Name: 为远程沉默的神经活动在鼠害的方法在学习独立的阶段 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学习利用药理学遗传学方法在特定脑区远程沉默神经元活动，以研究大鼠学习与记忆任务中的神经机制。该技术结合感觉预条件行为范式，可精确操控神经回路并验证受体定位。

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感谢 Robinson et al.12 的作者们为本实验方案所部分依据的手稿作出的贡献。

动物实验已获得欧柏林学院机构动物护理与使用委员会的批准，并符合《实验动物护理与使用指南》的要求21。
1. 病毒注射准备
注意：本方案采用 BSL-1 防护措施。当使用 BSL-2 防护措施时，需穿戴一次性实验服、手套、鞋套、护目用品和颗粒物防护口罩（N95 型）。所有操作 BSL-2 物质的人员必须由当地公共卫生机构进行颗粒物防护口罩的适配性检测。有关病毒载体操作与储存的更多细节，请参见 Lowery &amp;#38; Majewska (2010)22。
<ol>
	<li>首次使用时，将未使用的病毒分装至20 µl离心管中保存，以避免反复冻融。</li>
	<li>清理工作台面，移除所有不必要的物品，并用70%乙醇对台面进行消毒。准备10%次氯酸钠溶液用于AAV废弃物的去污处理。在工作台上放置盛有该次氯酸钠溶液的烧杯和一支无菌的10 µl注射器。在操作准备期间，将含有AAV的离心管置于装有碎冰的容器中。</li>
	<li>将装有病毒的离心管固定在标准台式虎钳中。用10 µl注射器吸取至少4 µl的AAV。加样时注意避免针头触碰离心管底部而弯曲。确保注射器中4 µl AAV溶液内无气泡。</li>
	<li>将空的病毒管丢弃至盛有10%次氯酸钠溶液的烧杯中。未使用的病毒部分应按照供应商说明进行储存。</li>
	<li>向废液容器中补充适量10%次氯酸钠溶液，废弃物需静置30分钟后，方可处理已去污的液体废物。</li>
	<li>所有防护装备和塑料废弃物应根据机构规定丢弃至生物危害容器中。任何接触过病毒的仪器或表面均须使用10%次氯酸钠进行去污处理。</li>
</ol>
2. 手术
<ol>
	<li>通过在体视显微镜装置下方及邻近区域放置吸水实验台纸，准备手术区域，邻近区域应指定为专门的病毒操作区。
	<ol>
		<li>在靠近手术装置的专用病毒操作区内放置一个含10%次氯酸钠的废液容器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导稳定的麻醉状态，并为大鼠手术做好准备。
	<ol>
		<li>将大鼠放入诱导室，室内通入异氟烷气体（浓度范围为1%至3%）与氧气（流速约为1 L/min，纯度100%），直至大鼠意识丧失且无明显自主运动。在整个手术过程中维持异氟烷麻醉状态。</li>
		<li>达到深度麻醉后，剃除从两眼之间至耳后稍远处的毛发。&#160;</li>
		<li>将大鼠重新放回诱导室，继续麻醉1-3分钟。</li>
		<li>确保异氟烷麻醉系统已连接至立体定位手术仪的鼻罩。打开异氟烷管路上的三通阀，使异氟烷开始流向立体定位仪。维持上述浓度的异氟烷和氧气供应。</li>
		<li>将大鼠固定于立体定位仪上，将其门齿固定在门齿杆上，并插入耳杆以固定头部。</li>
		<li>在切口前，向眼睛涂抹眼用润滑剂，并在手术部位涂抹聚维酮碘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在颅骨背侧中线处做一条长约2.4 cm的切口，起始位置约在眼睛后方2 mm处。牵开皮肤以暴露颅骨。定期在手术创面边缘滴加无菌0.9%生理盐水，防止组织干燥。&#160;</li>
	<li>清除颅骨上的膜状组织，直至前囟（bregma）和后囟（lambda）清晰可见。</li>
	<li>通过测量前囟和后囟处的背腹向坐标，确认颅骨处于水平位置。相应调整立体定位装置，使前囟与后囟的背腹向坐标差异不超过0.04 mm。</li>
	<li>此时，将异氟烷气体浓度降低至2%至2.5%之间。</li>
	<li>将钻头移回前囟位置，重新归零坐标，然后将钻头移动至目标的内外侧和前后向坐标。</li>
	<li>使用0.9 mm钻头在目标坐标处钻孔，该尺寸可为28 G灌注针头提供合适大小的孔径。</li>
	<li>设置灌注泵以0.2 µl/min的速率输送病毒。将注射器装入立体定位仪的灌注臂，缓慢将针头下降至目标坐标，注入所需量的病毒（范围为0.1至0.8 µl）。例如，在4分钟内注入0.8 µl的AAV。 
	注意：应开展预实验以确定各目标脑区的最佳灌注体积及病毒扩散范围。
	<ol>
		<li>病毒注射完成后，将注射器留置原位10分钟，以防止液体回流至针道。随后以约5 mm/min的速度缓慢提升注射器。重复上述步骤，直至所有目标坐标均完成AAV注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用外科缝合钉闭合切口，并在伤口表面涂抹局部抗生素软膏。</li>
	<li>遵循机构指南进行术后镇痛管理。</li>
	<li>将大鼠放入带有垫料、笼盖和适当标识的笼子中，并送回动物设施。
	<ol>
		<li>若在BSL-2防护条件下操作，应根据机构指南规定的时间（通常为48-72小时）收集垫料，并将其放入生物危害废物容器中。</li>
		<li>按照相关安全处置指南，处理所有被AAV污染的材料。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 行为实验装置
注意：感觉预条件装置由一个标准的操作性条件反射箱（12英寸长 × 9.5英寸宽 × 11.5英寸高）组成，箱体底部为不锈钢网格地板，两侧为Plexiglas侧壁，另两侧为金属壁。
<ol>
	<li>在铝制壁板上安装一个2.8 W的光源，作为笼内照明灯，并在以2 Hz频率闪烁时作为视觉刺激。在实验箱内安装扬声器，用于传递听觉刺激（10秒、1500 Hz、78 dB的纯音和10秒、78 dB的白噪声）。
	<ol>
		<li>使用食料分配器将45 mg的食物颗粒送入食杯中。食杯内装有红外光电管，用于检测在刺激呈现前、刺激呈现期间及刺激结束后动物头部停留在食杯中的总时间。</li>
		<li>将实验箱置于隔音柜（宽22英寸 × 高22英寸 × 深16英寸）中，隔音柜配备排气扇（约68 dB）。</li>
		<li>使用配备Med Associates软件的PC计算机控制操作箱并采集数据。在条件化阶段，记录在光刺激呈现期间（5秒时间段）以及食物奖励呈现期间（5秒时间段）动物头部位于食杯内的总时间。在测试阶段，记录在听觉刺激结束后10秒时间段内动物对听觉刺激反应而停留在食杯中的总时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 感觉预条件范式概述
