Name: 原位检测使用地高辛标记的DNA探针石蜡包埋组织中的细菌靶向16S rRNA基因 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学习使用地高辛标记的16S rRNA靶向DNA探针在石蜡包埋组织中原位检测细菌的方法。该技术可应用于牙周炎、癌症及炎症性免疫疾病等研究，帮助研究人员精确定位组织中的细菌分布。

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本研究由韩国国家研究基金会资助项目（2013R1A1A3005669）及韩国健康技术研究开发项目（HI13C0016）资助。&amp;#38;D 项目，卫生部 &amp;#38; 福利

1. 探针制备
<ol>
	<li>探针的PCR扩增
	<ol>
		<li>对于 P. gingivalis–特异性探针，扩增一段343 bp的DNA片段 P. gingivalis 使用基因组DNA通过PCR扩增16S rRNA P. gingivalis 以及以下引物：5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' 和 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'10. 按以下循环条件进行扩增：95 °C 30秒，60 °C 30秒，72 °C 1分20秒，共35个循环，随后进行5&#160;72 °C 下的最短延伸时间10,11.</li>
		<li>使用70 bp的DNA片段（5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG）扩增真细菌探针 
		TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3'）合成为寡核苷酸，并使用以下引物：5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' 和 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'11采用以下循环条件进行扩增：94 °C 变性 30 秒，60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1 分 20 秒，共 40 个循环；最后在 72 °C 延伸 5 分钟。11,12.</li>
		<li>通过加入3 M醋酸钠（pH 5.2）和100%乙醇（体积比为10:1:2），在-20 °C孵育2小时，沉淀PCR产物（≥500 µl）。</li>
		<li>在14,000 × g离心15分钟，将沉淀重悬于100 µl TE缓冲液中，并在260 nm处通过光密度测定DNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 DIG DNA 标记与检测试剂盒进行 DIG 标记
	<ol>
		<li>将3 µg探针与水混合，定容至终体积15 µl。</li>
		<li>在95 °C下变性DNA 10分钟，然后迅速置于冰上冷却。</li>
		<li>向15 µl变性的DNA中加入2 µl 10x六核苷酸混合物、2 µl dNTP标记混合物和1 µl Klenow酶。</li>
		<li>混合后于37 °C孵育24至48小时，然后在65 °C加热以终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 DIG DNA 标记与检测试剂盒检测 DIG 标记探针的灵敏度
	<ol>
		<li>手动将试剂盒中提供的阳性对照探针的系列稀释液各1 µl及1 ng DIG标记的探针加样至尼龙膜上，室温下干燥5分钟。</li>
		<li>将膜短暂浸泡于2x SSC缓冲液（0.3 M NaCl，30 mM 柠檬酸钠，pH 7.0）中，随后于80 °C孵育1小时，以固定DNA。</li>
		<li>将膜用马来酸缓冲液（MAB，0.1 M 马来酸，0.15 M NaCl，pH 7.5）短暂浸泡，随后在室温下用封闭液（试剂盒提供）按1:5,000比例稀释的抗DIG碱性磷酸酶（AP）偶联抗体溶液6 ml孵育30分钟。</li>
		<li>用 MABT（含 1% Tween 20 的 MAB）洗涤膜，然后加入 40 µl NBT/BCIP 溶液与 2 ml 检测缓冲液（0.1 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，0.05 M MgCl₂）的混合液2，pH 9.5）孵育膜1分钟。如果标记探针的灵敏度不理想，重复步骤1.1.3至1.3.4。</li>
		<li>测定标记探针的DNA浓度（OD260），并将浓度调整至100 ng/µl-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测DIG标记探针的特异性
	<ol>
		<li>变性基因组DNA样本（25 ng，3 µl）-1 每份样品）在95 °C下处理10分钟，然后迅速置于冰上冷却，所用细菌包括该特异性探针靶向的菌种及其他不同菌种。</li>
		<li>将变性的DNA手动加样至尼龙膜上，在室温下干燥20分钟。</li>
		<li>将膜短暂浸泡于2x SSC缓冲液中，随后在80 °C下孵育2小时，以固定DNA。</li>
		<li>室温下用封闭液封闭膜 1 小时。</li>
		<li>将探针稀释至 1 ng/µl-1 在杂交缓冲液中变性稀释后的探针，并将其加入膜上。</li>
		<li>在45 °C下孵育膜1小时。</li>
		<li>用2x SSC缓冲液将膜清洗三次。</li>
		<li>将膜短暂浸泡在 MAB 中。</li>
		<li>在6 ml封闭液中，将抗DIG碱性磷酸酶偶联抗体按1:2,000稀释，室温孵育1小时。</li>
		<li>用 MABT 洗涤膜，然后加入 40 µl NBT/BCIP 溶液与 2 ml 检测缓冲液的混合液。</li>
		<li>当探针未能达到预期特异性时，应逐步提高杂交温度，直至观察到特异性信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.&#160;In Situ 杂交
注意：为避免样本和试剂干燥，所有孵育步骤均需在加湿密闭容器中进行，容器内衬浸湿的纸巾。
<ol>
	<li>组织切片的脱蜡与复水
	<ol>
		<li>从石蜡包埋的组织块制备 4 µm 厚的组织切片。本方案适用于经甲醛、多聚甲醛或锌基固定液固定的组织。</li>
		<li>使用经 DEPC 处理的水配制所有试剂。</li>
		<li>将载玻片置于 60 °C 干燥烘箱中加热 30 分钟，随后在室温下孵育 30 分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入 100% 二甲苯中 5 分钟，重复三次，每次使用新鲜二甲苯。 
		注意：该脱蜡步骤应在化学通风橱中进行。</li>
		<li>将载玻片先后浸入 100% 乙醇中两次，每次 5 分钟，每次使用新鲜乙醇；随后依次在 90%、80% 和 70% 乙醇溶液中梯度复水，每步 5 分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入 DEPC 处理的水中 1 分钟，再用 DEPC 处理的 PBS（pH 7.4）洗涤 6 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织切片的预处理
	<ol>
		<li>将载玻片浸入 0.1 N 盐酸中 20 分钟，随后用 DEPC 处理的水洗涤 30 秒。</li>
		<li>使用蜡笔在组织周围绘制疏水性屏障。 
		注意：疏水性屏障的大小取决于组织样本的大小。因此，后续步骤中试剂的用量将根据样本大小而变化，但必须填满疏水性屏障（小样本使用 50 µl，大样本使用 400 µl）。</li>
		<li>在干燥烘箱中，用 50 至 400 µl 蛋白酶 K（1 至 10 µg ml-1，溶于 DEPC 处理的 PBS 中）于 37 °C 处理 30 分钟，随后用 DEPC 处理的 1x PBS 洗涤 1 分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入含 4% 多聚甲醛的 DEPC 处理 PBS 中 10 分钟，然后用 DEPC 处理的 PBS 洗涤 1 分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入含 0.5% 乙酸酐的 0.1 M 三乙醇胺-HCl（pH 8.0）溶液中 20 分钟，随后用 DEPC 处理的水洗涤 30 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>探针杂交与洗涤
	<ol>
		<li>将载玻片浸入 2x SSC 缓冲液中 20 分钟。</li>
		<li>将探针用杂交缓冲液（4x SSC、50% [vol/vol] 甲酰胺、1x Denhardt 溶液、10% [wt/vol] 硫酸葡聚糖、0.1% [wt/vol] 十二烷基硫酸钠、0.4 mg ml-1 鲑精 DNA）稀释至 1 ng µl-1。对于阴性对照，将标记探针与 10 倍过量的未标记探针混合。</li>
		<li>将稀释后的探针变性，并将 50 至 400 µl 加至组织切片上。盖上盖玻片，并用指甲油密封。</li>
		<li>将载玻片在 PCR 仪中 90 °C 加热 10 分钟，随后在加湿孵育盒中于 45 °C 或步骤 1.4.11 确定的最佳温度下过夜&#160;孵育。</li>
		<li>在 4 °C 冷却 30 分钟，移除盖玻片，并将载玻片依次浸入下列 SSC 缓冲液中：4x SSC 10 分钟，预热（45 °C）的 2x SSC 20 分钟，2x SSC 10 分钟，0.2x SSC 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用抗 DIG-AP 偶联抗体进行检测
