Name: 细胞周期进程的时间跟踪使用流式细胞仪，无需同步 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习使用溴脱氧尿苷标记结合DNA染料和抗体标记技术，对S期细胞进行时间追踪分析。该方法无需细胞同步化，可详细追踪细胞命运，适用于细胞生物学和神经科学研究。

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本工作由美国白血病与淋巴瘤协会（6105-08）、新南威尔士州癌症理事会资助（13-02）、澳大利亚国家健康与医学研究委员会高级研究员基金（LJB）（1042305）以及项目基金（1041614）资助。

本方案采用急性淋巴细胞白血病细胞系 NALM6，但也可应用于其他细胞类型。
1. 溶液与试剂
<ol>
	<li>完全 RPMI 培养基
	<ol>
		<li>向 500 ml 的 RPMI-1640 培养基中加入 56 ml 胎牛血清（FCS）和 5.5 ml 的 200 mM L-谷氨酰胺。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BrdU 储存液
	<ol>
		<li>在杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中配制 32.5 mM BrdU（10 mg/ml）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>含 BrdU 的完全 RPMI 培养基
	<ol>
		<li>将 6.2 µl BrdU 储存液加入 10 ml 完全 RPMI 培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNase 溶液
	<ol>
		<li>在 DPBS 中配制 1 mg/ml 的 DNase 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色缓冲液
	<ol>
		<li>在 DPBS 中配制含 3% 热灭活 FCS 和 0.09% 叠氮化钠的染色缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定缓冲液、通透缓冲液和洗涤缓冲液的定义请参见材料列表。</li>
</ol>
2. 细胞
注意：细胞培养时间不超过6个月。本方法可直接适用于任何非贴壁细胞系，只需调整细胞密度和培养基。实验开始时应使用处于指数生长期的细胞。
<ol>
	<li>在T-75培养瓶中用完全RPMI培养基培养NALM6细胞。所有操作均须在II级生物安全柜中无菌条件下进行。
	<ol>
		<li>通过每周分瓶三次，将NALM6细胞密度维持在每毫升1–2 × 106 个细胞之间。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2 的空气环境中孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用 BrdU 对细胞进行脉冲标记
注意：BrdU 可能具有致突变性和致畸性，操作时需小心谨慎。
<ol>
	<li>以 150 × g 离心 5 分钟。注意：将细胞转移至新鲜培养基中可提高实验结果的可重复性。</li>
	<li>进行细胞计数，并将细胞以完全 RPMI 培养基重悬至浓度为 2 × 106 个细胞/ml。</li>
	<li>用 BrdU 完全 RPMI 培养基将细胞按 1:2 比例稀释，最终细胞浓度为 1 × 106 个细胞/ml。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 45 分钟，然后用完全 RPMI 培养基按 1:10 比例稀释细胞。以 150 × g 离心 5 分钟，并小心弃去所有上清液。</li>
	<li>用少量（约 100 µl）完全 RPMI 培养基重悬细胞，进行细胞计数，并调整至 1 × 106 个细胞/ml。</li>
	<li>用移液器将 1 ml 细胞悬液加入 48 孔板的各孔中。向未使用的孔中加入 1 ml DPBS，以获得更可重复的实验结果。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 及空气条件下孵育指定时间点，此处为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 和 24 小时。注意：孵育时间长度取决于实验设计所要检测的目标。</li>
	<li>用移液器将所有细胞转移至流式管中。用 PBS 依次冲洗孔板，每次 1 ml，最终总体积达 5 ml。</li>
	<li>以 150 × g 离心 5 分钟，并小心移除所有上清液。细胞即可用于染色，请立即进行后续染色步骤（第 4 部分）。</li>
</ol>
4. 细胞染色
注意：如果需要对细胞进行表面染色，应在固定前完成，并确保整个过程中细胞始终保存在 4 °C。
<ol>
	<li>重悬细胞于 100 µl 染色缓冲液（如需进行可选的表面染色，加入推荐体积的针对表面抗原的抗体，于30分钟内孵育） 4 °C).</li>
	<li>加入1 ml染色缓冲液，150 × g离心5 min，弃上清液。 
	注：特异性抗体、浓度、孵育时间 等等。 将根据具体的实验目标而有所不同。</li>
	<li>固定与通透
	<ol>
		<li>重悬细胞于 100 µl 加入固定缓冲液，室温孵育15分钟。</li>
		<li>加入1 ml洗涤缓冲液，150 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于 100 µl 加入破膜缓冲液，冰上孵育细胞10分钟。</li>
		<li>加入1 ml洗涤缓冲液，150 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于 100 µl 每管加入固定缓冲液，室温孵育5分钟。</li>
		<li>加入1 ml洗涤缓冲液，150 × g离心5分钟，弃去上清液。 
		注意：如有需要，此处可暂停实验方案。固定后的细胞在数天内保持稳定 4 °C 若用染色缓冲液重悬，则在离心后去除染色缓冲液再进行后续操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNase 处理
	<ol>
		<li>重悬细胞于 100 µl DNase 溶液的30 µg DNase/106 细胞）并在 37°C 下孵育细胞 1 小时 37 °C.</li>
		<li>加入1 ml洗涤缓冲液，150 × g离心5分钟，弃上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体染色 
	注意：除 BrdU 外的其他细胞内标志物染色可与 BrdU 染色同时进行。
	<ol>
		<li>重要提示：准备补偿对照，包括未染色细胞和分别用每种单一荧光染料标记的细胞。理想情况下，补偿对照应使用与实验管中相同的抗体。若不可行，可选用针对高表达抗原、偶联相同荧光染料的替代抗体。</li>
		<li>将细胞重悬于 50 µl 洗涤缓冲液并加入 1 µl/106 BrdU 抗体的细胞。注意：也可添加针对其他特异性细胞内抗原的直接偶联抗体。   
		注意：可使用针对组蛋白 H3 在 Ser10 位点磷酸化的抗体来区分处于 G2 期和 M 期的细胞，因为组蛋白 H3 在有丝分裂期间会发生 Ser10 位点的磷酸化。10 抗cdc2 Tyr15磷酸化抗体可用于检测已进入有丝分裂的细胞。11</li>
		<li>将细胞在室温下孵育20分钟。</li>
		<li>加入1 ml洗涤缓冲液，150 × g离心5分钟，弃上清液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="6">
	<li>用于细胞周期分析的DNA染色
	<ol>
		<li>轻轻悬浮沉淀，并加入20 µl 7-AAD溶液（0.25 µg）。注意：必须使用恒定数量的7-AAD/细胞。</li>
		<li>将细胞重悬于1 ml染色缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 流式细胞术数据的采集
注意：所需的仪器取决于所用荧光染料的数量和性质。
<ol>
	<li>采集以下参数：FSC-A、SSC-A、FSC-H（可使用 FSC-W 替代 FSC-H），以及 7-AAD 荧光信号（线性刻度）。APC 通道采用对数刻度采集。如需检测表面标记或内部标记，其他所需通道均使用对数刻度采集。</li>
	<li>在分析样本前，对不同荧光染料间发射光谱重叠信号进行补偿校正。注意：大多数流式细胞仪可自动完成此步骤。</li>
	<li>每份样本至少采集 10,000 个事件。</li>
</ol>
6. 流式细胞术数据分析
注意：本研究使用 FlowJo 进行流式细胞术数据分析，但也可使用其他软件包。门控策略如图1所示。
<ol>
	<li>使用FSC-A和SSC-A参数确定活细胞群体。</li>
	<li>在该群体内，利用FSC-A和FSC-H排除双联体和聚集体（此处也可使用FSC-W）。</li>
	<li>在该群体内设置点图，x轴为7-AAD，y轴为BrdU-APC。</li>
</ol>
<img alt="流式细胞术分析、细胞群体数据示意图、SSC-A 与 FSC-A、FSC-H、BrdU-APC 与 7-AAD。" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：设门策略。左图：未设门的细胞显示在FSC-A 与 SSC-A 散点图上。通过所示门控圈定活细胞群体。中图：来自左图门控的细胞显示在FSC-A 与 FSC-H 散点图上（FSC-W 可替代高度参数使用）。双联体和聚集体通过所示门控被识别并排除。右图：来自中图双联体排除后门控的细胞显示在7-AAD 与 APC-A 散点图上。BrdU 抗体以 APC 标记，可用于识别在脉冲标记期间掺入了 BrdU 的细胞。7-AAD 提供有关 DNA 含量的信息。上方门控定义在 BrdU 脉冲时处于 S 期且 BrdU 阳性的细胞，左下门控为处于 G0/1 期的细胞，右下门控为处于 G2/M 期的细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>细胞周期分析
	<ol>
		<li>打开第一个数据文件，在双联体排除门中圈选细胞。</li>
		<li>使用FloJo软件中的细胞周期分布分析模块（位于平台选项下），并采用Dean-Jett-Fox模型对该细胞群体进行分析。</li>