<ol>
	<li>手术恢复后，逐渐将大鼠的食物摄入量限制为其自由进食时体重的85%。请咨询兽医人员以确定合适的食物限制方案。 
	注意：三阶段感觉预条件范式如图2所示。</li>
	<li>预条件阶段（第一阶段；连续4天，每天进行64分钟的训练）：
	<ol>
		<li>向大鼠呈现12次随机混合的试验，每次试验包括听觉和视觉刺激的传递。每次听觉刺激后设置平均为4.5分钟（范围为4.0至5.0分钟）的试次间间隔。</li>
		<li>在其中6次试验中，先呈现一个音调（预条件刺激）10秒，紧接着立即呈现闪烁光刺激5秒。</li>
		<li>在其余6次试验中，单独呈现白噪声（非配对刺激）10秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>条件化阶段（第二阶段；连续5天，每天进行64分钟的训练）：
	<ol>
		<li>向大鼠呈现8次试验，每次试验先呈现视觉刺激（闪烁光刺激）5秒，紧接着立即给予两粒45 mg的食物颗粒。每次试验后设置平均为7分钟（范围为6.0至8.0分钟）的试次间间隔。部分大鼠可能需要超过5次条件化训练才能学会光-食物的关联。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测试阶段（第三阶段；单次78分钟的试验）：
	<ol>
		<li>向大鼠呈现12次随机混合的试验，每次仅呈现听觉刺激。每次听觉刺激后设置平均为4.5分钟（范围为4.0至5.0分钟）的试次间间隔。</li>
		<li>在其中6次试验中，单独呈现音调刺激（预条件刺激）10秒。</li>
		<li>在其余6次试验中，单独呈现白噪声（非配对刺激）10秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过使用第二组大鼠重复实验来平衡刺激效应，其中白噪声作为预条件刺激，音调作为非配对刺激。</li>
</ol>
5. 药理学与行为学实验步骤
<ol>
	<li>打开行为实验装置的电源，并加载适用于相应行为实验阶段的 Med-PC 程序。连接并设置行为实验装置，确保安装在隔音箱上的风扇在通电时自动启动。</li>
	<li>配制浓度为 1 mg/ml 的氯氮平-N-氧化物（CNO）溶液：将 5.0 mg CNO 称量至 15 ml 锥形管中，加入 5 ml 无菌水或 5 ml 无菌 0.9% 生理盐水，涡旋振荡直至溶液澄清。
	<ol>
		<li>若 CNO 无法完全溶解，或需要配制更高浓度的 CNO 溶液，可添加助溶剂如 DMSO23。具体而言，配制含 0.5% DMSO 的 1 mg/ml CNO 溶液时，称取 5.0 mg CNO 并加入 25 µl DMSO 至 15 ml 锥形管中，轻轻弹动管体，确保内容物保持在管底。待溶液变澄清后，加入 5 ml 无菌水或 5 ml 无菌 0.9% 生理盐水。有关 CNO 溶液配制的进一步说明可参见 DREADD wiki 资源页面25。</li>
		<li>每次给药当天需新鲜配制 CNO 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在行为学测试前约 30 分钟，按 1 mg/kg 剂量腹腔注射 CNO。例如，对一只体重 200 g 的大鼠注射 0.2 ml 的 1 mg/ml CNO 溶液。CNO 的给药剂量与时间选择依据先前已发表的研究报告2,12。
	<ol>
		<li>在每次条件前训练阶段（第 1 阶段；共 4 天注射）前 30 分钟注射 CNO，但在所有后续行为实验阶段前给予溶剂对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>30 分钟后，将大鼠放入行为测试舱内，并启动相应行为实验阶段的计算机程序。</li>
	<li>完成行为任务后，立即将大鼠从测试舱中取出，并送回动物饲养室。</li>
</ol>
6. 行为数据的分析
注意：所有行为实验的因变量均为大鼠头部进入食杯的时间长度，通过食杯内红外光电管的中断信号进行检测。数据（单位：秒）由计算机软件采集并记录。
<ol>
	<li>不要对预处理阶段生成的数据进行分析。</li>
	<li>在条件化训练阶段：通过比较每只大鼠在5次行为训练中视觉刺激呈现期间食杯区域的行为，分析其学习光-食物关联的能力。具体而言，计算每次训练中8个试验各自在5秒光照时段内大鼠处于食杯区域的平均时间。即， 每次持续5秒，每只大鼠平均进行8次试验）。比较每个为期5天的实验阶段中对照组与实验组的平均值（参见 图3A).
	<ol>
		<li>通过使用与上述5秒光刺激时段相同的计算方法，比较5个行为训练阶段中食物奖励递送期间（5秒时段）食杯行为，分析大鼠获取食物奖励的动机。这些数值将始终高于视觉刺激呈现期间所获得的数值（参见 图3B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在测试阶段：计算描述大鼠在每种听觉刺激呈现时食杯行为的辨别比率。
	<ol>
		<li>具体而言，对于每只大鼠，计算其在6次感官预条件刺激呈现后，每次进入食杯的平均时间，并将该时间进行分割处理即， 由感觉预条件刺激呈现6次后，每次在食杯中停留的平均时间之和（来衡量）即， 提示音刺激）加上在6次未配对刺激呈现后，每次在食杯中停留时间的总平均值即， 白噪声刺激）。每个时段持续10秒。 
		注意：辨别分数达到或超过0.5表明大鼠已学会感觉预条件范式中的固有关联。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. AAV 定位与表达的验证
<ol>
	<li>使用4%多聚甲醛对大鼠进行经心脏灌注麻醉。由于使用了荧光标记，后固定时间不得超过2小时，以尽量减少抗原性的丧失并保持荧光信号。</li>
	<li>将灌注后的脑组织转移至含有30 ml磷酸盐缓冲液（1x）中20%蔗糖溶液的脑组织保存瓶中，脱水至少2天，直至脑组织沉入瓶底。</li>
	<li>使用冷冻滑动切片机对目标区域的整个前后范围进行冠状面脑切片（20–40 µm）。</li>
	<li>针对标记受体或报告蛋白进行免疫组织化学染色，以确定设计受体和/或报告蛋白的定位与表达情况12。DREADD wiki资源页面提供了免疫组织化学染色方案25。</li>
	<li>将切片贴附于SuperFrost Plus载玻片上，并使用100–200 µl水溶性封片介质加盖盖玻片。</li>
	<li>对脑组织进行荧光显微镜观察，以验证AAV的定位及蛋白表达12,24。</li>
</ol>