	<ol>
		<li>用 MABT 洗涤载玻片 5 分钟。</li>
		<li>用含 1% Tween 20 的封闭液（50 至 400 µl）封闭 20 分钟。</li>
		<li>加入用封闭液稀释的抗 DIG-AP 抗体（1:1,000 稀释度）50 至 400 µl，于 37 °C 孵育 90 分钟。</li>
		<li>用 MABT 洗涤载玻片 10 分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入含 1% Tween 20 的检测缓冲液中 5 分钟。</li>
		<li>用含 1% Tween 20 的检测缓冲液配制的 1 mM 左旋咪唑溶液（50 至 400 µl）处理 5 分钟，以灭活内源性碱性磷酸酶。</li>
		<li>向每个样本加入 50 至 400 µl 预混的 NBT/BCIP 溶液（用检测缓冲液 1:100 稀释），在加湿孵育盒中室温孵育 2 至 3 小时，直至显色信号达到满意程度。</li>
		<li>用去离子水冲洗载玻片以终止显色反应，并在 37 °C 下加入 50 至 400 µl 0.05% [wt/vol] 甲基绿作为复染剂，染色 10 分钟。</li>
		<li>用去离子水冲洗载玻片，用 100% 乙醇脱水，再浸入二甲苯中。</li>
		<li>向每张载玻片滴加 80 µl 封片液，盖上盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+human+gingiva.+II.+The+lower+part+of+the+pocket+epithelium+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis.</a> J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).</li>
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<li>Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+localization+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.+in+human+periodontitis.+I.+Light%2C+immunofluorescence+and+electron+microscopic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies.</a> J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).</li>
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<li>Rautemaa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Porphyromonas+gingivalis.+thiol+proteinase+in+periodontal+tissues+of+chronic+periodontitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients.</a> Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).</li>
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<li>Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intracellular+oral+species+within+human+crevicular+epithelial+cells+from+subjects+with+chronic+periodontitis+by+fluorescence+in+situ.+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization.</a> J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).</li>
<li>Abrams, K., Caton, J., Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+comparisons+of+interproximal+gingival+tissues+related+to+the+presence+or+absence+of+bleeding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding.</a> J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Porphyromonas+gingivalis.+and+plasma+cell+dominance+in+gingival+tissues+with+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis.</a> Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis.+and+dextran+sodium+sulfate+induce+periodontitis+through+the+disruption+of+physical+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers.</a> Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).</li>
<li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bacterial+invasion+and+differential+expression+of+tight+junction+proteins%2C+growth+factors%2C+and+growth+factor+receptors+in+periodontal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions.</a> J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).</li>
<li>Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).</li>
<li>Hajishengallis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Low-abundance+biofilm+species+orchestrates+inflammatory+periodontal+disease+through+the+commensal+microbiota+and+the+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement.</a> Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).</li>
<li>Axon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer+and+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer and Helicobacter pylori.</a> Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).</li>
<li>Fenhalls, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+transcripts+in+human+lung+granulomas+reveals+differential+gene+expression+in+necrotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions.</a> Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种利用地高辛标记的DNA探针在石蜡包埋组织中定位细菌的实验方案。该探针靶向细菌16S rRNA基因的DNA或RNA分子，且可根据需要将16S rRNA靶向探针设计为种特异性或通用型。先前研究已证实，P. gingivalis特异性探针仅与P. gingivalis特异性杂交，而不与其他口腔细菌发生交叉反应10。相比之下，真细菌（eubacterial）探针可与所测试的所有细菌基因组DNA（共17种不同物种）杂交，但杂交效率存在差异12。探针中T核苷酸的数量决定了地高辛标记的效率，因此制备高灵敏度的地高辛标记探针是本方案成功实施最关键的步骤。使用盐酸处理样本可通过去除蛋白质及部分水解靶序列来提高信噪比。增加蛋白酶K的浓度可提高探针对靶标的可及性，但会降低组织结构的完整性，因此建议根据组织类型优化蛋白酶K的多个浓度进行测试。乙酰化步骤通过乙酰化组织中带正电荷的氨基基团，减少带负电荷探针与组织蛋白之间的非特异性背景结合。经过上述一系列预处理步骤后，组织切片容易破损，因此操作时需格外小心。与荧光原位杂交（FISH）相比，本方法背景信号极低；然而，对于骨组...

