设计和人工细胞外基质的构建（AECM）蛋白质大肠杆菌对皮肤组织工程

该程序的总体目标是展示构建和生产人工 ECM 蛋白或含有弹性蛋白样重复序列的 ECM 所涉及的步骤。这是通过首先构建编码 A ECM 蛋白的重组基因来实现的。接下来，将重组基因插入细菌宿主中。

此时，重组蛋白在细菌宿主中表达，然后通过细胞裂解提取蛋白质后收获。最后一步是使用逆过渡循环 （ITC） 纯化蛋白质，它利用了弹性蛋白独特的相变行为。像多肽。

离心循环在 4 摄氏度和 37 摄氏度下进行。最终，使用凝胶电泳和 western blot 技术来鉴定重组蛋白并确定其纯度。与亲和柱等现有方法相比，该技术的主要优点是我们可以相对便宜地提取大量蛋白质。

按照文本协议中的描述，从所有韧带设计开始此过程。获得低聚体后，对 DNA 低聚体进行苯胺化以获得所需的基因序列。首先将 DNA 寡核苷酸溶解在 DNA 寡核苷酸缓冲液中，最终浓度为 1 μg/μL。

将每条所有韧带 4 微升加入 32 微升 DNA 和跪下缓冲液中，得到总共 40 微升的混合物。然后用热板将装水的烧杯煮沸，并将混合物浸入水中 5 分钟。在 95 摄氏度下，取出烧杯，在聚苯乙烯泡沫塑料盒中逐渐冷却整个装置过夜，低聚物现在已经跪下并准备好消化。

添加相应的限制性内切酶，按照文本方案摘要中的说明分别消化 al 寡聚体和宿主载体，在 37 摄氏度下消化 3 到 4 小时。在琼脂糖凝胶上运行消化产物并纯化 DNA 后，通过将消化的 DNA 插入片段与 T 4 连接酶连接到质粒载体中，依次结合目标基因。使用文本实验步骤中的配方，在室温下孵育连接混合物 2 小时。

接下来，使用 Ali 的热休克转化细胞。将 50 μL 感受态细胞加入干净的预冷微量离心管中。将 5 微升连接混合物移液到细胞中，轻轻上下移液以混合。

将混合物放在冰上 20 分钟。然后将含有细胞混合物的微量离心管浸入 42 摄氏度的水浴中 2 分钟，然后放回冰中 2 分钟。将 500 μL SOC 培养基加入微量离心管中，并在 37 摄氏度下振荡孵育 1 小时。

孵育后，将 50 至 500 μL 细胞连接混合物涂布在含有氨苄青霉素的两倍 YT 螺旋板上，氨苄青霉素已预热至室温。将板在 37 摄氏度下倒置孵育过夜。第二天，使用干净的移液器吸头从螺旋板中挑选 DNA 菌落。

以 5 毫升或两次的速度培养菌落。含有氨苄青霉素的 YT 培养基在 37 摄氏度下过夜，第二天摇晃。根据制造商的方案使用质粒分离试剂盒提取每个菌落的 DNA 质粒。

如文本方案中所述，将重组质粒转化到细菌表达宿主后，用 50 μL 水洗脱 DNA。用移液器吸头接种从转化的螺旋板中挑选一个菌落。试管中装有 10 mL 无菌、极好的肉汤或含有氨苄青霉素和氯霉素抗生素的结核病培养基。

将发酵剂在 37 摄氏度下孵育过夜，并以 225 RPM 振荡。然后将 10 毫升发酵剂培养物转移到 1 升新鲜无菌 TB 培养基中。在 3 升 erlin Meyer 烧瓶中补充相同的抗生素。

将培养物在 37 摄氏度下孵育，并在 225 RRP M 下振荡 2 至 3 小时。观察培养物在 600 纳米或 OD 600 处的光密度，通过将一毫升培养物移液到空的 Q 兽医中进行读取，确认它已达到 0.6 至 0.8。接下来，用 IPTG 诱导培养至终浓度为 1 毫摩尔，并在 37 摄氏度下以 225 RPM 振荡再孵育 4 小时。