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<li>Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+versus+delayed+stimulation+of+feeding+by+the+endogenously+released+AgRP+neuron+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22GABA%2C+NPY+and+AgRP.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators.</a> GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).</li>
<li>Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlates+of+compensatory+collateral+sprouting+by+aminergic+and+cholinergic+afferents+in+the+hippocampal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation.</a> Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).</li>
<li>Nelson, R. J., Young, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+in+mice+with+targeted+disruption+of+single+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Behavior in mice with targeted disruption of single genes.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案描述了如何应用药理遗传学方法（DREADD）来研究特定脑区在多阶段复杂学习任务中的作用。通过在学习的不同阶段临时且远程地抑制特定脑区的神经活动，这种联合方法为研究多种行为提供了平台，包括更精细或被掩盖的学习形式。在本方案所描述的示例中，对照组大鼠和在压后皮层（RSC）表达设计受体的大鼠被用于一项三阶段行为任务12。任务的第一阶段涉及呈现多个中性刺激，假设对照组大鼠会在其中两个刺激之间形成刺激-刺激关联。工作假说认为RSC对刺激-刺激学习是必需的，因此，在连续4天的条件化过程中，每次行为测试开始前30分钟，对照组和实验组大鼠分别系统性给予设计药物（CNO）或溶剂对照。当CNO与设计受体结合时，会降低表达该受体的神经元的活动。在后续的行为条件化和测试阶段，当假设RSC不再影响学习时，则不再给予CNO，从而不干扰神经活动。
方案中的关键步骤
AAV 化合物的安全操作：药理遗传学方法所涉及的手术操作在技术上并不比简单的立体定位注射更为复杂，但在某些机构使用 AAV 需要实验人员遵守 BSL-2 防护规范。研究人员...

