Name: 从小鼠癌症模型的循环肿瘤细胞的分离和繁殖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: 学习从小鼠肝细胞癌转移模型的全血中分离和扩增循环肿瘤细胞的方法。该技术通过离心、红细胞裂解和培养，建立可重复的临床前研究模型，为癌症转移机制研究提供可靠工具。

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奥贡沃比博士实验室的工作得到了美国国立卫生研究院少数族裔健康与健康差异研究所（国家少数族裔机构研究中心项目资助号 MD007599）的资助。本手稿的内容完全由作者负责，不一定代表NIMHD或NIH的官方观点。

伦理声明：所有动物实验均经纽约市立大学亨特学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 实验前准备步骤
<ol>
	<li>到达动物房后，最初将3只BALB/c小鼠饲养于带滤帽和木屑垫料的笼子中。确保小鼠可自由获取食物（Purina啮齿类动物饲料）和饮水。垫料和食物应每周更换两次，笼子应每周清洗一次。</li>
	<li>使用异氟烷蒸发器联合氧气以每分钟1升的恒定流速对小鼠实施全身麻醉。该系统为自给式，包含一个精密蒸发器。</li>
	<li>将动物置于一个塑料箱内，该箱连接有精密蒸发器及气体/麻醉系统。初始时将蒸发器设定为2.5，待动物失去意识后，将蒸发器调低至2。</li>
	<li>此时切换阀门管路，将其密封至箱体，并打开通向鼻罩的通路。</li>
	<li>将动物转移至准备区域，正确放置并连接鼻罩（用于维持麻醉）。</li>
	<li>每只小鼠准备5 × 106个BNL 1ME A.7R.1小鼠肝细胞癌细胞用于移植。BNL 1ME A.7R.1细胞应在培养基（含10%热灭活胎牛血清、1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺）中生长，置于37 °C、含空气和5% CO2的加湿培养箱内的细胞培养皿中孵育。</li>
	<li>使用带有20 G针头的注射器，将含有5 × 106个BNL 1ME A.7R.1小鼠肝细胞癌细胞的100 µl PBS注入BALB/c小鼠肝脏的一个叶中，以生成原发性肿瘤。移植后，将BALB/c小鼠饲养于笼中，饲养条件与移植前相同。</li>
	<li>在实验终点时，肝细胞癌的临床证据表现为体况评分显著下降（通常在4周后可检测到）。此时，肝脏中很可能已形成原发性肿瘤，同时肺部已出现转移灶。随后，开始循环肿瘤细胞的分离与扩增操作。</li>
</ol>
2. 循环肿瘤细胞分离用全血采集
注意：应正确消毒手术区域，并确保该区域无杂物。根据制造商的建议，对所有手术器械进行高压灭菌或浸泡在消毒剂中。
<ol>
	<li>在实验终点（出现肿瘤发育的临床证据）时，通过人道安乐死方法处死小鼠。小鼠的安乐死应采用 CO2 窒息法。需仔细观察小鼠，确认麻醉已充分起效。将二氧化碳缓慢通入密闭容器中，持续时间为 5 - 10 分钟，以引起呼吸停止。随后进行心脏穿刺放血及颈椎脱位。5</li>
	<li>使用连接 1 ml 注射器的 25 G 针头采集全血。用 0.01 ml 肝素对注射器进行肝素化处理。将针头以约 45° 角立即穿刺剑突下方的皮肤。缓慢推进针头以穿刺心脏，随后降低针头角度。稳定保持针头和注射器的位置，从心脏中抽出 500 µl - 1,000 µl 全血。</li>
	<li>取下注射器和针头，将血液转移至预先标记的无热原 1.5 ml 离心管中。将采集的全血在 1,167 × g 条件下离心 5 分钟。 
	注意：离心后全血样本分为三层：底部为红细胞压积层（红细胞层），中间为薄层的白膜层（buffy coat），顶部为血浆层。</li>
	<li>小心用移液器吸取上层血浆，转移至另一无热原 1.5 ml 离心管中，用于后续实验，如无细胞核酸的检测7。</li>
	<li>为分离循环肿瘤细胞（CTCs），将白膜层收集至另一无热原 1.5 ml 离心管中，用于红细胞（RBC）裂解前的准备。此步骤旨在去除白膜层中残留的红细胞。</li>
</ol>
3. 红细胞（RBC）裂解缓冲液配方
<ol>
	<li>配制1 L红细胞裂解缓冲液。</li>
	<li>分别配制500 ml氯化铵溶液和500 ml三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液，然后混合，得到1 L终浓度为155 mM氯化铵和10 mM Tris的红细胞裂解缓冲液。</li>
	<li>将缓冲液调节至pH 7.5。红细胞裂解缓冲液储存于+2至+8 °C，使用前立即恢复至室温。</li>
</ol>
4. 白膜层红细胞裂解
<ol>
	<li>向含有采集的血沉棕黄层的无菌无热原1.5 ml离心管中加入1 ml红细胞裂解缓冲液。</li>
	<li>通过反复倒置混匀管内液体。将混匀后的液体在室温下静置孵育5分钟。随后以1,167 × g离心5分钟。</li>
	<li>离心后可见白色沉淀。缓慢且小心地将红色上清液弃入10%次氯酸钠溶液中，避免扰动沉淀。若沉淀不呈白色，则需重复步骤3.1–3.5。适当延长红细胞裂解缓冲液中的孵育时间至10–15分钟可能有助于改善结果。</li>
	<li>在生物废弃物经10%次氯酸钠溶液处理24小时完成去污后，安全处置生物废弃物。</li>
</ol>
5. 细胞培养中的传代
注意：肿瘤细胞通常是快速生长的细胞，而白细胞在接种到培养皿中的原始细胞混合物中含量丰富。经过多次更换培养基以及循环肿瘤细胞（CTCs）的连续传代后，所有白细胞均被去除，仅留下相对纯净的CTCs群体。
<ol>
	<li>将上清液弃入10%次氯酸钠溶液后，用1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）至少洗涤白色沉淀一次，并将沉淀重悬于完全培养基中，用于细胞培养传代。</li>
	<li>洗涤完成后，向沉淀中加入1 ml完全BNL 1ME A.7R.1培养基（含10%热灭活FBS、1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺），并将沉淀在培养基中充分重悬。</li>
	<li>将重悬的细胞混合液接种至细胞培养皿中。将培养皿置于37 °C、含空气和5% CO2的加湿培养箱中孵育。</li>
	<li>每两到三天更换一次细胞培养基。五至七天后，循环肿瘤细胞（CTCs）将贴附于培养皿表面并开始增殖。这些细胞在连续传代超过25代以及经历多次冻融循环后仍可保持活性5。</li>
</ol>
6. 肝细胞癌循环肿瘤细胞系的验证
<ol>
	<li>采用基于聚合酶链式反应（PCR）的方法，仅扩增小鼠β-珠蛋白基因的一个特异性DNA片段，以确认新建立的CTC细胞系与最初植入的BNL 1ME A.7R.1 HCC细胞系一样均为小鼠细胞。该方法最初由Steube et al.5,8描述并验证。</li>
	<li>使用特异性抗体对肝细胞特异性标志物cAMP应答元件结合蛋白3样3（CREB3L3）进行免疫染色。该检测可确认新建立的CTC细胞确实为肝细胞，与最初植入的BNL 1ME A.7R.1细胞系一致。5</li>
</ol>

