一种在学习特定阶段远程抑制啮齿类动物神经活动的方法

本实验的目的是在动物进行学习和记忆任务时，暂时且远程地抑制特定脑区的神经元活动。该目标的实现首先需要将含有设计受体和报告基因的 a a V 装载入注射器中以进行灌注；第二步是将 a a V 灌注到大鼠脑内的目标区域。

接下来，将制备生物学上惰性的设计药物氯氮平及其氧化物，并将其系统性地注射到大鼠体内。最后一步是采用感觉预条件范式进行行为学测试。最终，通过免疫荧光显微镜检测大鼠脑组织，以验证设计受体的定位情况。

该方法有助于回答行为神经科学领域中的关键问题，包括但不限于动机、注意力以及学习与记忆的调控。确保在整个操作过程中遵守所有机构关于使用腺相关病毒的安全规范；本视频中所使用的病毒被归类为生物安全一级化合物。配制10%的漂白剂溶液，用于对腺相关病毒废弃物进行消毒处理，并准备一个装有漂白剂溶液的容器以及一支无菌的10微升注射器。

在工作区中，将含有 a a V 样品 aliquot 的微量离心管放入标准台式虎钳中。使用一支容量为 10 微升的注射器，吸取至少四微升的 a A v。确保四微升的 a a v 溶液中无任何气泡。用该注射器将空病毒管丢弃至盛有 10% 次氯酸钠溶液的烧杯中。

向废液容器中额外加入10%漂白剂，并让废液静置30分钟，然后按照机构指南的规定处理已消毒的液体废弃物。通过在体视显微镜装置下方及指定的专用病毒操作区域附近放置吸水性实验台纸，准备手术区域。麻醉诱导使用3%异氟烷（isoflurane）、氟和氧，流速为每分钟一升。

将大鼠两眼之间至耳后稍靠后部位的毛发剃除。剃毛后，将大鼠重新置于诱导室中麻醉3分钟，并将其固定于立体定位仪上。用眼膏覆盖双眼，并使用碘伏清洁切口部位，做好术前准备。

在颅骨上方距眼睛约2毫米尾侧处，沿中线做一条2.4厘米长的皮肤切口，将皮肤牵开以暴露颅骨，随后清除颅骨表面的膜状组织，直至前囟（bgma）和后囟（lambda）清晰可见。确认颅骨表面平整后，将钻头置于前囟处，归零坐标，然后将钻头移至所需的内侧、外侧以及前后方向的目标坐标。使用0.9、0.7或0.5毫米的钻头钻孔。

将输注泵设置为以每分钟 0.2 µL 的速率输送病毒。将注射器装入立体定位仪的输注臂，并将注射器下降至目标坐标。病毒输送完成后，使用泵输送所需剂量的病毒。

留置注射器10分钟以防止回流，然后以每分钟约5毫米的速度缓慢提起注射器。接着移动至下一个坐标点，重复此操作，直至所有坐标点均注入a a v。根据批准的方案关闭切口并给予术后镇痛后，将大鼠置于带有垫料、盖子及适当标识的清洁笼具中。

当大鼠从麻醉状态完全恢复后，将其送回饲养室。在开始行为学测试前，应等待三周或更长时间，以确保设计受体得到充分表达。该图展示了感觉预条件范式的三个阶段：预条件阶段、条件化阶段和测试阶段。

设计药物氯氮平-N-氧化物（clozapine and oxide，简称CNO）可用于通过激活设计受体来抑制神经元活动。CNO可在任何测试阶段之前注射。在此，CNO在每次预处理阶段前30分钟注射。根据方案书面部分的说明，配制新鲜的1毫克/毫升氯氮平-N-氧化物溶液后，在行为学测试前30分钟以每公斤体重1毫克的剂量进行腹腔注射。

启动相应行为实验的计算机程序。30分钟后，将大鼠放入测试箱，开始第一次为期64分钟的前条件训练，共进行4次。通过向大鼠呈现12次混合交替的听觉和视觉刺激试验来开展实验。在其中6次试验中，呈现作为前条件刺激的纯音，持续10秒，紧接着立即呈现闪烁光刺激，持续5秒；在另外6次试验中同样进行该流程。

呈现白噪声，即单独播放未配对的刺激，持续10秒。在完成预处理阶段后，开始进行条件化训练，该训练将在连续五天内进行。每次向大鼠呈现8次试验，每次试验包括呈现视觉刺激，即闪烁光5秒，紧接着立即给予2粒45毫克的食物颗粒。

此次需包含长达七分钟的试次间间隔，待条件化训练结束后，进行一次78分钟的单次测试。测试期间向大鼠呈现12次随机混合的试次，每次仅给予听觉刺激。其中六次试次。

呈现音调刺激，即仅给予前条件刺激，持续10秒。在其余六次试验中，呈现白噪声，即仅给予非配对刺激，持续10秒。行为任务完成后，立即将大鼠从实验箱中移出，并送回动物饲养区。

根据方案书面部分的详细说明，分析条件化阶段和测试阶段的数据。在针对标记报告基因或报告蛋白进行免疫组织化学染色后，通过显微镜检查染色切片，以确定设计受体和/或报告基因的位置及表达情况。对照组与实验组大鼠均如预期般学会了闪烁光刺激与食物之间的巴甫洛夫关联。该现象出现在条件化训练期间。

在实验过程中，两组动物在条件化阶段均表现出获取食物奖励的动机。然而，在关键的测试阶段，实验组大鼠未能区分预条件化声音刺激与未配对的声音刺激，而对照组大鼠对预条件化刺激的呈现表现出更强的食物杯探究行为。因此，仅对照组大鼠表现出感觉预条件效应，而实验组大鼠则无此效应。

此图像显示了在啮齿类动物大脑感兴趣区域进行血管内注射后，对该注射位点进行的组织学验证。该技术为神经科学领域的研究人员探索特定脑区和/或细胞类型在活体动物复杂行为中的作用奠定了基础。