行为神经科学领域的一个激动人心的挑战是确定复杂行为的神经基础。已有多种技术被用于识别特定脑区对复杂行为各子成分的贡献，这些技术包括永久性损毁、通过套管植入实现的暂时性脑区失活以及光遗传学方法。尽管这些方法增进了我们对学习过程中脑区特异性的理解，但每种技术都存在一定的局限性。具体而言，永久性损毁通常在行为测试前实施，因此其效应贯穿整个实验范式始终。涉及短期神经抑制剂（例如，河豚毒素）的套管实验可能对脑组织造成显著损伤，并在行为测试前诱导实验对象产生应激反应。此外，通过套管进行的失活作用仅限于套管尖端周围的脑区组织。最后，尽管光遗传学技术在特定脑区活动的时间控制方面具有高度灵活性，但其成本高昂且技术要求复杂。
这些局限性可通过采用药理遗传学方法（仅由设计药物激活的设计受体，DREADDs）加以克服1,2。重要的是，尽管药理遗传学的概念较为复杂，其技术操作却十分简便。类似于传统的立体定位手术方法（例如将毒素（如 NMDA、红藻氨酸）注入特定脑区），该技术涉及将携带编码修饰型抑制性G蛋白偶联受体（hM4Di；即设计受体）DNA片段的腺相关病毒（AAV）注入标准实验啮齿类动物的特定脑区（见图1）。该病毒载体还包含一个荧光报告基因（mcitrine）。一旦病毒被细胞摄取，设计受体（及报告蛋白）在注射后约3周达到最大表达水平，并可通过系统给予原本无生物学活性的设计药物氯氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide, CNO）选择性激活，作用持续时间为2–5小时1,3。由于实验者能够对特定脑区神经活动实现精确且非侵入性的时间控制，药理遗传学方法特别适用于多阶段行为范式的联合研究。在本示例中，比较了压后皮层（RSC）在刺激-刺激学习中的作用与其在经典条件反射学习中的功能，但这种联合策略同样适用于大量旨在探究特定脑区如何参与复杂行为的科学问题。
此外，尽管本方案中未作描述，但可采用病毒和转基因方法实现特定细胞类型的DREADD表达2。与涉及药理学和/或其他类型实验干预的行为学范式一样，在使用DREADD方法时，必须仔细考虑实验设计及后续的定量分析。对于初次使用DREADD方法的研究人员，建议参考关于当前DREADD技术的全面综述2。
每天，生物体会学习新的刺激和事件，以及它们之间的相互关系。即使在熟悉的环境中（如家中），人们也能迅速察觉刺激之间关系的变化，因为这些变化可能预示着重要事件的发生。这种刺激-刺激（即， 关系性学习涉及多种刺激的结合，传统上被认为与海马体相关，海马体位于内侧颞叶的中央区域4然而，海马体并非孤立存在或独立发挥作用；内侧颞叶内外的皮层区域为海马结构提供了关键的感觉信息5-7. 传统永久性损毁研究为多个皮层区域的参与提供了有力证据（例如， 在依赖海马的学习过程中，后压部皮层、后鼻周皮层和内嗅皮层等脑区发挥重要作用，但现有方法在解析特定脑区于学习不同阶段的具体作用方面存在局限性8-10.
本实验方案通过在三阶段感觉性预处理范式11,12的某一单阶段期间沉默后扣带皮层（RSC），检验RSC对刺激-刺激学习是否必要的假设。简言之，大鼠接受含有设计受体的腺相关病毒（AAV）注射，约3周后，在行为测试开始前30分钟给予设计药物（CNO）。在本方案中，实验组大鼠在测试的第一阶段（即发生刺激-刺激学习的阶段）接受CNO处理，而在后续两个测试阶段接受载体对照。为控制CNO对行为可能产生的非特异性影响，对另一组大鼠注射设计受体（hM4Di）但给予载体而非CNO。为排除病毒注射及受体表达的普遍性效应，另设对照组大鼠注射不含设计受体的对照病毒，并给予CNO处理。
多种不同血清型的腺相关病毒（AAV）被用于递送遗传物质。目前，美国国立卫生研究院（NIH）关于涉及重组或合成核酸分子研究的指导原则指出，当AAV（所有血清型）或重组/合成AAV载体所携带的转基因不编码潜在致瘤性基因产物或毒素分子，且在无辅助病毒存在的情况下生产时，应采取生物安全等级1（BSL-1）防护措施（附录B-1，风险组1（RG1）病原体）13。目前已有大量关于AAV结构、应用及安全性的综述可供参考14,15。然而值得注意的是，由于存在关于AAV在啮齿类动物中可能影响生殖16,17以及潜在致癌机制18-20的担忧，部分机构要求在操作AAV时采用生物安全等级2（BSL-2）防护措施。在美国使用病毒载体进行基因操作时，应在实验前通过咨询研究所在机构的监管委员会、美国疾病控制与预防中心（CDC）以及《涉及重组DNA分子研究的NIH指导原则》13，确认适用的生物安全等级。上述指南对个人防护、研究人员培训、载体 containment、去污染措施、去污染后材料的处置以及注射后实验动物的饲养要求均作出了明确规定。此外，应咨询并遵循所在机构的动物护理与使用委员会（IACUC）或相应机构监管委员会的指导原则，以确保AAV的安全操作、给药及废弃物处理。

