生成和多表型高内涵筛选贝氏柯克斯体转座子突变体

此过程的总体目标是大规模识别。COE 因子涉及感染周期的关键步骤，包括进入宿主细胞、产生细菌复制生态位和持久性。这是通过首先通过转座诱变生成 GF PT co 突变文库来实现的。

接下来，宿主细胞被每个分离的突变体感染。然后使用酶标仪实时跟踪每个突变体的细胞内复制，以识别对 coxiella 感染最有害的突变。最后，通过自动显微镜分析柯克斯菌感染的细胞。

最终，自动图像分析允许对获得的每种表型进行形态学表征，以将每个突变基因与柯克斯菌感染周期中的假定功能相关联。这种方法可以帮助解决宿主病原体相互作用领域的关键问题，例如大规模鉴定与整个细胞相互作用所需的给定病原体的基本基因，并劫持其分子机制使其受益。这种方法的视觉演示至关重要，因为 COE 集落的铺板和分离很难实现。

事实上，COE 形成非常小的菌落，需要从软 ACCM two aro 中小心提取。这种方法如何提供对球菌实验室感染的见解。它也可以应用于其他细胞内病原菌，如沙门氏菌、布雷尔、分枝杆菌等。

根据文本方案用转座子和转座酶包被质粒转化感受态柯克斯菌后，为了分离单个突变体，通过将 10 毫升熔化的 0.5%aros 与 10 毫升两个 X accm（两个）混合在微生物安全柜或 MSC 中来制备底部 aros，并立即加入适当的抗生素倒入培养皿中，让它在没有盖子的情况下冷却 30 分钟，然后风干 20 分钟。为了制备顶袋 aros，将 1.25 毫升 2 x accm 2 与 0.75 毫升水混合在 15 毫升聚苯乙烯管中。加入适当的抗生素并在 37 摄氏度下孵育。

然后加入 1 至 100 微升细菌培养物，涡旋 5 秒钟。接下来，加入 0.5 毫升融化的 aros 混合物，并立即倒在底部的 aros 上。让板冷却 20 分钟。

盖上盖子，在 4 摄氏度下孵育 20 分钟以帮助凝固。然后取下盖子，将板风干 20 分钟，然后转移到 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 2.5% 氧气的加湿培养箱中 6 到 7 天。一旦检测到菌落，就通过切开 1 毫升移液器吸头的末端并使用它来分离含有单个菌落的塞子来收集它们。

然后将它们转移到含有 1.5 毫升 accm two 的 24 孔板的孔中。准备标准曲线后，根据文本方案，通过每孔分配 5 微升 10% Triton X 100 来定量每种细菌悬浮液。在黑壁和黑底的 96 孔微孔板中，向每个孔中加入 50 μL 细菌悬浮液，并在平板摇床上孵育 10 分钟。

在室温下，使用一种 XTE 缓冲液将双链 DNA 定量试剂稀释 1 至 200，并向每个样品中加入 55 μL 稀释试剂。在带有板振荡器的 96 孔微孔板中充分混合，然后在室温下避光孵育 2 至 5 分钟，使用荧光酶标仪和标准荧光素波长的滤光片测量样品的荧光。为了获得细菌 DNA 浓度图，将先前制备的标准曲线中的荧光读数除以 DNA 浓度除以柯克斯菌基因组的质量，以获得细菌浓度。

根据文本方案进行单引物集落 PCR 和 DNA 测序后，以每毫升基因组当量表达结果。使用序列分析软件，使用对齐参考功能加载 Coxiella Burnett I 4 93 NM 的完整注释基因组，使用 blast N 加载和对齐序列结果并确定转座位点。在 RPMI 培养基中制备每毫升 10 至 5 个细胞的 Vero 细胞悬液后，根据文本方案，在底部平坦透明的黑色 96 孔板的每个孔中分配 100 微升悬浮液，以 400 倍 G 和室温离心板 5 分钟，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。

第二天，在含有柯克斯菌突变体的室温 96 孔板中，在深孔 96 孔板中用 300 微升不含酚红和 FBS 的 RPMI 稀释 150 微升细菌悬浮液接下来，从 Vero 细胞中取出培养基，每孔分配 100 微升稀释的柯克斯菌突变体。使用 A 1 孔作为阴性对照，将 A 2 孔和 3 孔作为阳性对照，使用气溶胶密封离心板支架，在 400 x G 和室温下离心板 10 分钟。然后，将板在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳的潮湿环境中孵育 2 小时后，用荧光酶标仪和荧光素过滤器用每孔 100 微升新鲜完全 RPMI 培养基替换含细菌培养基。

每天测量 GFP 荧光，持续 7 天在感染后第 7 天，从板中取出培养基，并用每孔 50 微升的新鲜完全培养基替换，其中含有 1 至 1000 稀释的细胞渗透性荧光染料。孵育后，将细胞孵育 30 至 60 分钟，用每孔 50 微升的 4% PFA 在 PBS 中更换培养基，在室温下孵育 30 分钟。然后去除含有 PFA 的缓冲液，然后使用 PBS 洗涤孔 3 次 去除最后一次洗涤液后，向每个孔中分配 50 微升封闭溶液，并在室温下孵育 30 分钟。

然后用每孔 40 μL、新鲜的封闭溶液和 1 比 500 稀释的抗 Lamp One 抗体替换封闭溶液。在室温下孵育 30 分钟后，去除溶液，并使用洗板机清洗孔 5 次，每孔添加 100 微升 PBS。然后每孔加入 40 μL 含有适当荧光二抗的封闭溶液，并以每毫升 5 μg 的速度钩住 3 3 2 5 8。

在室温下孵育 30 分钟。将样品洗涤 5 次，并将最终的 PBS 洗涤液留在孔中，以防止它们变干。要进行图像采集，请使用配备 20 x 物镜和 3 4、88、5、55 和 6 个 15 纳米通道的落射荧光自动显微镜。

每孔采集 21 个独立视野，以便每个样品至少 5， 000 个细胞成像。使用宿主细胞核通道作为参考应用自动对焦。最后，使用自动图像分析从采集的图像中推断出许多相关特征。

该图说明了 16 点 ICM Coxe L 中突变体的 38 个转座基因 aen 生长曲线，评估突变体的活力。这里。与上皮细胞一起孵育的 coxiella 突变体的细胞内生长曲线提供了与 coxiella 基因组插入时转座相关的表型的定量分析。在该图中，进行了自动图像采集以识别和表征宿主细胞核、细胞轮廓、溶酶体和柯克斯菌集落。

将 coxiella 菌落与细胞和溶酶体相关联，可以对含有液泡的 coxiella 进行形态学分析。将 coxiella 集落与宿主细胞轮廓相关联，可以对感染细胞进行形态学分析。最后，合并 4 个通道。

将柯克斯菌集落的平均面积与每个细胞的菌落数作图，以识别影响柯克斯菌细胞内复制和/或细菌侵入宿主细胞能力的突变。在三个簇突变中观察到突变体，这些突变影响了 coxiella 细胞内化的细胞内化和非显着表型。在这里，将柯克斯菌落的平均面积与存活感染的宿主细胞数量作图，以鉴定在柯克斯菌发育后赋予其细胞毒性的突变。

这项技术为细菌感染领域的研究人员大规模探索宿主病原体相互作用铺平了道路，并确定了宿主和细菌靶点，以开发对抗传染病的新疗法。