<ol><li>Ashworth, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cancer+in+which+cells+similar+to+those+in+the+tumors+were+seen+in+the+blood+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death.</a> Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).</li>
<li>van de Stolpe, A., den Toonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells%3A+What+Is+in+It+for+the+Patient%3F+A+Vision+towards+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future.</a> Cancers. 6, 1195-1207 (2014).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).</li>
<li>George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Tissue+is+the+issue%22%3A+circulating+tumor+cells+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastrointestinal+cancer%22%5BJournal%5D)">"Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer.</a> Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).</li>
<li>Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+HGF+and+c-Met+drives+metastasis+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma.</a> PloS one. 8, e63765(2013).</li>
<li>Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent%2C+biocompatible+nanostructured+surfaces+for+cancer+cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture.</a> International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+verification+of+rodent+cell+lines+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction.</a> Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer micrometastases.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).</li>
<li>De Giorgi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+bone+metastases+as+detected+by+FDG-PET%2FCT+in+patients+with+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+oncology+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Medical+Oncology+%2F+ESMO%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).</li>
<li>Eloubeidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+ultrasound-guided+fine+needle+aspiration+biopsy+of+patients+with+suspected+pancreatic+cancer%3A+diagnostic+accuracy+and+acute+and+30-day+complications%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).</li>
<li>O'Toole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+complications+of+EUS-guided+fine-needle+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration.</a> Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本研究描述了如何从肝细胞癌同系小鼠的全血中分离和扩增循环肿瘤细胞。本工作的目的是促进对癌症转移机制的持续研究。
导致多种癌症预后不良的一个因素是未能及时检测，从而导致恶性肿瘤广泛播散3。循环肿瘤细胞（CTCs）起源于原发性肿瘤，通过血液扩散至远端器官。因此，CTCs在癌症转移过程中具有重要作用，并具有多种临床应用潜力，例如可用于癌症诊断3,9,10。多项临床研究数据支持这一观点，表明CTCs与多种癌症（如胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌等）的疾病进展具有强相关性3,11,12。尽管CTCs在癌症诊断中可能具有重要价值，但由于其在数十亿血细胞中数量极少，分离和表征CTCs仍面临巨大挑战3,7。
使用我们的技术分离CTCs的意义在于，它提供了一个可重复的模型，可针对临床应用潜力进行优化。这最终可能使该方法有望替代目前更具侵入性且伴随副作用的活检操作。3,13外周静脉采血等对该方法的改进有望使其在临床环境中得到应用。当然，应当认识到...