		<li>获取 G 的位置0/1 和 G2使用创建门控来分析/M峰。</li>
		<li>圈选 BrdU 阳性细胞，并对该细胞群体进行相同的细胞周期分析。</li>
		<li>提供G的位置0/1 和 G2/通过应用“创建门控”中的相同门控，并为G峰的位置设置约束条件（使用已创建的门控），来确定M峰0/1 和 G2/米峰值。这在前两个面板中有所展示。 图2. 
		注意：也可使用其他软件分析数据，相应操作步骤会有所不同。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="细胞周期各时相分析；G0/1、S、G2/M 期的流式细胞术直方图，7-AAD 染色。" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：细胞周期进程。 第一个图（所有细胞）基于双细胞排除门控选定了细胞群体。该群体以 7-AAD 为 X 轴绘制直方图。G0/1 期峰的位置由轴线下方的箭头指示。在后续各图中，如图 1所示，已对 BrdU 阳性细胞进行了门控。当在 FlowJo 细胞周期分析软件中对 BrdU 阳性门控细胞应用双细胞排除门控时，获得 G0/1 期的位置值。后续每个图均如图 1所示对 BrdU 阳性细胞群体进行门控，并依据前两个图中分析整个细胞群体时所得的 G0/1 峰位置来确定峰位。利用同一样本中 BrdU 阴性组分确定 BrdU 阳性细胞的 G0/1 群体位置，可校正不同样本间 DNA 染色强度的微小差异。各图中标注的数字表示 BrdU 脉冲标记结束后的培养时间。计算得到的细胞周期各时相以绿色阴影区域显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanfalvi%2C+G+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li>
<li>Harper, J. W., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+ten+years+after%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: ten years after.</a> Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).</li>
<li>Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+bromodeoxyuridine-substituted+cells+stained+with+33258+Hoechst%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).</li>
<li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine%3A+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218, 474-475 (1982).</li>
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<li>Gonchoroff, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase+detection+with+an+antibody+to+bromodeoxyuridine.+Role+of+DNase+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment.</a> Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).</li>
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<li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD001+%28everolimus%29+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).</li>
<li>Hendzel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106, 348-360 (1997).</li>
<li>Draetta, G., Beach, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cdc2+protein+kinase+during+mitosis+in+human+cells%3A+cell+cycle-dependent+phosphorylation+and+subunit+rearrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement.</a> Cell. 54, 17-26 (1988).</li>
<li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD001+%28everolimus%29+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. , (2012).</li>
<li>Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microassay+for+lymphotoxin+using+microculture+plates+and+the+multiple+automated+sample+harvester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester.</a> Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).</li>
<li>Beck, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+kinetics+of+perturbed+cell+populations+determined+by+the+bromodeoxyuridine-33258+technique%3A+radiotoxic+effects+of+incorporated+%5B3H%5Dthymidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine.</a> Cytometry. 2, 170-174 (1981).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+rates+of+DNA+synthesis+during+the+S+phase+of+log+phase+HeLa+S3%2C+WI-38%2C+and+2RA+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).</li>
<li>Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+growth+fraction+in+cell+suspensions+by+flow+cytometry+using+the+monoclonal+antibody+Ki-67%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67.</a> Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).</li>
<li>Danova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-related+proteins%3A+a+flow+cytofluorometric+study+in+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors.</a> Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).</li>
<li>Juan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+phosphorylation+and+expression+of+cyclins+A+and+B1+measured+in+individual+cells+during+their+progression+through+G2+and+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis.</a> Cytometry. 32, 71-77 (1998).</li>
<li>Langan, T. J., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+mammalian+cell+cultures+by+serum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).</li>
<li>Kues, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+porcine+fetal+fibroblasts%3A+effects+of+serum+deprivation+and+reversible+cell+cycle+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors.</a> Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).</li>
<li>Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+nuclear+and+cytoplasmic+cell+cycle+progression+by+drugs+employed+in+cell+synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization.</a> Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