细菌在多种口腔疾病（如牙周炎、牙髓炎、冠周炎、蜂窝织炎和骨髓炎）的发病机制中起着重要作用。为了理解细菌在疾病发生过程中的作用并监测治疗效果，明确细菌在组织内的定位至关重要。已有多种方法用于检测牙周炎患者牙龈组织中细菌的存在，包括电子显微镜1,2、使用细菌特异性抗体的免疫组织化学和免疫荧光技术3-7，以及针对16S rRNA的荧光标记寡核苷酸探针进行的荧光原位杂交（FISH）8。然而，由于技术限制或操作困难，这些方法尚未被广泛应用。与抗体相比，靶向16S rRNA的探针更易于制备，并可实现物种特异性检测。FISH已被证实是可视化自然环境中细菌（如菌斑生物膜）的优良工具。然而，由于各种组织成分存在自发荧光，FISH在组织样本中的应用受到限制。例如，当炎症组织伴有出血时，红细胞强烈的自发荧光常常干扰荧光技术的应用9。
为了在炎症的牙龈组织中定位细菌，因此，一种 原位 采用地高辛（DIG）标记的DNA探针的杂交方法已得到开发并成功应用10,11. 本文详细介绍了利用石蜡包埋组织进行细菌定位的实验方案 P. gingivalis-特异性和通用真细菌探针的使用方法已有描述。该方法尤其注重标准化，以确保其他实验室能够获得相似的结果。本方案可在组织学背景下实现细菌的定位，且结果具有高度可重复性。所述方案可用于在多种组织中以物种特异性或通用方式定位细菌。通用探针在检测多微生物感染性疾病中的细菌，以及研究特定细菌作用尚不明确的疾病中细菌的潜在作用时尤为有用。