<table><tbody><tr><td>雄性，Long Evans 大鼠，55-60 日龄</td><td>Hilltop Lab Animals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine</td><td>病毒载体核心实验室</td><td></td><td>注意：此为 BSL-1 级化合物</td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-GFP</td><td>病毒载体核心实验室</td><td></td><td>注意：此为 BSL-1 级化合物</td></tr><tr><td>氯氮平-N-氧化物（Clozapine-N-oxide）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>4936-10</td><td>设计药物</td></tr><tr><td>大鼠笼盖（聚碳酸酯材质）</td><td>Alternative Design&amp;nbsp;</td><td>FT 8XL-PC</td><td>用于输注后 48-72 小时覆盖动物笼具</td></tr><tr><td>滤纸（替换用）</td><td>Alternative Design</td><td>FP-R-1018XAD</td><td>与笼盖配套使用的滤纸</td></tr><tr><td>台式虎钳</td><td>JETS</td><td>2201-265</td><td>用于在通风橱内固定含有 AAV 的微量离心管</td></tr><tr><td>生物危害垃圾袋</td><td>Staples</td><td>113444</td><td>Medline 生物危害内衬袋</td></tr><tr><td>生物危害垃圾桶</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>United Solutions 34 加仑矩形带轮垃圾桶，配挂钩锁紧手柄</td></tr><tr><td>异氟烷，100 ml</td><td>Patterson Veterinary Supply Inc.</td><td>07-890-8540</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>双通道小型动物立体定位仪，带数字显示控制台</td><td>David Kopf</td><td>Model 942</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>非穿刺式耳杆（大鼠用，一套两个）</td><td>David Kopf</td><td>Model 955</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>麻醉面罩（大鼠用）</td><td>David Kopf</td><td>Model 906</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>高速立体定位钻，含台式电机控制器、脚踏开关、手柄及立体定位手柄支架</td><td>David Kopf</td><td>Model 1474</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>微型钻头，0.9 mm</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>19007-09</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>自动微量注射泵，配 micro4 控制器</td><td>David Kopf</td><td>Model UMP3-1</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>Pro-animal 可拆卸陶瓷刀片电推剪套装</td><td>Ahdis</td><td>21420</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>聚维酮碘皮肤清洁剂</td><td>Perdue Products L.P</td><td>67618-149-04</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>三重抗生素软膏</td><td>Medline Supply</td><td>53329-087-01</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>Puralube vet 软膏</td><td>Only Veterinary Supply</td><td>17033-211-38</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>Dino-lite</td><td>显微镜</td><td>AD7013MTL</td><td>传统解剖显微镜的替代设备</td></tr><tr><td>Dino-lite 刚性台式悬臂支架</td><td>显微镜</td><td>MS36B</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>28 G 10 &amp;mu;l 注射器</td><td>Hamilton</td><td>80308-701SN</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>超高度 MDF 隔音屏蔽箱</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-018MD</td><td>22' 宽 × 22&quot; 高 × 16&quot; 深</td></tr><tr><td>超高度模块化测试舱</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-007</td><td>行为学设备</td></tr><tr><td>不锈钢网格地板</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-005</td><td>行为学设备</td></tr><tr><td>笼内照明灯</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-215M</td><td>用作笼内照明及刺激光源</td></tr><tr><td>模块化颗粒分配器</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-203M-45</td><td>行为学设备</td></tr><tr><td>颗粒接收器，杯型</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-200R1M</td><td>行为学设备</td></tr><tr><td>大鼠头部进入检测器</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-254-CB</td><td>行为学设备</td></tr><tr><td>无尘精密饲料颗粒，45 mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>行为学耗材</td></tr><tr><td>大鼠实验舱用笼内扬声器</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-224AM</td><td>行为学设备</td></tr><tr><td>可编程音频发生器</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ANL-926</td><td>行为学设备</td></tr><tr><td>Smart ctrl 8 输入/16 输出模块包</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-716P2</td><td>行为学设备</td></tr><tr><td>大型台式机柜及电源</td><td>Med Associates, Inc</td><td>SG-6510D</td><td>行为学设备</td></tr><tr><td>PCI 接口模块包</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-700P2-R2</td><td>行为学设备</td></tr><tr><td>Med Intel 核心计算机套装，配 X Pro 19&quot; 显示器</td><td>Med Associates, Inc</td><td>COM-103V</td><td>行为学设备</td></tr><tr><td>多聚甲醛（颗粒状），1 kg</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td>危险：致癌物，需在通风橱内称量</td></tr><tr><td>兔单克隆抗体（HA 标签）</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>3724S</td><td>组织学试剂</td></tr><tr><td>XP 兔单克隆抗体（GFP）</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>2956S</td><td>组织学试剂</td></tr><tr><td>抗兔 IgG</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4412S</td><td>组织学耗材</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>VWR international</td><td>483111-703</td><td>组织学耗材</td></tr></tbody></table>