分析细胞周期的能力对于理解癌症生物学以及影响细胞增殖和生长的药物与基因的作用机制至关重要。尽管已有多种据称可测量细胞增殖的检测方法，但大多数方法仅能提供反映细胞数量的指标。这些方法包括通过直接显微观察和计数、代谢活性或ATP浓度来测定细胞数量。这些方法的主要优势在于操作相对简便，适用于微孔板格式并可实现自动化，因此适用于大量条件或化合物的筛选。然而，这些方法的不足之处在于未考虑因细胞死亡导致的细胞丢失，可能导致对细胞增殖程度的低估。此外，这些方法检测的是细胞群体的整体情况，无法用于单个细胞的研究，也无法追踪细胞在细胞周期中的进程。
在常用的增殖检测方法中，可能最可靠且准确的是那些测量DNA合成的方法。传统的细胞增殖检测通常将细胞与3H-胸腺嘧啶共同孵育数小时至过夜，后者会被整合到新合成的DNA中13。该方法明显的问题是使用了放射性物质，另一个局限性在于结果仅反映细胞群体的平均增殖水平。BrdU可在避免辐射问题的情况下实现类似应用，尽管需要额外的实验步骤，且BrdU本身具有潜在的致突变性。然而，BrdU的优势在于可与流式细胞术兼容，从而实现...