<table><tbody><tr><td>乙酸酐</td><td>Sigma</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>50% 硫酸葡聚糖溶液</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>50X Denhardt&amp;rsquo;s 溶液</td><td>Sigma</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>P159220</td><td></td></tr><tr><td>DIG DNA 标记与检测试剂盒</td><td>Roche</td><td>11 093 657 910</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge&amp;trade; 笔</td><td>Dako</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>Vector</td><td>SP-5000</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>马来酸</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>甲基绿</td><td>Sigma</td><td>M6776</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精 DNA 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>#15632-011</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Duksan</td><td>D1420</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Amresco</td><td>227</td><td></td></tr><tr><td>三乙醇胺-HCl</td><td>Sigma</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Research organics</td><td>3098T</td><td></td></tr></tbody></table>

原位检测石蜡包埋组织中的细菌：使用地高辛标记的靶向16s rrna的dna探针

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

已有多种方法报道了牙周炎患者牙龈活检组织中袋上皮及下方结缔组织内存在细菌，这些方法包括电子显微镜、使用细菌特异性抗体的免疫组织化学或免疫荧光，以及使用荧光标记寡核苷酸探针的荧光原位杂交（FISH）。然而，由于技术局限性或操作困难，这些方法尚未得到广泛应用。本文介绍了一种利用地高辛标记的DNA探针在石蜡包埋组织中定位细菌的方法。石蜡包埋组织是病理标本库中最常见的活检组织形式。该方法既可用于特异性检测特定菌种，也可用于广谱性检测多种细菌。细菌信号可表现为离散形态（球状、杆状、梭形及毛状）或弥散形态。该技术还能同时获取其他组织学信息：上皮组织、结缔组织、炎性浸润细胞及血管结构均可清晰分辨。本方法可用于研究细菌在多种疾病中的作用，例如牙周炎、癌症以及炎症性免疫疾病。

图1 显示了DIG标记探针的点杂交结果，并与试剂盒提供的阳性对照探针进行比较，以确定其灵敏度。该片段为343 bp P. gingivalis-特异性探针的灵敏度是70 bp真细菌探针的25倍。 图2 显示 原位 慢性牙周炎患者牙龈组织的杂交以检测 P. gingivalis 和真细菌。细菌信号（以紫色显示）在上皮层、固有层以及位于组织外的生物膜中被检测到。然而，其分布情况 P. gingivalis 牙龈组织内的真细菌群落存在差异。在高倍放大（1,000X）下，使用真细菌探针可观察到多种形态的细菌（球状、杆状、梭形和毛发状），而仅能通过 P. gingivalis特异性探针。还观察到细菌信号的弥散形式。
Hajishengallis 等 研究表明，共生细菌在小鼠P. gingivalis诱导的实验性牙周炎发展过程中起着关键作用14。将破坏紧密连接（tight junc...