一种在学习特定阶段远程抑制啮齿类动物神经活动的方法

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

本方案描述了如何在动物进行学习与记忆任务时，暂时且远程地抑制特定脑区的神经元活动。该方法结合了药理遗传学（仅由设计药物激活的设计受体）与一种行为范式（感觉预条件化），旨在区分不同类型的学习过程。具体而言，通过病毒介导递送的方式，在啮齿类动物的特定脑区表达一种基因改造的抑制性G蛋白偶联受体（即设计受体）。三周后，当设计受体的表达水平达到较高程度时，在特定行为实验开始前30分钟系统性给予一种药理学试剂（即设计药物）。该药物可特异性结合设计受体，从而抑制表达该受体的神经元活动，而在其他方面无生物学活性。脑区的抑制状态可持续2至5小时（取决于给药剂量和途径）。行为范式完成后，需对脑组织进行检测，以确认病毒注射位点准确及受体表达正常。该方法特别适用于确定单个脑区对行为特定成分的贡献，并可应用于多种不同的行为范式研究中。

行为学结果
实验完成后，应定量和定性评估特定脑区暂时失活的效果。本示例采用三阶段行为学范式（感觉预条件化），在预条件化阶段给予CNO以抑制后扣带皮层（RSC）的神经活动，旨在验证RSC对于中性刺激间关联形成具有必要性的假设12。需要强调的是，研究者并不局限于本文所述的行为学范式或实验设计，因为药理遗传学方法可与大多数行为学范式相结合。
尽管通常不会对预条件化阶段（第1阶段）期间产生的数据进行分析，但量化大鼠在条件化阶段（第2阶段）是否学会了光-食物的关联非常重要。如图3A所示，实验组（Expt）和对照组（Ctrl）大鼠在光刺激呈现期间的食物杯行为均逐渐增加（图3A），表明大鼠已建立了视觉刺激（光）与食物奖励之间的经典条件反射关联。此外，两组大鼠在食物奖励呈现期间的食物杯行为也均逐渐增加（图3B），表明它们获取奖励的动机相当。在关键的测试阶段，当单独呈现听觉刺激而无其他刺激时，对照组大鼠的辨别分数显著不同于实验组...