评估细胞周期进程中细胞所表现出的特征及其变化，对于理解生物学的诸多方面（尤其是癌症生物学）至关重要。目前许多处于研发阶段的恶性肿瘤治疗药物，对细胞周期进程具有显著影响，或通过依赖细胞周期的机制诱导细胞死亡。为了研究细胞周期动态或处于细胞周期特定阶段的细胞，通常需要对细胞进行同步化处理。然而，同步化方法可能对被研究细胞产生不利影响，从而潜在地干扰实验结果。1 近年来，利用仅在细胞周期特定阶段存在的荧光标记蛋白，已可实现随时间对单个细胞的细胞周期进程进行分析2，但该方法需要对细胞进行遗传操作以表达这些标记蛋白，因此其应用仅限于易于实现此类操作的实验体系。
细胞周期包含两个活跃阶段：合成（S）期，在此期间DNA进行复制；以及有丝分裂（M）期，在此期间发生细胞分裂。这两个阶段之间由三个间隙期（G0、G1和G2）分隔。G0期又称静息期，是细胞退出细胞周期后的休止状态；G1期是细胞在DNA复制前体积增大的阶段；G2期则是DNA复制完成后、细胞分裂开始前继续生长的阶段。细胞周期的进程受到多个检查点的调控。当环境条件不利于DNA合成时，G1检查点被激活，阻止细胞进入S期。S期内部检查点或延迟机制可由DNA损伤触发，此类损伤可能导致复制叉停滞。在G2期，细胞会确认复制后的DNA保真度；若检测到损伤，则激活G2检查点，以便在细胞分裂前完成DNA修复。有丝分裂过程中的最后一个检查点确保染色单体已正确排列在赤道板上，从而使细胞分裂得以顺利完成3。这些检查点的激活常被用于实现细胞群体的同步化。多种因素均可激活细胞周期检查点，但在癌症生物学中，最常见的激活原因是DNA损伤的检测。DNA损伤反应由一类类似PI3激酶的蛋白激酶启动，主要包括毛细血管扩张性共济失调症相关激酶（ATR）和毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白（ATM），它们分别激活下游效应激酶Chk1和Chk23。多种事件可激活Chk1，包括复制叉停滞、DNA交联以及紫外线辐射造成的损伤，而Chk2则主要由DNA双链断裂激活。
研究改变条件对细胞周期长度影响的常用方法是将细胞在细胞周期的特定阶段进行同步化1。这可以通过多种方法实现。可根据细胞的大小、密度、侧向散射（颗粒度）以及细胞表面标志物表达情况进行物理分离。更常用的方法是采用化学手段进行同步化。多种试剂如胸腺嘧啶核苷、羟基脲和阿糖胞苷可用于抑制细胞周期S期的DNA合成，导致细胞在S期积聚，当去除这些试剂后，细胞可继续进行周期循环。用诺考达唑处理细胞可阻止有丝分裂纺锤体的形成，使细胞停滞在G2期或M期，并具有相应的DNA含量。从培养基中去除血清可导致细胞在G0期积聚；重新添加血清中的营养成分则可恢复细胞的正常周期进程。然而，所有这些同步化方法都会干扰细胞的正常周期进程和生长，并可能导致显著的细胞死亡。
急性淋巴细胞白血病细胞的同步化尤其困难，且这些细胞不易进行遗传操作。本文所述方法能够在无需传统同步化或基因修饰的情况下，评估细胞周期动态并研究处于细胞周期特定阶段的细胞。该方法也可能适用于其他难以实现基因修饰和传统同步化操作的细胞类型。该方法基于长期确立的溴脱氧尿苷（BrdU）掺入技术，其对细胞的短期生长和增殖影响极小。4 现有的BrdU实验方案利用BrdU在S期掺入新合成的DNA中，从而永久标记在BrdU暴露期间处于S期的细胞。通过后续的BrdU掺入染色，可在之后的时间点识别该细胞群体，使其作为同步化群体被追踪和评估，从而实现对药物对细胞周期进程影响的研究。6,7 BrdU检测前需进行抗体染色前处理，通常通过DNase或酸处理实现。利用流式细胞术检测掺入的BrdU，可同时结合其他标记物进行分析。其中最重要的是使用染料测定DNA含量，从而评估在研究开始时处于S期的细胞的细胞周期时相分布。8 此外，还可同时研究其他表面或细胞内抗原。9 这些抗原可能与细胞周期事件相关，例如Ki67，也可能与看似无关的细胞特征相关，例如凋亡标志物如裂解型caspase-3。该方法的潜在应用仅受限于研究者的想象力。

