纤维细胞直接转化获得可长期扩增的神经前体细胞，该方法有望为自体神经细胞替代治疗和疾病建模等生物医学应用提供细胞来源。

本文介绍了一种整合性流程，可在不到8周的时间内，从皮肤穿刺活检获得的人类成纤维细胞诱导生成诱导性神经前体细胞（iNPCs）（图1）。患者特异性的iNPCs可进一步分化为神经元和胶质细胞谱系，在细胞替代治疗和疾病建模方面具有巨大潜力。
用 Oct4-、Klf4-、Sox2- 和 c-myc-仙台病毒23感染成纤维细胞，并在神经诱导培养基条件下培养22,31，感染后17天成纤维细胞形态发生改变，并相继出现细胞克隆（图2）。所获得的单克隆细胞系可被扩增，并表达神经干细胞标志物，如 Sox2、Sox1、Nestin、Vimentin、Otx2 和 Pax6，同时也表达增殖标志物 Ki67，但不表达多能性相关标志物 Oct4（图3）。
此外，通过在细胞培养基中添加神经生长因子，可将神经前体细胞诱导分化为神经元。根据 Izrael et al.42 的分化...

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。

从成体皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）并进一步分化为体细胞提供了……

本实验的总体目标是通过直接从患者的皮肤活检样本中生成诱导性神经前体细胞，从而缩短经典的山中伸弥诱导多能干细胞（iPS）方法，以用于治疗应用。该过程首先对患者进行皮肤钻孔活检，以获取可体外培养的原代成纤维细胞。第二步是扩增培养后的成纤维细胞，并利用编码重编程因子的病毒对其进行感染，以诱导转分化。接下来，需在感染后约20天，通过肉眼观察验证，仔细挑选出可能已转化的诱导性神经前体细胞（induced neural progenitor cell，INPC）克隆，并通过手工挑取进行分离。最后一步是将这些诱导性前体细胞（IPCs）进行单克隆扩增，置于神经诱导培养基中培养，最终通过体外定向分化，并结合免疫荧光显微镜检测，以证明患者自体直接转化而来的IPCs能够分化为神经元细胞以及胶质细胞，从而为生物医学应用提供近乎无限的细胞来源。与现有的诱导多能干细胞（如Yamanaka方法诱导产生的多能干细胞）及其后续分化技术相比，这种直接转化技术具有双重优势。将DI细胞转化为多能性诱导神经干细胞（我们称之为INS细胞）不仅显著更快，而且更加安全。因此，这种转分化方法将使获得患者特异性细胞用于治疗应用变得更加可行，同时与诱导多能干细胞（IPS细胞）相比，其致瘤风险显著降低。通过这一技术，我们现在能够克服当前再生医学领域的两大主要障碍。这就是临床安全性和效率。开始进行穿刺活检时，先对患者的皮肤进行消毒，然后用0.5至1毫升盐酸甲哌卡因皮内注射麻醉将要取活检的皮肤区域。使用无菌的3毫米活检钻取皮肤活检样本。用含庆大霉素（每毫升1微升）的Dobe Echo's磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗活检组织。使用手术刀和镊子去除活检组织中的脂肪。然后用缓冲液再冲洗活检组织两次，最后彻底吸除液体。用二号脱钙液覆盖组织活检样本，在4°C条件下孵育16至18小时。孵育结束后，彻底吸除脱钙液，随后用DPBS洗涤活检样本两次。用镊子去除表皮，再用DPBS额外洗涤两次。接着，加入两毫升胶原酶II型，并转移至15毫升离心管中。再加入胶原酶至总体积达到五毫升。总体积在37摄氏度下孵育45分钟。将样品在180 ×g 条件下离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于10 mL DMEM胎牛血清庆大霉素培养基中，再于180 ×g 条件下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1.5 mL相同培养基中。随后将样品转移至T25贴壁组织培养瓶中，在37°C、5% CO2条件下培养，约两周后每三天更换一次培养基。当细胞在皮肤组织周围生长至融合后，按照文本方案中所述，使用胰蛋白酶EDTA对细胞进行传代。通过每三天更换一次培养基，并在细胞融合时进行传代，进一步扩增细胞。在通过标准检测方法排除支原体污染后，用D-PBS洗涤细胞一次，然后吸除D-PBS，加入2.5毫升胰蛋白酶EDTA，准备用于直接转化实验。将细胞在37摄氏度、5% CO2条件下孵育