本方案描述了在大鼠进行学习与记忆任务时，如何暂时且远程地抑制离散脑区中神经元活动的方法。该方法结合了药理遗传学（仅由设计药物激活的设计受体）与一种行为范式（感觉预条件），旨在区分学习过程中的不同组分。

本方案描述了在动物进行学习和……时，如何暂时且远程地抑制特定脑区神经元活动的方法。

本实验的目的是在动物进行学习和记忆任务时，暂时且远程地抑制特定脑区的神经元活动。该目标通过以下步骤实现：首先将含有设计受体和报告基因的 a a V 装载到注射用注射器中；第二步是将 a a V 注入大鼠脑内的目标区域。接下来，将制备生物学上惰性的设计药物氯氮平及其氧化物，并将其系统性地注射到大鼠体内。最后一步是使用感觉预条件范式进行行为学测试。最终，通过免疫荧光显微镜检测大鼠脑组织，以验证设计受体的定位情况。该方法有助于回答行为神经科学领域中的关键问题，包括但不限于动机、注意力以及学习与记忆的调控。确保在整个操作过程中遵守机构关于使用腺相关病毒的所有安全预防措施；本视频中使用的病毒被归类为生物安全一级化合物。配制10%的次氯酸钠溶液，用于对腺相关病毒废弃物进行消毒处理，准备一个含有次氯酸钠溶液的容器以及一支无菌的10微升注射器。在工作区中，将含有 a a V 样品等分试样的微量离心管放入标准台式虎钳中。使用一支容量至少为 10 微升的注射器吸取至少 4 微升的 a A v 溶液，确保其中不含任何气泡。用该注射器将空的病毒管丢弃至含有 10% 次氯酸钠溶液的烧杯中。向废液容器中再加入 10% 漂白剂，使废液静置 30 分钟，然后按照机构指南的规定处理已消毒的液体废弃物。通过在体视显微镜装置下方及邻近区域（指定为专用病毒操作区）铺设吸水性实验台纸，准备手术区域。麻醉诱导使用 3% 异氟烷（isoflurane），以每分钟一升的流速与氟气和氧气混合进行。将大鼠两眼之间至耳后稍靠后部位的毛发剃除。剃毛后，将大鼠重新置于诱导室中麻醉3分钟，并将其固定于立体定位仪上。用眼用软膏覆盖双眼，并使用聚维酮碘清洁切口部位以作准备。在颅骨上方距眼睛约2毫米尾侧处，沿中线做一条2.4厘米长的皮肤切口，将皮肤牵开以暴露颅骨，随后清除颅骨表面的膜状组织，直至前囟（bregma）和后囟（lambda）清晰可见。确认颅骨表面平整后，将钻头置于前囟处，归零坐标，然后将钻头移至目标的内侧、外侧及前-后坐标位置。使用0.9、0.7或0.5毫米的钻头钻孔。将输注泵设置为以每分钟 0.2 µL 的速率输送病毒。将注射器装入立体定位仪的输注臂，并将注射器下降至目标坐标。病毒输送完成后，使用泵输送所需剂量的病毒。将注射器留置10分钟以防止回流，然后沿针道缓慢抬起注射器，速度约为每分钟5毫米。接着移至下一个坐标位置，并重复此操作，直至所有坐标均注射完毕AAV。根据批准的方案闭合伤口并给予术后镇痛后，将大鼠放入铺有垫料、加盖并贴有适当标签的清洁笼具中。当大鼠完全从麻醉中恢复后，将其送回饲养室。在开始行为学测试前，需等待三周或更长时间，以确保设计受体得到充分表达。该图展示了感觉预条件范式的三个阶段：预条件阶段、条件化阶段和测试阶段。设计药物氯氮平氧化物（clozapine and oxide，简称 CNO）可用于通过激活设计受体来抑制神经元活动。在任何测试阶段之前均可注射 CNO。本实验中，在每次条件化前训练阶段前 30 分钟注射 CNO。根据方案书面部分的说明，配制新鲜的 1 毫克/毫升氯氮平氧化物溶液后，在行为学测试前 30 分钟以每公斤体重 1 毫克的剂量进行腹腔注射。启动相应行为实验的计算机程序。30分钟后，将大鼠放入测试舱内，开始第一次为期64分钟的前条件训练，共进行4次。通过向大鼠呈现12次混合交替的听觉和视觉刺激试验来开展实验。在其中6次试验中，呈现作为前条件刺激的纯音，持续10秒，紧接着立即呈现闪烁光刺激，持续5秒；在另外6次试验中同样进行该流程。单独呈现白噪声（未播放的刺激）10秒。在完成预处理阶段后，开始进行条件化训练，该训练将在连续五天内进行。每天向大鼠呈现八次试验，每次试验包括呈现视觉刺激（闪烁光）5秒，紧接着立即给予2粒45毫克的食物颗粒。此次应包含长达七分钟的试验间间隔，待条件化训练结束后，进行一次78分钟的单次测试会话，向大鼠呈现12次随机混合的试验，每次仅给予听觉刺激。在其中六次试验中。呈现音调刺激，即仅给予前提条件刺激，持续10秒。在其余六次试验中，呈现白噪声，即仅给予非配对刺激，持续10秒。行为任务完成后，立即将大鼠从实验箱中取出，并送回动物饲养区。根据方案书面部分的详细说明，分析条件化阶段和测试阶段的数据。在针对标记的报告基因或报告蛋白进行免疫组织化学染色后，通过显微镜观察染色切片，以确定设计受体和/或报告基因的位置与表达情况。对照组和实验组大鼠均如预期地在条件化过程中学会了闪烁光刺激与食物之间的巴甫洛夫关联。在实验过程中，两组大鼠在条件化阶段均被激励以获取食物奖励。相比之下，在关键的测试阶段，实验组大鼠未能区分预条件化声音刺激与未经配对的声音刺激，而对照组大鼠对预条件化刺激的呈现表现出更频繁的食物杯行为。因此，只有对照组大鼠表现出感觉预条件化效应，而实验组大鼠则无此效应。此图像显示了在啮齿类动物大脑感兴趣区域进行 a v 输注后，对该输注位置进行的组织学验证。该技术的发展为神经科学研究人员探索特定脑区和/或细胞类型在活体中对复杂行为的贡献奠定了基础。