本文描述了一种利用地高辛标记的靶向16S rRNA的DNA探针在石蜡包埋组织中定位细菌的方法。该方案可用于研究细菌在多种疾病（如牙周炎、癌症以及炎症性免疫疾病）中的作用。

原位检测石蜡包埋组织中的细菌：使用地高辛标记的靶向16S rRNA的DNA探针

牙周炎患者牙龈活检组织中，牙周袋上皮及下方结缔组织内存在细菌已被……

本实验的总体目标是利用地高辛标记的16S核糖体RNA靶向DNA探针，在石蜡包埋组织中定位细菌。该目标通过以下步骤实现：首先通过PCR扩增并用地高辛标记制备探针；第二步是处理组织切片，以增加靶标位点的可及性，并减少背景结合。接下来，将制备好的组织切片与地高辛标记的探针进行杂交。最后，利用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体检测杂交后的探针。最终，该原位杂交方法可用于检测石蜡包埋组织中细菌的存在。相较于现有的 ING 等方法，本检测技术的优势在于能够在特定组织学结构背景下检测细菌 SHS。该方法有助于深入理解发病机制，并适用于多种炎症性疾病的研究，如牙周炎和 R 行星病。由于组织切片在制备和杂交消化过程中极易受损，因此对该方法进行可视化演示至关重要。使用70个碱基对的DNA片段作为模板，以两个15个碱基对的引物通过PCR扩增U细菌探针。在已知浓度的缓冲液中收集扩增产物，然后使用dig DNA标记与检测试剂盒对探针进行标记。首先将三微克探针加入15微升水中混匀。在95摄氏度的加热块中变性探针10分钟。然后将变性的探针置于冰上。接下来，加入两微升10 XH核苷酸、两微升DN NTPs以及一微升连接酶。混合后，将探针在37摄氏度下孵育24至48小时。通过将混合物加热至65摄氏度来终止反应。然后在260纳米处测定标记探针的DNA浓度，并将浓度调整至每微升100纳克。使用试剂盒，首先在尼龙膜上检测探针的灵敏度，点样一微升梯度稀释的阳性对照。探针及地高辛标记的探针。将膜在室温下干燥五分钟。干燥后，将膜短暂浸入2×SSC溶液中，随后转移至80摄氏度的培养箱中孵育一小时。孵育结束后，为固定膜上的DNA，先将膜短暂浸泡于马来酸缓冲液中，半小时后转移至含有碱性磷酸酶（AP）偶联抗体的封闭缓冲液中，抗体稀释比例为1:5,000。用 MABT 洗涤膜。然后将 40 微升 N-B-T-B-C-I-P 加入 2 毫升检测缓冲液中混匀。温育后，将此混合液加入膜中，孵育一分钟。按照文本方案中所述去除石蜡并重新水化组织切片后，将切片进行原位杂交前的准备：首先将载玻片浸入0.1 N盐酸中20分钟。酸处理后，用经DEPC处理的水清洗载玻片30秒。然后使用蜡笔在每张载玻片上圈出标本区域。接下来，根据样本大小，向样本中加入 50 至 400 微升的蛋白酶 K 溶液。在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，使酶发挥作用，然后将切片在 DEPC 处理的 1×PBS 中洗涤 1 分钟。随后将切片转移至含 4% 多聚甲醛的 DEPC 处理 PBS 溶液中，固定 10 分钟。用 PBS 洗去固定剂，操作同前。然后将切片浸入 pH 8 的 0.1 摩尔三乙醇胺盐酸盐溶液中，加入 0.5% 醋酸和氢化物，20 分钟后，用清水如前所述洗去溶液。现在开始进行 C 两步法，首先将切片浸入 2 × SSC 溶液中 20 分钟。同时，将标记的探针用杂交缓冲液稀释至每微升一纳克，作为阴性对照；未标记探针的使用浓度为标记探针的10倍。随后将探针在90摄氏度加热10分钟以使其变性，然后迅速置于冰上冷却。接下来，向每张切片加入与之前加入蛋白酶K相同体积的探针稀释液。然后小心地加盖盖玻片，并用指甲油密封切片区域。随后，将切片置于PCR仪的加热块上，在90摄氏度加热10分钟，接着于次日将其转移至45摄氏度的湿化培养箱中过夜孵育。将切片在 4 摄氏度下冷却半小时，然后小心地移除盖玻片。组织较为脆弱。最后，将切片在室温下依次通过一系列 SSC 缓冲液。首先，将NC双杂交切片在MABT中洗涤五分钟。然后，在含1%吐温20的封闭液中加入50至400微升，室温孵育20分钟。封闭孵育后，加入50至400微升稀释比例为1:1000的抗地高辛碱性磷酸酶抗体与封闭液的混合液。一抗孵育后，在37摄氏度下结合90分钟。用MABT清洗切片10分钟，然后将切片置于含1%吐温20的检测缓冲液中5分钟。现在向每张载玻片加入50至400微升含一毫摩尔浓度OLE的检测缓冲液，孵育5分钟以灭活内源性碱性磷酸酶。接着，向每张载玻片加入50至400微升用检测缓冲液按1:100稀释的N-B-T-B-C-I-P，根据经验将载玻片置于湿化 chamber 中孵育2至3小时。用去离子水冲洗载玻片，然后加入0.05%（重量/体积）的甲基绿，室温下对组织进行复染，作用10分钟，37摄氏度。再次用去离子水冲洗载玻片，随后用100%乙醇脱水，再浸入二甲苯中。 最后，加入80微升封片剂并盖上盖玻片。探针杂交后的切片进行dig标记。将其灵敏度与阳性对照探针的系列稀释液进行比较。343个碱基对的牙龈卟啉单胞菌特异性探针的灵敏度比经过改造的70个碱基对细菌探针高25倍。随后，将这两种探针应用于慢性牙周炎患者牙龈组织的高倍显微观察。使用细菌探针可分辨出细菌的不同形态。尽管牙龈卟啉单胞菌特异性探针仅检测到杆状细菌，但将一种可破坏紧密连接的化学物质DSS施用于小鼠的牙龈黏膜。利用这些小鼠的组织样本，在不同背景下比较了各探针的检测效果。在此情况下，U细菌探针能够检测到其他探针无法检测的细菌。随后测试了U细菌探针对含有肿瘤的肺组织切片中其他细菌的检测能力。在肿瘤外部以及肿瘤内部均检测到了细菌。在检查口腔扁平苔藓（一种病因未明的疾病）患者的组织时，该细菌探针在观察到炎症浸润的上皮细胞和固有层细胞内检测到了细菌信号。自该技术问世以来，已帮助传染病领域的研究人员探索细菌在人类和动物组织中的侵袭情况。通过此方法，还可结合免疫化学检测细胞标志物的表达等其他技术，以回答更多问题，例如哪些类型的细胞在组织内携带细菌。

