应用长期培养的干扰素-γ酶联免疫斑点试验评估牛效应与记忆T细胞应答

本实验的总体目标是分别利用短期和长期培养的干扰素γ酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法，评估效应T细胞和记忆T细胞的应答。通过在抗原刺激条件下培养牛外周血单个核细胞13天，可实现对中枢记忆T细胞应答的评估。长期培养使得效应T细胞应答得以发生并逐渐消退。

为维持记忆性T细胞，在培养物中添加白细胞介素-2。在第13天，将长期培养的细胞转移至包被了IFN-γ捕获抗体的L spot板中。在存在或不存在自体抗原呈递细胞的条件下，评估长期培养细胞对单个分枝杆菌抗原的反应。

通过第13天的贴壁法从新鲜的p BMCs中分离APCs。此外，还在体外条件下评估 freshly isolated pbmc 的反应，作为效应反应的参照指标。在多项研究中，已证明牛长期培养的sbot在疫苗接种后对分枝杆菌抗原的反应与疫苗效力呈正相关。

此外，长期T细胞培养物在人和牛中主要含有中央记忆T细胞。为了进行长期培养的L斑点试验，需通过颈静脉穿刺从感染或接种过m bovis的动物采集60 ml血液，并通过密度梯度离心法分离PBMCs。

细胞浓度应调整为每毫升400万个细胞。在完全RPMI培养基中，首先加入500微升的分枝杆菌抗原，本实验中为TB 10.4和抗原85A，以及称为PPDB的牛分枝杆菌培养物纯化蛋白衍生物。然后向每只动物来源的PBMC中各加入500微升，每只动物设四个重复。

请注意，所有孔均需进行刺激。此步骤中无需设置无刺激或有丝分裂原等对照，将培养板置于39°C（牛的正常体温）孵育13天。在第3天和第7天，用移液器小心吸弃每孔中的500 µL培养基，注意不要扰动孔底的细胞层。

用含有IL-2的完全PMI培养基补充体积。在第10天将培养板放入培养箱，从每个孔中弃去750微升上清液；在第12天，用不含任何IL-2的完全RPMI培养基补充。用多通道移液器从每个孔中移取并弃去1毫升上清液，然后补充不含IL-2的完全RPMI培养基。同时准备ELISPOT板，先用多通道移液器向每个孔加入15微升35%乙醇，以包被IFN-γ捕获抗体，此步骤可增强斑点的清晰度。

用300微升PBS充分洗涤六次。加入100微升捕获抗体，抗体浓度为8微克/毫升，溶于PBS中。所有操作步骤中均应小心移液，避免枪头接触或损伤孔底部的膜。将板放入塑料袋中，于4°C孵育过夜。

第13天，从首次采样时使用的相同动物中通过颈静脉穿刺采集60 ml血液。分离外周血单个核细胞（PBMC），并调整细胞浓度至每毫升200万个细胞。为每组样本正确标记ELISPOT板。

长期培养的细胞加抗原提呈细胞、不含抗原提呈细胞的长期培养细胞以及体外培养的细胞。从Ellis斑点板中弃去捕获抗体，用含Tween的300微升PBS洗涤各孔，重复六次，每次均弃去洗涤液，并用移液器吸取液体。

将50微升新鲜分离的pBMCs加入指定用于长期培养细胞的孔中。同时加入APCs。用每孔200微升的完全RPMI培养基封闭L spot板上的其余孔，以平行进行流式细胞术检测细胞表型与L spot检测板的分析。

在已正确标记的圆底96孔板中加入50 µL新鲜分离的细胞。该辅助实验需与黄斑点实验联合进行，以确定应答细胞的表型。将培养板置于含5% CO2的培养箱中，39 °C孵育90分钟，使抗原呈递细胞贴壁。

在此90分钟孵育步骤期间，同时将200 ml完全RPMI培养基孵育以使其升温。从24孔板中收集长期培养的细胞，并将每只动物的四份重复样本合并至一个15 ml离心管中。

将离心管在400 × g条件下离心5分钟。通过翻转离心管弃去上清液，轻轻松动细胞沉淀，必要时加入5 ml PBS轻柔重悬沉淀。洗涤细胞两次，然后将细胞浓度调整为每毫升200,000个细胞。90分钟孵育结束后，从培养箱中取出LPO板和完全RPMI培养基。

将LPO板置于板式摇床上震荡30秒。然后通过翻转板子，用移液器向每孔加入150微升温热的完全RPMI培养基以去除未贴壁细胞。震荡板子后弃去洗涤液。

重复三次，尽可能弃去液体，然后向含有贴壁抗原提呈细胞的相应孔中每孔加入一百微升的各抗原。随后，用移液器向标注为“长期培养细胞加抗原提呈细胞”的孔中每孔加入100微升长期培养的细胞悬液，每毫升含200,000个细胞。

