Name: 铱（III）荧光探针检测疟疾蛋白质生物标志物组氨酸丰富的蛋白质-Ⅱ (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 了解使用铱（III）荧光探针检测疟疾蛋白质生物标志物组氨酸丰富蛋白质-Ⅱ的方法。该技术具有快速结合动力学、抗光漂白特性，可用于溶液和固相检测，为疟疾诊断提供可靠替代方案。

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本研究工作得到了比尔及梅琳达·盖茨基金会全球健康大挑战项目“开发可在护理现场评估多种疾病和病原体的技术”的资助。K.M.D. 获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（2012095464）的支持。

1. 铱(III)配合物的合成
<ol>
	<li>称取 53.6 mg（50 µmol）[Ir(ppy)2-Cl]2 ，溶于 5 ml 二氯甲烷中。将该溶液加入装有搅拌子的 50 ml 锥形瓶中。</li>
	<li>称取 26.2 mg（100 µmol）AgOTf，溶于 5 ml 甲醇中。</li>
	<li>将溶解的 AgOTf 加入 [Ir(ppy)2-Cl]2 溶液中，搅拌 1 小时。 
	注意：应形成乳白色悬浊液。</li>
	<li>1 小时后，将悬浊液通过硅胶过滤至 25 × 95 mm 的小玻璃瓶中，并使用旋转蒸发仪蒸除剩余溶剂（5–10 分钟）。</li>
	<li>当大部分溶剂被去除后，检查瓶中是否残留黄色油状物。向该残留物中加入 1 ml 甲醇以重新溶解产物，随后冷冻干燥 1–2 天，得到黄色固体产物。</li>
	<li>通过 1H NMR（CDCl3）、ESI 和 UV-Vis 对 Ir(ppy)2(H2O)2+ 产物（Ir1）进行表征，方法如前所述23。</li>
</ol>
2. Ir1 与各种氨基酸的相互作用
<ol>
	<li>用甲醇配制 2 mM 的 Ir1 溶液（分子量 537.10 g/mol）。涡旋振荡以确保固体完全溶解。</li>
	<li>用 HEPES 缓冲盐水（HBS，100 mM HEPES，137 mM NaCl，pH 7.4）配制以下氨基酸和生物分子的 100 µM 溶液：Ala、Asp、Cys、His、Ile、Lys、Ser、Try、Val。</li>
	<li>将每种氨基酸各 100 µl 加入黑色 96 孔板中。向板中加入 100 µl HBS 作为空白对照。</li>
	<li>向每个样品中加入 2.5 µl 的 2 mM Ir1 溶液，并将板置于板式振荡器上振荡 10 分钟。</li>
	<li>10 分钟后，使用 96 孔板读数仪采集样品的发射光谱（激发波长 365 nm，发射波长范围 400–700 nm）。
	<ol>
		<li>将板放入仪器中，打开板读数仪软件以设置新实验。</li>
		<li>将新实验设置为荧光扫描模式，激发波长为 365 nm，狭缝宽度为 9 nm，光学检测位置设为顶部。</li>
		<li>以 5 nm 步长采集 300–700 nm 范围内的发射光谱。</li>
		<li>导出数据用于数据分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品转移至透明 96 孔板中，并使用紫外透射仪成像其发射光。</li>
</ol>
3. 使用 BNT-II 对 Ir1 进行滴定
<ol>
	<li>用 HBS 配制 1 mM 的 BNT-II 储存液（分子量 8233.6 g/mol），同时用甲醇配制 2 mM 的 Ir1 溶液。</li>
	<li>从储存液中配制 1 ml 浓度为 100 µM 的 BNT-II HBS 溶液。涡旋混匀微量离心管，确保样品充分混合。</li>
	<li>用 HBS 将 100 µM 的 BNT-II 溶液逐级对半稀释，最终获得浓度为 1.56 µM 的 BNT-II 溶液。</li>
	<li>将各稀释液分别取 100 µl，每份设三个重复，加入 96 孔板的孔中，以 HBS 作为空白对照。向每个样品中加入 2.5 µl 的 2 mM Ir1 溶液。</li>
	<li>将 96 孔板置于板式振荡器上振荡 10 分钟。</li>
	<li>振荡结束后，使用 96 孔板荧光读板仪在激发波长 365 nm、发射波长 510 nm 条件下测定荧光强度。
	<ol>
		<li>将 96 孔板放入仪器中，打开读板软件，设置新实验程序。</li>
		<li>将新实验设置为荧光终点检测模式，激发波长设为 365 nm，发射波长设为 510 nm；两个波长的狭缝宽度均设为 9 nm，光学检测位置设为顶部。</li>
		<li>读取数据并导出用于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品转移至透明 96 孔板中，使用紫外透射仪对滴定过程进行成像观察。</li>
</ol>
4. 使用生物膜干涉技术对 Ir1/BNT-II 系统进行实时动力学分析
<ol>
	<li>在黑色96孔板第一列的8个孔中各加入200 µl动力学缓冲液（KB；含0.02% Tween-20的1×磷酸盐缓冲液），并将该板插入塑料传感器支架中。小心地将8个Ni(II)NTA生物传感器转移至塑料支架的第一列，使传感器尖端浸入缓冲液孔中。将塑料支架放置于干涉仪仪器的左侧。</li>
	<li>用KB配制2 ml浓度为0.5 µM的BNT-II溶液。</li>
	<li>用KB配制500 µl浓度为10 µM的Ir1溶液，并用KB进行连续半量稀释，直至浓度降至0.156 µM。</li>
	<li>取一个新的黑色96孔板，在A列和C列的全部8个孔中各加入200 µl KB。</li>