<table><tbody><tr><td>APC BrdU 流式检测试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>552598</td><td>包含 BrdU 抗体、7-AAD 和 BD Cytofix/Cytoperm&lt;br/&gt; 缓冲液（称为固定缓冲液）</td></tr><tr><td>BD Cytoperm 增强通透缓冲液 Plus</td><td>BD Biosciences</td><td>561651</td><td>称为通透缓冲液</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash 缓冲液</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>称为洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D-4513</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 12 x 75&amp;nbsp;mm FACS 管</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 染色缓冲液</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR FORTESSA 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>FORTESSA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>P2, P20, P100, P1000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 不含 L-谷氨酰胺 500 ml</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>FisherBiotec</td><td>FBS-7100113</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513-100ML</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-2&amp;prime;-脱氧尿苷</td><td>Sigma</td><td>B5002-1G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon TC 150&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 透气培养瓶</td><td>BD Biosciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>移液管 25&amp;nbsp;ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶移液器 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Interpath</td><td>24700</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶移液器 1&amp;nbsp;ml</td><td>Interpath</td><td>24800</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Spintron</td><td>GT-175R</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Binder</td><td>C 150</td><td></td></tr><tr><td>AF488 抗磷酸化组蛋白 H3（Ser10）抗体</td><td>Cell Signalling</td><td>9708S</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化 Chk2（Thr68）(C13C1) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signalling</td><td>2197S</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化 Chk1（Ser345）(133D3) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signalling</td><td>2348S</td><td></td></tr><tr><td>NALM6&amp;nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-128</td><td></td></tr></tbody></table>