a-method-for-remotely-silencing-neural-activity-rodents-during

Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

为远程沉默的神经活动在鼠害的方法在学习独立的阶段

本报告中，我们介绍一种完全自动化且高度多功能的系统，该系统能够同时检测啮齿类动物的多种认知行为并记录其神经元活动。...

一种用于检测啮齿类动物多认知功能及记录神经元活动的全自动化且高度多功能的系统

将麻醉后的新生幼鼠置于加热垫上。用乙醇对头皮进行消毒。用含有携带药物激活型抑制性受体基因及示踪染料的腺相关病毒的病毒溶液填充注射器。将注射器针尖对准幼鼠头部，缓慢将病毒注入脑内，以确保均匀分布。让幼崽恢复。孵育期间，病毒颗粒进入神经元并将遗传物质释放到细胞核中。这会导致神经元膜上抑制性受体的表达。这些受体与离子通道相关联，但在被激活之前不会影响神经元信号传导。接下来，在数天内将目标药物皮下注射到幼鼠的颈部。该药物可穿过血脑屏障，并与抑制性受体结合。这会触发化学遗传学反应，改变离子在神经元膜上的流动，从而抑制神经元信号传导。这种化学遗传学沉默技术可模拟脑部疾病，并有助于研究异常的脑活动。...

新生小鼠神经元活动的化学遗传学沉默

来源：Lai, J., et al. 在啮齿类动物大脑中同时进行电生理记录与抑制剂微注射。J. Vis. Exp.

抑制大鼠神经元活动及其通过电生理学检测的方法

提出了一种用于啮齿类动物操作性条件反射的全自动化实验方案。该方案依赖于对行为事件的精确时间控制，以研究这种控制在多大程度上影响感觉运动整合及认知控制实验中潜在的神经活动。...

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记录鸽子在自由移动状态下经历三个学习阶段的单个神经元动作电位

在此，我们制备一种具有双重功能的玻璃移液管：通过药物微注射抑制深部脑结构，并通过同步的电生理记录实时监测其效应。...

在啮齿类动物大脑中同步进行电生理记录与抑制剂微注射

穿梭箱回避学习在行为神经科学中已有充分研究。本方案描述了如何将啮齿类动物的穿梭箱学习与特定脑区的皮层内微刺激（ICMS）以及同步的慢性体内记录相结合，作为一种研究学习与感知多个方面的工具。...

结合穿梭箱训练与皮层电生理记录及刺激作为研究感知与学习的工具

迷走神经刺激（VNS）已成为一种诱导前脑靶向突触可塑性以调节多种行为的工具。本方案描述了如何实施迷走神经刺激以促进恐惧消退记忆的巩固。...

迷走神经刺激作为诱导与消退学习相关通路可塑性的工具

我们介绍了用于构建电极的方法，可在清醒小鼠中同时记录细胞外神经活动，并在记录位点附近释放多种神经活性物质。该技术能够对目标神经元的潜在局部突触输入进行详细分析。...

清醒小鼠神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微电泳给药相结合

本文描述了用于从小鼠脑内进行在体电生理记录脑信号的微型驱动装置的设计与组装方法。通过将微电极束固定在坚固且可驱动的载体上，这些技术可实现长期且稳定的神经信号记录。该装置的轻量化设计使得动物在植入驱动装置后仍能不受限制地完成各种行为学任务。...

用于清醒行为小鼠慢性神经记录的微驱动阵列构建

学习利用药理学遗传学方法在特定脑区远程沉默神经元活动，以研究大鼠学习与记忆任务中的神经机制。该技术结合感觉预条件行为范式，可精确操控神经回路并验证受体定位。

一种在学习特定阶段远程抑制啮齿类动物神经活动的方法

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