	<li>在同一块板中，将200 µl的0.5 µM BNT-II溶液加入B列各孔中。</li>
	<li>将Ir1系列稀释液各取200 µl加入D列，从D1孔开始以KB作为空白对照。加样时应使D列各孔中Ir1的浓度自上而下递增。</li>
	<li>将该板放置于仪器中，位于已预湿传感器所在板的右侧。</li>
	<li>在生物膜干涉仪软件中，通过定义板型、检测方案和传感器类型来设置一个基本的动力学实验。
	<ol>
		<li>定义板型时，在屏幕上选择某一列，右键单击并为各孔选择相应的定义：A列和C列选择“缓冲液”，B列选择“加载”，D列选择“样品”。</li>
		<li>在下一个选项卡中定义检测方案，添加以下步骤（点击“添加”）：平衡（自定义）60秒；加载120秒；基线60秒；结合120秒；解离300秒。选中平衡步骤后，双击A列。依次对加载（B列）、基线（C列）、结合（D列）和解离（C列）执行相同操作。选择Ni(II)NTA传感器。</li>
		<li>切换到下一个选项卡，确认传感器位于塑料传感器支架的A列。</li>
		<li>确认实验流程设置无误，输入文件名，勾选“延迟实验”选项，然后点击“开始”。 
		注意：由于仪器具有自动化功能，一旦动力学实验流程设定完成，各步骤将按程序自动执行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动力学运行完成后，使用提供的数据处理软件进行数据分析。
	<ol>
		<li>在左侧面板底部双击所需文件名的文件夹，然后在面板顶部双击“Kinetics”下的对应文件夹。切换到“Processing”选项卡。</li>
		<li>在左侧勾选“Subtraction”框以打开传感器选择界面。右键单击A4孔，将其孔类型更改为参考孔（Reference Well）。</li>
		<li>勾选“Align Y axis”旁边的复选框，并确保所选步骤为基线（Baseline）。设定时间范围为基线最后5秒（约55–60秒）。</li>
		<li>勾选“Inter-step Correction”框并选择“Align to Dissociation”。确保勾选“Savitzky-Golay Filtering”框，然后点击“Process Data!”。</li>
		<li>切换到“Analysis”选项卡。确保分析步骤选择为“Association and Dissociation”，模型选择为1:1。选择“Local, Full fit”并点击“Fit Curves!”。</li>
		<li>在表格中高亮所有曲线，右键单击并将所有曲线设为同一颜色。接着选择“Global (Full) fit”，按颜色分组，Rmax按传感器不连接（Unlinked by Sensor）。点击“Fit Curves!”以获得全局动力学数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用 Ir1 在磁珠上检测 BNT-II 和 rcHRP-II
<ol>
	<li>分别用含吐温的 HBS（HBST；含 0.025% Tween 20 的 HBS）配制 1 µM 的 BNT-II 和 rcHRP-II 溶液各 1 ml。</li>
	<li>用 HBST 将每种蛋白质连续对倍稀释，最终浓度为 15.6 nM。</li>
	<li>使用多通道移液器将每种稀释液以每孔 100 µl 的体积，每种浓度设三个复孔，加入白色 96 孔板中，每列中按浓度从低到高依次排列。</li>
	<li>向每个稀释孔中加入 10 µl 的 50 µm Ni(II)NTA 磁性琼脂糖微珠。
	<ol>
		<li>每次移液后，涡旋振荡装有磁性微珠的微量离心管，以确保微珠保持悬浮状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 96 孔板置于板式振荡器上，振荡孵育 15 分钟，使样品与微珠充分结合。</li>
	<li>孵育结束后，将 96 孔板置于 96 孔磁力架上，静置 30 秒，使磁性微珠从溶液中析出。</li>
	<li>使用多通道移液器吸除原始样品，作为废液丢弃。将 96 孔板从磁力架上取下。</li>
	<li>使用多通道移液器向每孔加入 200 µl HBST，反复吹打数次以洗涤磁性微珠。</li>
	<li>将 96 孔板重新放回磁力架，静置 30 秒，使磁性微珠再次从溶液中析出。</li>
	<li>使用多通道移液器吸除 200 µl 洗涤液，作为废液丢弃。将 96 孔板从磁力架上取下。</li>
	<li>重复步骤 5.8 至 5.10 两次，共完成对微珠的三次洗涤。</li>
	<li>向含有磁性微珠的每孔中加入 100 µl HBST，随后加入 2.5 µl 的 2 mM Ir1。</li>
	<li>将微珠与 Ir1 在板式振荡器上孵育 1 小时。</li>
	<li>孵育 1 小时后，使用 96 孔板读数仪在 510 nm 发射波长（激发波长 365 nm）下读取荧光强度。
	<ol>
		<li>将 96 孔板放入仪器中，打开板读数仪软件，设置新实验。</li>
		<li>将新实验设置为荧光终点读数模式，激发波长为 365 nm，发射波长为 510 nm。两个波长的狭缝宽度均设为 9 nm，光学检测位置设为顶部。</li>
		<li>读取 96 孔板数据，并导出用于分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品转移至透明 96 孔板，使用紫外透射仪成像滴定结果。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突披露。

