原位检测使用地高辛标记的DNA探针石蜡包埋组织中的细菌靶向16S rRNA基因

该程序的总体目标是使用 DIG 标记的 16 s 核糖体 RNA，靶向 DNA 探针定位石蜡包埋组织中的细菌。这是通过首先准备带有 PCR 扩增和 DIG 标记的探针来实现的。第二步是准备组织切片，使其具有更容易接近的靶位点和更少的背景结合。

接下来，将制备的组织切片与 dig 标记的探针杂交。最后，用碱性磷酸酶检测杂交探针，标记的抗 D dig 抗体。最终，这种 C 2 杂交方法可以显示细菌与石蜡包埋组织的存在。

与 ING 等现有方法相比，这种检测的领域优势在于，该方法可以在某些组织学结构的背景下检测细菌 SHS。这种方法可以提供对发病机制的见解，但会各种炎症如牙周炎和 R 行星。这种方法的视觉演示至关重要，因为组织制备和杂交消化步骤很难进行，因为组织切片很容易损坏。

为了制备 U 细菌探针，使用一个 70 个碱基对的 DNA 片段作为模板和两个 15 个碱基对的引物，通过 PCR 扩增探针。在缓冲液中收集已知浓度的扩增子。然后用 dig DNA 标记和检测试剂盒标记探针。

首先将 3 微克探针混合到 15 微升水中。将探针在加热块中在 10 摄氏度下变性 95 分钟。然后将变性的探针放在冰上。

接下来，加入 2 微升 10 XH 核苷酸、2 微升 DN NTP 和 1 微升管酶。混合后，让探针在 37 摄氏度下孵育 24 至 48 小时。通过将混合物加热到 65 摄氏度来终止反应。

然后在 260 纳米处测量标记探针的 DNA 浓度，并将浓度调整为 100 纳克/微升。使用该试剂盒，首先检查探针的灵敏度，在尼龙膜上加载 1 微升连续稀释的阳性对照。探测并挖掘标记的探针。

让膜干燥 5 分钟。干燥后，将膜短暂浸入两个 XSSC 中，然后将其转移到 80 摄氏度的培养箱中一小时。为了在孵育后固定 DNA，将膜短暂浸泡在马来酸缓冲液中，然后在半小时后将其转移到用 1 至 5， 000 稀释的 AP 偶联抗体浓缩的封闭缓冲液中。

在 MABT 中洗涤膜。然后将 40 微升 N-B-T-B-C-I-P 混合到 2 毫升检测缓冲液中。沐浴后，将这种混合物加入膜中一分钟。

按照文本方案中的说明去除石蜡并重新水化组织切片后，准备进行 C 中两次杂交：首先将玻片浸入 0.1 正常盐酸中 20 分钟。酸浴后，用 DEPC 处理过的水洗掉玻片 30 秒。然后用蜡笔勾勒出每张载玻片上的标本。

接下来，根据样本的大小，向样本中加入 50 至 400 微升蛋白酶 K 溶液。让酶在 37 摄氏度下工作 30 分钟，然后在经过 DEPC 处理的 1 个 XPBS 中洗涤玻片 1 分钟。现在将玻片转移到 DEPC 处理的 PBS 中的 4% 多聚甲醛中 10 分钟。

像以前一样用 PBS 洗掉固定剂。然后在 20 分钟后将玻片浸泡在 pH 值为 8 的 0.1 摩尔盐酸三乙醇胺中，加入 0.5% 乙酸和氢化物，像以前一样用清水洗掉玻片。现在开始 C 2，首先将玻片浸入两个 XSSC 中 20 分钟。

同时，在杂交缓冲液中将标记的探针稀释至每微升 1 纳克，以获得阴性对照。使用浓度为未标记探针浓度的 10 倍。然后通过在 90 摄氏度下加热探针 10 分钟使探针变性，然后在冰上快速冷却它们。

接下来，将与先前应用的蛋白酶 K 相同体积的探针稀释液应用于每张载玻片。然后小心地盖住衬片并使用指甲油密封切片。现在，将玻片在 PCR 机模块上以 90 摄氏度加热 10 分钟，然后在第二天将它们转移到 45 摄氏度的加湿培养箱中过夜。

将玻片在 4 摄氏度下冷却半小时，然后小心地取下盖玻片。组织很脆弱。最后，在室温下将载玻片通过一系列 SSC 缓冲液。

首先，在 MABT 中洗涤 NC 2 杂交玻片 5 分钟。然后将 50 至 400 微升封闭溶液在 1% 吐温 20 中涂抹 20 分钟。封闭孵育后，应用 50 至 400 微升 1 至 1000 抗 D dig 碱性磷酸酶抗体和封闭溶液。

施用初级后，让它在 37 摄氏度下粘合 90 分钟。在 MABT 中洗涤玻片 10 分钟。然后将玻片放入含有 1% 吐温 20 的检测缓冲液中 5 分钟。

现在将 50 至 400 微升 1 毫摩尔烯的检测缓冲液涂到每张玻片上，并孵育 5 分钟以灭活内源性碱性磷酸酶。接下来，加入 50 至 400 μL 的 N-B-T-B-C-I-P 检测。每张玻片缓冲 1 到 100 个，并根据经验让玻片在加湿室中孵育 2 到 3 小时。

用去离子水冲洗玻片，然后涂上 0.05% 重量的甲基绿，让复染剂在组织上工作 10 分钟。在 37 摄氏度。再次用去离子水洗涤载玻片，然后用 100% 乙醇脱水，然后浸入二甲苯中。

最后，涂抹 80 微升封固剂和盖玻片。探针后的载玻片被挖掘标记。将它们的灵敏度与阳性对照探针的稀释度进行了比较。

3 43 个碱基对 p gingivalis 特异性探针的灵敏度是工程化的 25 个碱基对细菌探针的 70 倍。然后将两个探针以高倍率应用于慢性牙周炎患者的牙龈组织。使用细菌探针可以识别各种形状的细菌。

虽然 p gingivalis 特异性探针仅检测到杆状细菌，但将破坏化学 DSS 的紧密连接应用于小鼠的牙龈粘膜。来自这些小鼠的组织样本用于比较不同背景下的探针。在这里，U 细菌探针能够检测到其他探针无法检测到的细菌。

接下来测试 U 细菌探针检测含有肿瘤的肺组织切片中其他细菌的能力。在肿瘤外部和肿瘤内部均检测到细菌。在检查口腔扁平苔藓（一种病因不明的疾病）患者的组织时，细菌探针在观察到炎症浸润的上皮和固有层细胞内检测到细菌信号。

自开发以来，该技术已帮助传染病领域的研究人员按照此程序探索细菌侵入人类和动物的组织。其他方法，如免疫化学检测、细胞标志物生长，可以进行 ED 以回答其他问题，例如组织内含有哪种细胞的细菌。