请确保此步骤中加入的长期培养细胞与孔中已有的抗原呈递细胞（APC）来自同一动物。切勿混合来自不同动物的APC和长期培养细胞。同时，将浓度为每毫升20万个细胞的长期培养细胞悬液以每孔100微升的量加入不含APC的孔中，用于评估长期反应。

在无抗原呈递的情况下，每孔加入100微升短期培养细胞，同时加入新分离并调整至每毫升200万细胞的细胞，用于体外反应评估。若进行流式细胞术分析，需洗涤圆底96孔板，并按照相同步骤向各孔中加入长期培养的新分离细胞和抗原。用于IFN-γ LPO板时，将培养板置于含5% CO2的培养箱中，于39°C过夜孵育。

确保平板在第14天保持平放，不要堆叠。弃去孔中的液体，用含吐温的PBS缓冲液每孔300 µL洗涤6次，每次洗涤前及洗涤间隔均将平板置于摇床上震荡10秒。随后用相同体积的蒸馏水洗涤1次，再用含吐温的PBS缓冲液重复洗涤6次。

最后，用每孔300微升的PBS洗涤细胞两次。通过将板子轻拍在纸巾或吸水垫上除去洗涤液。每孔加入100微升检测抗体，用含1%牛血清白蛋白的PBS稀释至5微克/毫升。

将培养板在39摄氏度下孵育120分钟。在此孵育期间，按照VTA染色A BC AP试剂盒标准的说明书，在使用前30分钟或在向孔中加入检测抗体后90分钟，配制碱性磷酸酶溶液。孵育120分钟后，用含吐温的PBS稀释试剂，通过翻转培养板弃去检测抗体，并用含吐温的PBS每孔300微升洗涤6次。

将酶标板在纸巾上轻拍以去除洗涤液。然后每孔加入 100 µL 碱性磷酸酶溶液。室温下孵育 45 分钟。

弃去液体，并用含吐温的 PBS 洗涤每块板六次。根据 Vector Blue™ AP 底物试剂盒三的说明书配制底物溶液。用 pH 8.2 的 0.1 摩尔 Tris-HCl 缓冲液稀释试剂。

用移液器加入50微升底物D。每孔在室温下孵育，直至蓝色开始显现，约30分钟。弃去液体，用大量蒸馏水洗涤平板。取下底部板片以暴露膜的背面，清洗各孔，并让平板自然晾干。

使用免疫斑点图像分析仪检测反应，或将培养板置于室温避光处保存，直至进行反应检测。由于反应底物具有高度稳定性，其质量可保持数年。若需通过流式细胞术评估细胞表型及细胞因子反应，请对接种于圆底96孔板中的细胞进行标准染色操作，该操作可在存在或不存在抗原呈递细胞（APCs）的条件下进行。图中展示了来自感染动物与非感染动物的体外IFN-γ ELISpot反应结果。

通过PBDB或ESAT-6、CFP-10抗原刺激来评估对结核分枝杆菌（M. bovis）的特异性反应。培养板底部的斑点是黄斑点检测法产生的有色产物。每个斑点通常代表一个分泌细胞因子的单个细胞，可定量测定来自感染动物的T细胞产生γ-干扰素（IFN-γ）的情况。

长期IFN-γ ELISpot反应以斑点形成细胞（SFCs）表示，可清晰观察到：非感染牛的细胞在抗原刺激下几乎不产生IFN-γ，无论感染或非感染牛的未刺激细胞也均无明显IFN-γ产生。应对商陆有丝分裂原（poke weed mitogen）产生强烈的T细胞反应，如图中TCM以及PPDB和ESAT-6的体外（ex vivo）反应所示。所有3头牛分枝杆菌（M. bovis）感染动物均检测到CCFP-10反应，而对照动物则仅检测到极微弱或无TCM及体外反应。

感染动物产生最佳TCM应答需要抗原提呈细胞（APCs）的存在，这一点通过长期培养细胞的应答显著降低得以证明。在缺乏自体APCs的情况下，展示了来自em、bovis感染动物及非感染动物的斑点形成细胞。每个动物的斑点形成细胞（SFC）数量通过在PPDB刺激下每10的6次方个细胞在重复样本中的SFC平均数减去仅培养基对照组的相应应答数来计算。SFC数量的差异取决于感染状态、APCs的有无以及培养时间，即长期培养与体外（ex vivo）培养的差异。