随着基于微粒的诊断工具在现代诊断技术中占据前沿地位，在微粒表面直接检测目标生物分子成为一项主要优势。传统的分子检测方法（如ELISA和PCR）具有可实现极低检测限的优点25。然而，这些检测方法需要大量试剂并依赖耗时的实验流程。本实验方法旨在模拟ELISA类型的夹心结合反应，同时避免其对时间和试剂的高需求（图5）。此外，每份样本所用Ir1探针的成本估计约为1美分，而典型ELISA中每份样本的抗体成本为0.20至0.30美元。
由于上述方法依赖于环金属化铱探针来检测疟疾生物标志物，因此该探针不会受到其他检测方法中常见失效模式的影响即荧光团淬灭及抗体/酶降解）。组氨酸在金属结合特性方面具有独特性。本研究利用这一特性，通过含金属的复合物替代典型ELISA夹心法中的抗体。Ni(II)NTA在颗粒表面捕获rcHRP-II，而Ir1则用于指示蛋白质的存在。该检测中最关键的步骤是使磁性颗粒与样本及探针充分混合。在96孔板ELISA中，生物分子和试剂与孔底的二维表面达到平衡。由于磁性颗粒具有致密的氧化铁核心，容易从溶液中沉降，从而减少可利用的结合位点。因此，在检测过程中必须持续混合颗粒，以确保结合最大化。
在设计用于疾病诊断的试剂时，必须考虑患者样本的形式以及生物标志物的生理浓度。对于疟疾而言，患者血液中pfHRP-II的浓度可从低皮摩尔（picomolar）到高纳摩尔（nanomolar）不等。尽管该检测方法对较高感染水平具有临床相关性，但仍需提高检测限，以便能够检测到循环中pfHRP-II浓度处于低皮摩尔水平的无症状患者。在上述方法中，Ir1在组氨酸存在时产生“开启”信号。虽然疟疾生物标志物富含组氨酸，但其他血清蛋白（如人血清白蛋白和组氨酸富集糖蛋白）也会与探针产生信号响应，从而导致假阳性诊断结果。因此，将目标蛋白捕获至颗粒表面是一个有益的步骤，可实现从患者样本中快速提取目标蛋白。此外，设计一种双功能探针，将富含组氨酸的肽段与一种稳定的分子识别元件（即适配体）偶联，可为该检测增加另一层特异性。在与适配体偶联前，可先将肽段负载铱。在此类设计中，仍可利用稳定的Ir1探针，同时通过适配体实现对目标物的特异性识别。这将使探针能够应用于复杂基质（即血浆或全血）中天然HRP-II的检测，并减少非特异性结合效应。为进一步增强快速诊断测试的信号，可将该检测整合到电化学发光（ECL）系统中，使pfHRP-II在快速诊断试纸条（RDTs）上以电化学信号形式被检测26。这种新一代铱探针将显著提升我们在微珠上进行的ELISA检测在疾病生物标志物检测中的性能。

