原位检测石蜡包埋组织中的细菌：使用地高辛标记的靶向16S rRNA的DNA探针

本实验的总体目标是利用地高辛标记的16S核糖体RNA靶向DNA探针，在石蜡包埋组织中定位细菌。该目标通过以下步骤实现：首先通过PCR扩增并用地高辛标记制备探针；第二步是处理组织切片，以增加靶标位点的可及性，并减少背景结合。

接下来，将制备好的组织切片与地高辛标记的探针进行杂交。最后，利用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体检测杂交后的探针。最终，该原位杂交方法可用于检测石蜡包埋组织中细菌的存在。

与现有方法（如ING）相比，该检测方法的优势在于能够在某些组织学结构的背景下检测细菌SHS。该方法有助于深入理解发病机制，并适用于多种炎症性疾病的研究，如牙周炎和R行星病。由于组织切片容易受损，组织制备和杂交消化步骤操作困难，因此对该方法进行可视化演示至关重要。

使用一段70个碱基对的DNA片段作为模板，以两个15个碱基对的引物通过PCR扩增来制备U型细菌探针。将扩增产物收集于已知浓度的缓冲液中，随后使用dig DNA标记与检测试剂盒对探针进行标记。

首先将三微克探针加入15微升水中混匀。在95摄氏度的加热块中变性探针10分钟。然后将变性的探针置于冰上。

接着，加入2 µL的10 XH核苷酸、2 µL的DN NTPs以及1 µL的canal酶。混匀后，将探针在37°C下孵育24至48小时。通过将混合物加热至65°C来终止反应。

然后在260纳米处测定标记探针的DNA浓度，并将其浓度调整至100纳克/微升。使用试剂盒，首先在尼龙膜上检测探针的灵敏度，点样1微升梯度稀释的阳性对照。探针及地高辛标记的探针。

将膜在室温下干燥五分钟。干燥后，将膜短暂浸入2×SSC溶液中，随后转移至80摄氏度的培养箱中孵育一小时。孵育结束后，为固定膜上的DNA，先将膜短暂浸泡于马来酸缓冲液中，半小时后转移至含有碱性磷酸酶（AP）偶联抗体的封闭缓冲液中，抗体稀释比例为1:5,000。

用 MABT 洗涤膜。然后将 40 微升 N-B-T-B-C-I-P 加入 2 毫升检测缓冲液中混匀。洗涤后，将此混合液加入膜中孵育 1 分钟。

按照文本方案中所述去除石蜡并重新水化组织切片后，将切片进行原位杂交前的准备：首先将载玻片浸入0.1 N盐酸溶液中20分钟。酸处理后，用经DEPC处理的水清洗载玻片30秒。然后使用蜡笔在每张载玻片上圈出标本区域。

接下来，根据样本大小，向样本中加入 50 至 400 微升蛋白酶 K 溶液。在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，使酶发挥作用，然后将玻片在 DEPC 处理的 1×PBS 中洗涤 1 分钟。随后将玻片转移至含 4% 多聚甲醛的 DEPC 处理 PBS 中固定 10 分钟。

用 PBS 洗去固定剂，操作同前。然后将载玻片浸入 pH 为 8 的 0.1 摩尔三乙醇胺盐酸盐溶液中，加入 0.5% 乙酸和氢化物，20 分钟后，用清水如前所述洗去载玻片上的溶液。现在开始进行 C 两步法，首先将载玻片浸入 2 × SSC 溶液中 20 分钟。

同时，将标记的探针用杂交缓冲液稀释至每微升一纳克，作为阴性对照；未标记探针的使用浓度为标记探针的10倍。随后将探针在90摄氏度加热10分钟以进行变性，然后迅速置于冰上冷却。

接下来，向每张切片加入与之前加入蛋白酶K相同体积的探针稀释液。然后小心地盖上盖玻片，并用指甲油封片。将切片置于PCR仪的加热块上，在90摄氏度加热10分钟，随后于次日转移至45摄氏度的湿化培养箱中过夜孵育。

将载玻片在 4 摄氏度下冷却半小时，然后小心地移除盖玻片。组织较为脆弱。最后，将载玻片在室温下依次通过一系列 SSC 缓冲液。

首先，将NC双杂交切片在MABT中洗涤五分钟。然后加入50至400微升含1%吐温20的封闭液，封闭20分钟。封闭孵育后，加入50至400微升1:1000稀释的抗地高辛碱性磷酸酶抗体与封闭液。

一抗孵育后，在37摄氏度下结合90分钟。用MABT缓冲液洗涤切片10分钟，随后将切片置于含1% Tween 20的检测缓冲液中孵育5分钟。

现在向每张载玻片加入50至400 µL浓度为1 mM的ole检测缓冲液溶液，孵育5分钟以灭活内源性碱性磷酸酶。接着，向每张载玻片加入50至400 µL用检测缓冲液按1:100稀释的N-B-T-B-C-I-P，根据经验将载玻片置于湿化 chamber 中孵育2至3小时。

用去离子水冲洗载玻片，然后加入0.05%（重量/体积）的甲基绿溶液，室温下对组织进行复染，作用10分钟，温度保持在37摄氏度。再次用去离子水冲洗载玻片，随后用100%乙醇脱水，再浸入二甲苯中透明。

最后，加入 80 µL 封片剂并加盖盖玻片。探针杂交后的载玻片进行染色标记，其灵敏度与阳性对照探针的稀释液进行比较。

343个碱基对的牙龈卟啉单胞菌特异性探针的灵敏度是经基因改造的70个碱基对细菌探针的25倍。随后，将这两种探针应用于慢性牙周炎患者牙龈组织的高倍显微观察。使用细菌探针可分辨出细菌的不同形态。

尽管牙龈卟啉单胞菌特异性探针仅检测到杆状细菌，但将一种可破坏紧密连接的化学物质DSS施用于小鼠的牙龈黏膜。利用这些小鼠的组织样本，在不同背景下比较了各探针的检测效果。在此情况下，U细菌探针能够检测到其他探针无法检测的细菌。

随后测试了U细菌探针对含有肿瘤的肺组织切片中其他细菌的检测能力。在肿瘤外部以及肿瘤内部均检测到了细菌。在检查口腔扁平苔藓（一种病因未明的疾病）患者的组织时，该细菌探针在观察到炎症浸润的上皮细胞和固有层细胞内检测到了细菌信号。

自该技术问世以来，已帮助传染病领域的研究人员探索细菌在人类和动物组织中的侵袭情况。通过该方法，还可结合免疫化学检测细胞标志物等其他技术，以回答更多问题，例如组织中哪些类型的细胞容纳了细菌。