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免疫学与感染

原位检测使用地高辛标记的DNA探针石蜡包埋组织中的细菌靶向16S rRNA基因

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

来源：Choi, Y. S., 等。利用地高辛标记的靶向16S rRNA的DNA探针在石蜡包埋组织中进行细菌原位检测。J. Vis. Exp.

小鼠牙龈组织切片中细菌的原位检测

本视频展示了尿路感染患者去石蜡化的膀胱组织中细菌的可视化。荧光标记的探针与细菌16S核糖体RNA杂交，可揭示与组织相关的细菌及其分布情况，从而提供有关样本内细菌密度的空间信息。...

通过荧光原位杂交技术在膀胱活检切片中可视化细菌

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

本视频旨在演示如何进行 从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系中自动化提取DNA及数字滴定PCR (ddPCR) 分析用于在临床环境中检测稀有突变。在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中检测突变，证明了 ddPCR 在 FFPE...

采用数字滴定PCR检测福尔马林固定石蜡包埋参考标准细胞系中的BRAF V600E突变

本文介绍了一种利用改良的整体原位杂交方法，对蜱肠道内可存活微生物群在空间和时间上的分布进行评估的实验方案。...

通过整体染色法观察蜱肠道微生物群 原位 杂交

本实验方案的目的是对已包埋于石蜡中并切片至载玻片上的成年珊瑚样品进行原位杂交。这是一种定性方法，用于在石蜡包埋的组织中可视化RNA反义探针的空间表达情况。...

原位杂交技术用于石蜡包埋的成年珊瑚样品

通过16S rRNA荧光原位杂交法检测膀胱活检组织中的组织驻留细菌

这一简化的实验方案详细描述了从组织固定到利用荧光标记微生物，以检测和成像复杂组织样本中细菌的工作流程 原位 杂交...

通过荧光技术可视化肠道微生物群-宿主相互作用 原位 杂交、凝集素染色与成像

肠道微生物，包括胞外细菌以及奥尔赛病毒和微孢子虫（真菌）等胞内病原体，常与野生Caenorhabditis线虫相关。本文介绍了一种用于检测和定量定植和/或感染C.

RNA荧光 原位 杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

本方案提供了一种可重复的方法，用于在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中可视化基因扩增。...

福尔马林固定石蜡包埋样本中基因扩增的荧光原位杂交稳健检测

学习使用地高辛标记的16S rRNA靶向DNA探针在石蜡包埋组织中原位检测细菌的方法。该技术可应用于牙周炎、癌症及炎症性免疫疾病等研究，帮助研究人员精确定位组织中的细菌分布。

原位检测石蜡包埋组织中的细菌：使用地高辛标记的靶向16S rRNA的DNA探针

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