比色法和荧光标记是检测与追踪生物化学分子及过程的重要方法1,2。最常见的荧光标记物是小分子量有机染料3,4，但这些分子并不总是具有理想的光学特性。荧光染料容易发生光漂白，通常斯托克斯位移较小，且可能具有重叠的激发和发射光谱。比色标记通常通过使用酶标记物实现，其信号可被放大，适用于免疫测定中的定量分析5,6。这些酶同样存在缺点，包括对光敏感、反应条件要求高以及底物保质期短。这些特性往往要求免疫测定和蛋白质标记方法必须在严格控制的条件下进行，并使用昂贵的试剂。
已探索发光的过渡金属配合物作为生物化学检测的一种替代性标记方法。特别是，环金属化 Ir(III) 配合物已被研究用于有机发光二极管（OLEDs）7-9、氧气传感10、催化反应11以及蛋白质/细胞染色12-14等领域。由于其高光稳定性和量子效率，这类探针成为生物分子检测的优良候选者15,16。先前研究发现，通式为 [Ir(C^N)2(solv)2]+ 的环金属化 Ir(III) 配合物可不可逆地结合组氨酸，并产生蓝绿色信号响应12,17。这些配合物在溶剂配位状态下不发光，但当组氨酸取代溶剂分子并与金属中心结合后，在长波紫外光照射下会释放强烈的磷光信号。该信号仅在配体取代反应发生后出现，是三重态电子通过金属-配体电荷转移（3MLCT）和配体中心转移（3LC）途径弛豫至基态的结果8,15。这些配合物有望作为富含组氨酸蛋白质的检测探针。
组氨酸富集蛋白及其调控水平在多种疾病中具有重要意义，包括肝硬化、癌症和血栓性疾病。18其中，恶性疟原虫组氨酸富集蛋白II（pfHRP-II）是疟原虫感染的一种经过充分验证的生物标志物。该蛋白分子量为67 kDa，含有34%的组氨酸，主要分布在特征性的AHHAHHAAD重复基序中19。这些组氨酸重复序列能够结合宿主血液中的游离金属离子19和血红素复合物20。pfHRP-II通常在资源有限的条件下通过免疫层析快速诊断检测（RDTs）进行检测，但由于样本条件、生物标志物浓度低、生产标准差以及抗体降解等原因，这些检测方法往往不够准确21。
基于金属的磷光探针，例如上述所描述的环金属化 Ir(III) 配合物，因其对组氨酸具有选择性结合能力以及稳定且高效的发光特性，成为检测 pfHRP-II 的理想选择。本文研究了使用 [Ir(ppy)2(H2O)2]+（Ir1）来检测 BNT-II（一种模拟 pfHRP-II 的支链肽）的方法22。该相互作用的动力学过程通过生物膜干涉技术进行实时监测。该检测方法还被改进为一种基于微珠的 ELISA 类型检测模式，并实现了纳摩尔级别的检测限。与传统 ELISA 相比，该方法具有优势，可在不到 2 小时内完成，且无需使用抗体类试剂；而典型的 ELISA 通常需要 4 至 5 小时，并依赖生物来源试剂。