利用流式细胞术对细胞周期进程进行时间追踪而无需同步化处理

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

本方案描述了一种无需对细胞进行同步化即可追踪细胞周期进程的方法。对于许多细胞体系而言，实现细胞同步化具有挑战性。常规做法是在细胞周期的特定阶段阻断其进程，随后释放被累积的细胞，从而产生一批同步推进的细胞群体。然而，某些细胞类型对这种阻断具有毒性反应，可能导致细胞周期异常甚至大量死亡。溴脱氧尿苷（BrdU）掺入法可用于追踪单个细胞所处的细胞周期阶段。在S期合成新DNA时，细胞会将这种合成的胸苷类似物BrdU整合入DNA中。通过短暂提供BrdU，可以标记出在BrdU存在期间正处于S期的一群细胞。随后可追踪这些细胞完成后续细胞周期进程并进入下一轮DNA复制，从而在无需施加潜在毒性细胞周期阻断的情况下，确定各细胞周期时相的持续时间。此外，还可检测并关联细胞周期后续各阶段中细胞内外蛋白的表达情况。这些信息可用于进一步精确判定细胞所处的周期阶段，或评估对其他细胞功能（如检查点激活或细胞死亡）的影响。

该方法可用于获取多种信息，此处概述了几个应用实例。
细胞周期持续时间的评估
为确定细胞通过细胞周期所需的时间，在溴脱氧尿苷（BrdU）脉冲标记后不同时间点收集细胞。评估的时间间隔可根据所分析的特定细胞类型进行调整。在未添加任何药物处理的条件下，对造血细胞系在24小时内每小时进行一次检测，以确定标准培养条件下细胞周期各时相的持续时间。 图2 展示了在24小时期间对NALM6细胞进行的一系列快照分析。在BrdU脉冲时处于S期的细胞（即 在 BrdU 阳性门控范围内 图1) 进入 G 期2/M，细胞周期该时相的细胞比例在BrdU脉冲后10小时达到峰值。S期中BrdU标记细胞的比例在脉冲后14小时降至最低，几乎所有细胞均已重新进入G1 17小时后。到24小时时，部分BrdU标记的细胞已重新进入S期，作为其下一个细胞周期的一部分，表明这些细胞可在24小时内完成一个细胞周期；然而，大多数细胞尚未进入第二轮复制，...

本方案描述了利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入来追踪在特定时间点处于S期的细胞的时序动态。通过添加DNA染料和抗体标记，可对S期细胞在后续时间点的命运进行详细分析。

本方案描述了一种无需对细胞进行同步化即可实现细胞周期追踪的方法。实现细胞……

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

细胞周期进程的时间跟踪使用流式细胞仪，无需同步

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利用代谢标记与流式细胞术测量细胞周期进程动力学

我们报告了两种细胞同步化方案，可为研究细胞周期特定阶段的相关事件提供背景。我们证明，该方法可用于分析在未受干扰的细胞周期中或在暴露于影响细胞周期的试剂时，特定基因的调控情况。...

通过两种互补的细胞同步化方案研究细胞周期调控的基因表达

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同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

分析同步时间序列实验的一个挑战在于，不同实验在同步恢复时长和细胞周期周期上往往存在差异。因此，来自不同实验的测量数据无法进行整体分析或直接比较。本文中，我们描述了一种用于对齐实验的方法，以实现特定相位的比较。...

利用细胞周期同步性丧失特征模型对同步化时间序列数据进行对齐以实现跨实验比较

本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S.

芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

本文介绍了一种从小鼠睾丸中高效获取高纯度且具有活性的减数分裂细胞组分的方法，该方法结合了优化的细胞解离方案与荧光激活细胞分选技术（FACS）。此方法利用了不同减数分裂阶段细胞在DNA含量和细胞核密度上的差异。...

流式细胞术纯化小鼠减数分裂细胞

学习使用溴脱氧尿苷标记结合DNA染料和抗体标记技术，对S期细胞进行时间追踪分析。该方法无需细胞同步化，可详细追踪细胞命运，适用于细胞生物学和神经科学研究。

利用流式细胞术对细胞周期进程进行时间追踪而无需同步化处理

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