同时 离体 通过双视网膜功能测试 体内 视网膜电图系统

本实验的总体目标是利用商用的活体视网膜电图（ERG）系统配合离体适配器，评估从小鼠视网膜分离得到的细胞功能。首先，从小鼠双眼取出视网膜组织；第二步，将视网膜感光细胞面向上固定于样品支架中。

接下来，将标本架放置在活体ERG系统的加热板上，并连接至重力控制的灌流装置。最后一步是将标本架的电极连接至放大器，并用光刺激视网膜以获取ERG反应。最终，离体ERG可用于展示如何利用药理学手段和特殊的光刺激方案来解析视杆细胞和视锥细胞介导的信号通路。

与现有的其他方法（如活体眼电图（ERG）或单细胞记录）相比，该技术的主要优势在于能够提供更高的信噪比、更长且更稳定的记录时间，以及便于进行定量的药理学操作。此外，该方法可用于在灵长类动物和人类供体视网膜上筛选治疗视网膜疾病药物的有效性和安全性。至少提前一天，通过将黑色或灰色滤纸粘贴到穹顶顶部来改造标本架的底部。沿穹顶边缘使用双组分五分钟环氧树脂胶，必要时可在解剖显微镜下操作。待胶水干燥后，将滤纸平整地压紧至穹顶表面。

该状态可维持约一个月的记录。之后取下纸张，并用70%乙醇清洁半球罩。现在开始准备电极，首先用电极液填充电极通道。

尽量避免引入气泡。然后将 pellet 电极旋入电极通道中。用四个螺丝将样品 holder 的顶部和底部部件连接起来，并用电极溶液填充灌流管路。

接下来，测量电极对引线之间的电阻和电压。电阻应低于 100 千欧，电压应低于 10 毫伏。若通道无气泡且电极状态良好，则向玻璃瓶中加入 400 至 700 毫升灌流液用于样品灌流。

此外，倒出300毫升用于解剖，并将其储存在冰箱中。然后将灌流管路穿过热交换器模块，并将预热后的模块放置在加热板上。现在，用带有气体入口和灌流管路入口的瓶盖密封瓶子。

应将气体入口连接至气石。将预热的瓶子放置在灌注培养基需维持在37摄氏度的位置。然后用灌注培养基填充灌注管路以排出其中的空气，从而在Ocus Science系统中启动重力驱动的流动。

将瓶子放入法拉第笼内以尽量减少噪声，并使用较长的灌流输出管路连接标本 holder。将这些输出管路置于标本 holder 和灌流瓶屏蔽层的下方，并通过法拉第笼将屏蔽层连接至放大器的接地端。为防止电磁噪声耦合到ERG信号，需将温度探头固定在加热台上。

现在使用调节器，将溶液流速调整为每分钟3至5毫升。最后，如有需要，将空气和气体通入溶液中，并调节调节器，使气石持续稳定地产生气泡。首先，在一个大培养皿中倒入约200毫升冷灌注液，使标本架的整个底部部分能够完全浸没。

处死一只在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养并记录前已避暗适应6至12小时的动物。以下所有操作均需在暗红光或红外光下进行。分离每只眼睛后，将其置于眼组织保存液中。

然后将一只眼球转移至滤纸上的一小块区域。用镊子夹住眼球，并在与锯齿缘相同水平的位置切开一个切口。沿锯齿缘或更靠近赤道的位置剪开，以去除角膜和晶状体。

然后移除角膜和晶状体部分，并将眼杯放回冷的培养基中。对另一只眼重复相同的步骤。现在取一个眼杯，从顶部向视神经方向做一个小切口。

将剪刀置于视网膜与巩膜之间，以尽可能保持视网膜完整。接着，用两把镊子夹住切口两侧的巩膜，将组织拉开以分离视网膜。为分离视网膜，剪断视神经，并尽量减少接触其远端表面，将视网膜取出。

现在，将分离的视网膜安装到样品支架的穹顶上。首先，将样品支架的底部浸入装有已解剖视网膜的培养皿中。下一张幻灯片。

将视网膜感光层或凸面朝上置于穹顶状结构上。然后轻轻抬起标本架，使视网膜贴附在滤纸上。随后对另一侧视网膜重复此操作。

现在小心干燥固定板，以防止串扰噪声和信号分流。干燥固定板后，拧紧上部组件，并用注射器通过针头将灌流液注入灌流通道。将标本固定器放置在换热块旁边。

然后连接灌流的输入和输出管路。通过将电极连接到视网膜电图（ERG）放大器，并将刺激器控制单元连接到标本夹持器，完成装置的组装。使用适配器。在采集数据之前，为了获得强而稳定的可重复反应，必须仔细分离并妥善安装视网膜组织，同时保持视网膜上方灌流液的稳定且无气泡状态。

等待10至20分钟，使视网膜温度和功能稳定。使用不同的标准灌流溶液，记录了暗适应的野生型C57黑六（C57 black six）视网膜的闪光反应。在Ames培养基和Locks培养基中，反应波形和动力学特征相似，视杆光感受器的敏感性也相似。

另一方面，在不含碳酸氢盐或碳合气体反应的堆式林格溶液中，波幅显著减小。在堆式林格液中，B波的稳定性也常常受到影响。加入40 µM的APB可有效消除正向B波。

这揭示出一个大而缓慢的负向波，该波被认为与Müller细胞的活动有关，加入100微摩尔的钡后，该成分被消除，从而揭示了离体ERG信号中光感受器的反应。该方法可与其他工具（如药理学和遗传学方法）结合使用，以研究哺乳动物（包括人类）视网膜信号转导的分子机制以及致盲性疾病的发病机制。