<table><tbody><tr><td>二氯四(2-(2-吡啶基)苯基)二铱(III)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>658383</td><td></td></tr><tr><td>三氟甲磺酸银</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176435</td><td></td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>L-氨基酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>因产品而异</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>BNT-II 肽</td><td>本实验室合成</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>重组 HRPII</td><td>Immunology Consultants Laboratory 公司</td><td>AGPF-55</td><td></td></tr><tr><td>Corstar 黑色聚丙烯 96 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Corstar 白色聚丙烯 96 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Grenier 黑色聚丙烯 96 孔板</td><td>VWR</td><td>89089-582</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA 磁性琼脂糖微粒</td><td>Qiagen</td><td>36111</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA 生物层干涉传感器</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td></td></tr><tr><td>Octet Red96 生物层干涉仪</td><td>ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H4 微孔板读板仪</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Biotech 转印照明仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBDLT-88</td><td></td></tr></tbody></table>

用于检测疟疾蛋白生物标志物富含组氨酸蛋白-ii的铱(iii)发光探针

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

本研究阐述了一种非发射性环金属化 Ir(III) 配合物 Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1) 的合成方法。当该配合物与固定在磁性微粒表面的含组氨酸蛋白配位时，可产生快速且长寿命的磷光信号。Ir1 的合成产率高，反应在 O/N&#160;条件下完成，涉及将母体环金属化 Ir(III) 氯桥联二聚体裂解为两当量的溶剂化配合物。 为验证其特异性，将多种氨基酸加入合成的探针中检测其配位活性，结果仅组氨酸引发信号响应。利用疟疾生物标志物组氨酸富集蛋白 II（pfHRP-II）的支链肽模拟物 BNT-II，验证了该铱探针在 HRP-II 检测中的应用价值。与 L-组氨酸/Ir1 滴定相比，BNT-II/Ir1 滴定中观察到淬灭效应，但该效应归因于空间位阻和三重态淬灭。采用生物膜层干涉技术测定了 Ir1 与 BNT-II 相互作用的实时动力学参数。系统优化后，该探针对溶液中重组组氨酸富集蛋白 II（rcHRP-II）的检测限为 12.8 nM。当该蛋白固定于 50 µm 磁性琼脂糖微粒表面时，检测限为 14.5 nM。该无机探针具有强健的信号响应特性，且可在溶液中或固定于表面灵活使用，因此在诊断检测和成像等多种应用中具有广阔前景。

如图1所示，Ir1溶剂配合物的合成涉及通过将氯离子以难溶的AgCl形式沉淀，使母体二聚体中的氯桥断裂，同时水分子与金属中心配位。通过1H NMR和ESI证实了Ir1的形成。此外，紫外-可见光谱中归属于金属-配体电荷转移和π-π*跃迁的特征吸收带进一步验证了Ir1的生成。 该溶剂化配合物在365 nm激发下不表现出发射特性。
 
<img alt="用于光子分析的荧光发射光谱图，显示相对荧光单位（RFU）与波长的关系。" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：Ir1 的合成与表征。 四氯双(2-(2-吡啶基)苯基)二铱(III)的氯桥裂解反应生成水合配合物 Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1)。将 L-组氨酸（L-His）加入水相缓冲液中的水合配合物后，发光信号被激活。
在该配合物合成并表征后，参照先前使用类似铱类似物的方法分析了其对氨基酸的选择性17。图2A显示，仅组氨酸在365 nm激发下于510 nm处产生信号响应。
 