将培养物转移到 1 升离心机、瓶子中，并在 4 摄氏度下以 12， 000 Gs 离心 30 分钟，收获细胞。弃去上清液后，称取细胞沉淀，并以 0.5 克/毫升的浓度重悬于 10 缓冲液中。将重悬的细胞培养物在零下 80 摄氏度下冷冻过夜。

第二天，在室温下或冰上的水浴中解冻冷冻的细胞培养物。向 L 细胞中添加脱氧核糖核酸酶、一种核糖核酸酶 a 和苯基甲基磺、氟化物。解冻溶液时，缓慢搅拌使溶液均质化。

解冻所有重悬细胞后，非常小心地将溶液调节至 pH 9.0 以增加蛋白质在水中的溶解度。滴加 6 N 氢氧化钠，并在冰上搅拌，以达到均匀的稠度。然后，使用直径为 2 毫米的平头和 5 秒脉冲，在冰上通过超声波破碎细胞 20 分钟。

将细胞溶液在 4 摄氏度下以 12， 000 G 离心 30 分钟。将 supernat 转移到干净的空瓶中，并在 4 摄氏度下储存以备后用。同时，再次用 10 缓冲液重悬细胞沉淀，并保存 20 微升细胞裂解物。

对于 SDS 页面表征，在零下 80 摄氏度下重新冷冻重悬的细胞沉淀以完成细胞裂解。重复冻融和超声处理过程最多 3 次。整理先前的细胞裂解物，并使用 ITC 继续纯化 A ECM 蛋白，其中在高盐条件下在不同温度下进行离心循环。

将细胞裂解液分成 50 毫升离心机、瓶子，并在 4 摄氏度下以 40， 000 G 离心 2 小时。通过移液去除上清液，以从沉淀中干净分离。将上清液收集在干净的离心瓶中，并加入氯化钠至终浓度为 1 摩尔。

将溶液加热至 37 摄氏度 2 小时，同时以 225 RPM 摇动。接下来离心机。上清液在 40， 000 Gs 下在 37 摄氏度下放置 2 小时。

倾析后，上清液用金属刮刀压碎沉淀，并将沉淀块重悬于冰中。将蒸馏水冷高压灭菌，在 4 摄氏度下用磁力搅拌过夜，使用磁力搅拌棒和板，直到沉淀完全溶解。重复这些循环，直到 37 摄氏度的颗粒呈白色，此时它可以溶于水中过夜并离心。

为了获得蛋白质溶液，通过在 4 摄氏度下用蒸馏水透析蛋白质溶液来对蛋白质溶液进行脱盐，每 4 小时或 8 小时更换一次水过夜，持续两到三天，然后保存 20 微升纯化蛋白质用于 SDS 页面冻干其余的纯化蛋白质，如下所示。在诱导样品中，强蛋白条带处于预测分子量。还显示了 SDS 页面凝胶，其中包含分子量为 22 道尔顿的纯化蛋白质样品，对应于层粘连蛋白 5 A ECM。

A ECM 蛋白的估计纯度约为 90% 至 95%该值是通过比较目标蛋白与 SDS 凝胶上存在的其他蛋白质条带的条带强度的比率得出的。最后，为了确定纯化的蛋白质是否确实是 A ECM 蛋白，这里进行了蛋白质印迹。三种 A ECM 蛋白的蛋白质纯度用 SDS 页面凝胶显示，并与硝酸纤维素膜的图像进行比较以进行蛋白质印迹。

分析揭示了使用与辣根过氧化物酶偶联的抗六组氨酸标签抗体标记的靶蛋白 4 A ECM 和层压板 5 A ECM 的存在。A ECM 蛋白的最终产量在 60 毫克/升到 120 毫克/升之间。观看此视频后，您应该对如何针对您的特定应用收缩和纯化含有弹性蛋白轻结构域的蛋白质有很好的了解。