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

成人人成纤维细胞的推导和他们直接转换成可扩展的神经祖细胞

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

本视频演示了一种分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞（iNPCs）的技术。该方法概述了分离iNPC克隆并将其培养于经层粘连蛋白包被的多孔板孔中的步骤，同时使用适宜的培养基，以促进iNPC群体的持续增殖与扩增。...

分离由成人人类成纤维细胞衍生的诱导性神经前体细胞克隆

本视频展示了使用专用培养基将诱导性神经前体细胞（iNPCs）分化为神经元和星形胶质细胞的过程。...

诱导神经前体细胞向星形胶质细胞的分化

该视频展示了如何从成人人类皮肤成纤维细胞（aHDFs）生成神经元。通过使用携带神经元转录因子基因和短发夹RNA（shRNAs）的慢病毒载体对aHDFs进行重编程。shRNAs可抑制神经元转录抑制因子的表达，而神经元转录因子则激活相关基因，促使aHDFs分化为神经元。这些重编程后的aHDFs在早期和晚期神经元转化培养基中进行培养，以生成成熟的神经元。...

通过重编程人皮肤成纤维细胞生成神经元

我们报道了一种从原代人成纤维细胞培养物中分离出原始多能皮肤来源前体（SKP）细胞的方法。我们证明，这些源自成纤维细胞培养物的SKP细胞与直接从人皮肤活检组织中获得的SKP细胞具有相似的干细胞特性。这些细胞表达神经嵴标志物nestin，以及OCT4和Nanog等多能性标志物。...

从原代人成纤维细胞培养物中分离未分化的成体干细胞

本方案描述了一种新型的机械切碎方法，该方法可在无需解离为单细胞悬液的情况下实现球形神经干细胞及祖细胞聚集体的扩增。 维持细胞间的接触可实现超过40代的快速且稳定的生长。...

一种适用于cGMP的扩增方法，用于由多能干细胞或胎儿脑组织衍生的人类神经干细胞与前体细胞聚集体

靶向脑内常驻细胞进行直接谱系重编程为脑修复提供了新的前景。本文介绍了一种从成人人类大脑皮层制备富含脑内常驻周细胞的培养物，并通过逆转录病毒介导的转录因子 Sox2 和 Ascl1...

将成年人大脑中周细胞来源的细胞进行谱系重编程转化为诱导性神经元

已建立一种方法，可直接从外周血细胞中富集的造血祖细胞诱导生成人类神经干细胞。...

直接诱导人外周血造血祖细胞生成神经干细胞

直接神经元重编程生成的神经元可保持起始体细胞的年龄特征。本文介绍了一种基于单载体的方法，用于从成年人类供体获取的皮肤成纤维细胞中诱导生成神经元。...

由成人皮肤成纤维细胞简单高效地生成诱导神经元的高产率培养方法

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

我们描述了一种将人皮肤来源的成纤维细胞重编程为诱导性神经前体细胞（iNPCs），并进一步将其分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案。该方法可快速、可重复地大量生成iNPCs和iAs。...

利用成纤维细胞直接转化为神经祖细胞并分化为星形胶质细胞的体外神经疾病建模

了解如何将成人皮肤成纤维细胞直接重编程为诱导神经祖细胞，用于再生医学和神经退行性疾病研究。该方法比传统iPSC技术更快速、更安全，可生成患者特异性神经元和胶质细胞。

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

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