<img alt="荧光强度图；相对荧光单位（RFU）与富含组氨酸的肽浓度的关系；数据分析结果。" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：Ir1 对氨基酸的选择性及与富含组氨酸肽的滴定反应。（A）在 HBS 缓冲液中，200 µM 的各种氨基酸（Cys、Ser、Asp、Glu、Phe、Lys、Arg、Tyr、Trp、His）与 50 µM Ir1 的相互作用。在黑色 96 孔板中，以 365 nm 为激发波长，扫描 400–700 nm 范围内的发射光谱。除组氨酸外（黑色虚线），其余所有氨基酸的相对荧光单位（RFU）信号均可忽略不计。（B）在 HBS 缓冲液中，使用 Ir1 对 BNT-II（▪）和 rcHRP-II（♦）进行纳摩尔浓度滴定。将富含组氨酸的肽与探针在溶液中孵育 15 分钟后，以 365 nm 光激发，检测 510 nm 处的发射信号。检测限定义为当 y = 3σblank 时对应的 x 值。
铱探针的磷光“开启”开关之所以发生，是因为当组氨酸与金属中心配位时，Ir(III) 生物偶联物的单重激发态（1MLCT/1LC）发生了系间窜越，生成三重激发态（3MLCT）。该探针被应用于 BNT-II，即疟疾生物标志物恶性疟原虫组氨酸富集蛋白 II（pfHRP-II）的肽模拟物。在用 Ir1 滴定 BNT-II 的实验中，观察到浓度依赖性的信号响应（图 2B）。在溶液中，重组 HRP-II（rcHRP-II）也表现出类似的响应。BNT-II 和 rcHRP-II 在溶液中的检测限分别为 54.8 nM 和 12.8 nM。利用生物膜干涉技术，测得 Ir1 与固定在 Ni(II)NTA 表面的 BNT-II 结合的解离常数 KD 为 2.05 µM（图 3）。
<img alt="显示随时间变化的结合动力学的表面等离子共振图，标注了A-E各阶段。" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
 
图3：Ir1与BNT-II的实时动力学分析。 采用生物层干涉技术，对不同浓度的Ir1与固定在Ni(II)NTA玻璃传感器表面的BNT-II之间的结合动力学进行分析。首先将传感器在KB缓冲液中平衡（阶段A），随后用0.5 µM BNT-II对传感器进行负载（阶段B）。肽段负载完成后，在测定Ir1与BNT-II结合（阶段D）之前建立基线（阶段C）。经过一段时间的结合后，将传感器重新放入KB缓冲液中以测定解离过程（阶段E）。整个动力学分析过程耗时不到30分钟。
从基于溶液的检测方法转向磁性颗粒平台时，必须考虑系统中颗粒带来的额外复杂性。根据先前的研究已知，这些颗粒能够高效结合疟疾生物标志物pfHRP-II24。上述溶液检测使用黑色荧光板效果良好，但如图4A所示，白色板更适用于基于颗粒的检测平台。在白色板中，光被反射回样品中，从而提高了结合在颗粒表面的Ir1对光的吸收效率。在基于颗粒的检测中，rcHRP-II的检测限确定为14.5 nM（图4B）。通过非配对t检验分析，溶液中和颗粒上的rcHRP-II检测限在统计学上无显著差异（p = 0.731）。
<img alt="RFU 与 rcHRP-II 浓度关系图，荧光检测，数据分析，线性趋势，误差棒。" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
<img alt="RFU 与 rcHRP-II 浓度关系图，荧光检测，数据分析，线性趋势，误差棒。" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5">
 
图4：BNT-II 和 HRP-II 的磁珠上检测。（A）在黑色96孔板（实线）与白色96孔板（虚线）中，50 µm Ni(II)NTA磁性琼脂糖微球表面结合的Ir1检测信号的差异。激发光波长为365 nm，发射光检测波长为510 nm。（B）在磁性微球上固定化的rcHRP-II使用Ir1进行滴定检测。检测限定义为当y = 3σblank时x的取值。
<img alt="RFU 与 rcHRP-II 浓度关系图，荧光检测，数据分析，线性趋势，误差棒。" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5">
图5：使用Ir1在磁珠上检测rcHRP-II的示意图。 HRP-II与Ni(II)NTA磁珠表面结合并用Ir1标记的总体方案。将磁珠与富含组氨酸的肽段在室温下孵育15分钟。孵育结束后，使用磁铁通过HBST缓冲液洗涤磁珠，以将磁珠从溶液中分离出来。最后，将结合了肽段的磁珠与Ir1孵育1小时，随后在365 nm光激发后读取510 nm处的发射光信号。

开发新的疟疾诊断工具迫切需要高灵敏度的检测试剂。本研究设计了一种铱(III)探针，在存在组氨酸富集的疟原虫蛋白生物标志物时，可发出持久的发光信号。该蛋白无论处于溶液中还是固定在磁性颗粒上，均可被检测，从而为实际应用提供了灵活性。

用于检测疟疾蛋白生物标志物富含组氨酸蛋白-II的铱(III)发光探针

本研究概述了一种非发射性环金属化 Ir(III) 配合物 Ir(ppy)2(H2O)2+（Ir1）的合成方法，该配合物可引发快速且持久的……

本实验的总体目标是利用一种磷光铱探针检测样本中是否存在富含组氨酸的疟疾蛋白生物标志物。该目标首先通过合成环金属化的铱配合物来实现。在母体双核配合物发生快速的氯桥断裂后，可分离并纯化环金属化的铱配合物，并将其用于检测分析。第二步是验证探针与各种氨基酸的相互作用，以确保其特异性。单独针对组胺时，仅在存在组胺的情况下磷光信号才会开启，并通过发光光谱法观察到。接下来，作为概念验证，将铱探针与模拟疟疾生物标志物——富含组氨酸蛋白2的肽段进行滴定，以确定其在溶液中的检测限。此外，利用生物层干涉技术阐明探针与多肽相互作用的动力学。最后一步是将重组的富含组氨酸蛋白固定在镍-NTA磁性颗粒表面，并利用探针评估该蛋白的检测限。最终，通过发光光谱学展示如何利用一类新型磷光铱探针在固体支持物表面检测蛋白质。与现有的荧光蛋白标记和免疫测定等方法相比，该技术的主要优势在于探针具有较强的稳定性，结合动力学快速，且不易发生光漂白。此外，该技术无需像免疫测定那样耗费较长时间。该技术的应用前景可延伸至疟疾感染的诊断，原因在于疟原虫SRO感染的一种蛋白质生物标志物——富含组氨酸蛋白2（Histidine rich protein two）具有较高的组氨酸含量。我们最初产生这一方法的构想，是由于注意到已有研究发表，使用环甲基化的铱探针对活细胞进行染色。本文中，他们指出该探针进入活细胞后，通过结合富含组蛋白的蛋白质使细胞核发出荧光。鉴于该恶性生物标志物——富含组蛋白2的特性，我们决定利用该探针来检测目标蛋白。由于该检测方法较为复杂，且检测颗粒上的靶蛋白需要经过多次洗涤和转移步骤，因此本方法的可视化演示至关重要。首先，称取53.6毫克母体铱二聚体，溶于5毫升二氯甲烷中。将该溶液加入装有星形搅拌子的50毫升Lummi烧瓶中。然后称取26.2毫克银FL，溶于5毫升甲醇中。将溶解后的银FL加入母体铱二聚体溶液中，搅拌一小时。一小时后应得到乳白色悬浮液，将该悬浮液通过硅胶过滤至滤瓶中。将滤液转移至一个25 × 95毫米的DRAM小瓶中，用旋转蒸发仪蒸发除去残留溶剂，时间为5到10分钟。当大部分溶剂被除去后，检查小瓶中是否残留有黄色油状物。向该残留物中加入1毫升甲醇以溶解产物。静置1至2天，得到黄色固体，并按照文本方案中所述方法对产物进行表征，以研究铱探针与各种氨基酸之间的相互作用。用移液器将每种氨基酸溶液各100微升加入黑色96孔板中。向孔板中加入 100 µL 的 HBS 缓冲盐水作为空白对照。然后向每个样品中加入 2.5 µL 已配制的 2 毫摩尔的铱探针溶液，并在板式振荡器上振荡 10 分钟。10 分钟后，使用 96 孔板读板仪采集样品的发射光谱。为此，将酶标板放入仪器中，并打开酶标仪软件以建立新实验。接着，将样品转移至透明的96孔板中，并使用紫外透射仪成像其发射光，以对疟疾生物标志物——富含组胺蛋白2 BNT2的支链肽模拟物与铱探针进行滴定。首先，用HBS配制1 mM的BNT2储备溶液。然后按照文本方案中的描述对BN T二溶液进行连续稀释。将每种稀释液各100微升以三复孔加入96孔板的各孔中，以HBS作为空白对照；对每个样品加入2.5微升的2毫摩尔铱探针。在板式振荡器上振荡10分钟后，使用96孔板读板仪在510纳米处检测发射荧光强度。最后，将样品转移至透明的96孔板中，并使用紫外透射仪对滴定过程成像，以利用生物膜干涉技术进行实时动力学分析。首先，在黑色96孔板第一列的八个孔中各加入200微升动力学缓冲液。将该板插入塑料传感器支架后，小心地将八个镍生物传感器转移至塑料支架的第一列中，使传感器尖端浸入缓冲液孔中并保持悬垂状态。然后将干涉测量仪左侧的塑料支架连接至一个新的黑色96孔板，用移液器向同一块板的第1列和第3列的全部八个孔中各加入200微升KB，再向第2列各孔中各加入200微升0.5微摩尔的BNT2溶液。接着，从A4孔中的KB作为空白开始，向第4列各孔中依次加入200微升每种稀释浓度的铱探针溶液。加样时应使该列各孔中铱探针的浓度自上而下逐孔递增。将此板放置在生物层干涉仪软件中，位于含有预润湿传感器板的右侧位置。通过定义板式检测和传感器探针来设置基本动力学实验，以定义板型；在屏幕上选择某一列，右键单击并选择相应的定义。对于孔的选择，选择缓冲液。对于第一列和第三列，加载第二列和样品。对于第四列，在下一个选项卡中定义检测方法，首先点击“添加平衡”，加载时间为60秒，平衡时间为120秒。结合120秒，解离300秒。选择平衡步骤，双击第一列，然后依次对第二列加载、第三列基线、第四列结合以及第三列解离进行相同操作。最后，选择镍 NTA 传感器。确认实验设计正确无误。输入文件名。确保选中延迟实验选项，然后点击开始。动力学反应运行完成后，使用提供的分析软件对BNT二和重组HRP二与铱探针进行磁珠检测的数据处理。按照文本方案中的描述，制备BNT二和重组HRP二的系列稀释液。然后将每种稀释液按浓度从低到高的顺序，每列依次加入白色96孔板中，每种稀释液重复3次，每次加入100微升；再向每种稀释液中加入10微升50微米镍-NTA磁性微珠。请注意，在移液过程中磁性微珠应保持悬浮状态。若微珠开始沉降，可通过移液或涡旋混合重新悬浮。将96孔板置于板式振荡器上，振荡孵育15分钟，使样品与微珠充分结合。孵育结束后，将96孔板置于96孔磁力架上，静置30秒，使磁性微珠从溶液中分离出来。使用多通道移液器，在将板从磁铁上取下后，从每孔中吸出200微升含吐温的HBS或HBST缓冲液中的原始样品，并作为废液丢弃。使用多通道移液器，将缓冲液上下吹打数次，以洗涤磁性颗粒。将板放回磁铁上，静置30秒，使颗粒从溶液中分离。使用多通道移液器吸取200微升缓冲液并弃入废液。将反应板从磁铁上取下，重复洗涤步骤两次，共完成对磁性颗粒的三次洗涤。然后向每孔含有磁性颗粒的孔中加入100微升HBST缓冲液，随后加入2.5微升2毫摩尔的铱探针溶液。将颗粒与铱探针在平板振荡器上孵育一小时。一小时后，使用96孔板读数仪在510纳米处检测发射强度。在合成并表征环甲基化铱探针后，测试了多种氨基酸与该配合物的反应性。只有组氨酸在探针滴定过程中引发相对荧光单位的信号响应。当溶液中含有两种组胺肽时，观察到浓度依赖性的响应。该反应在宽谱紫外光下可观察到。通过生物膜层干涉技术对不同浓度的铱探针与固定在镍NT.A玻璃传感器表面的BNT结合的反应进行动力学分析，结果显示，该铱探针与含组氨酸的肽段具有微摩尔级亲和力。当蛋白质固定在磁性颗粒表面时，使用该探针检测组氨酸富集蛋白的检测限与在溶液中相似。一旦掌握，这种蛋白标记方法可在颗粒表面直接观察到。若操作得当，该技术可在两小时内完成。在进行该实验操作时，需特别注意在洗涤和转移磁性蛋白结合颗粒的步骤中应谨慎操作。充分洗去未结合的蛋白对于准确检测固定化的P-F-H-R-P二聚体至关重要。设计一种能够通过抗体-抗原相互作用特异性识别结合蛋白的分子识别元件。在方法建立完成后，继续使用稳定的铱探针将有助于更灵敏、更特异地检测颗粒表面结合的蛋白质。该技术有望为诊断领域的研究人员探索使用此类稳定试剂铺平道路，这些试剂不仅可用于疟疾的检测，还可用于其他传染病的检测。

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