自1869年Thomas Ashworth首次观察到循环肿瘤细胞（CTCs）以来，癌症研究领域已知这类细胞的存在1。此后研究表明，CTCs在肿瘤转移和疾病进展中具有重要作用2-5。如今，实体瘤是全球发病率和死亡率的主要原因。CTCs是一类稀有细胞，起源于原发性肿瘤，通过血液系统迁移至不同器官，但仅有极小部分最终形成转移灶2-5。值得注意的是，肿瘤大小与CTC数量之间存在正相关关系3,4。
对循环肿瘤细胞（CTC）生物学的理解有助于寻找靶向治疗策略。此外，CTCs 可能具有诊断应用价值。为了实现这些潜在的临床应用，需要克服当前研究 CTCs 所面临的一些挑战。其中一个挑战与 CTCs 可能以单个细胞或细胞簇的形式存在，并且可能能够根据血液微环境的变化改变其表型有关2。此外，检测 CTCs 非常困难，部分原因在于血液中 CTCs 的数量极少（每毫升数个至数百个），而每毫升血液中却含有约十亿个血细胞6。尽管如此，近年来针对实体器官肿瘤来源的 CTCs 潜在临床应用的研究已显著加强。
尽管做出了这些努力，由于循环肿瘤细胞（CTCs）极为稀少以及现有技术工具的不足，研究和理解CTCs作用的挑战依然存在。尽管面临这些挑战，CTCs在癌症转移研究中的巨大临床应用潜力仍激励着人们持续推进相关研究。
我们最近成功地从肝细胞癌（HCC）转移的原位同系小鼠模型中分离出循环肿瘤细胞（CTCs），并在细胞培养中实现了其扩增。5本文的目的是详细描述该成功方法学的各个方面。此方法学的意义在于，该方法可经过适当修改，成功地分离并在体外培养中扩增人源循环肿瘤细胞（CTCs），从而提高实现这一目标的可能性 体外 循环肿瘤细胞生物学研究。 
循环肿瘤细胞（CTCs）具有多种潜在的临床应用价值。CTCs 可能可用于预后评估、治疗反应监测、筛查、肿瘤分子改变的动态监测以及个体化治疗4。因此，深入理解 CTCs 的生物学特性有望在临床上产生重大影响。

<table><tbody><tr><td>肝素钠盐 1 g</td><td>VWR</td><td>89508-852</td><td></td></tr><tr><td>BTX 管 Micro 1.5 ml 透明无菌</td><td>VWR</td><td>89511-254</td><td>1.5 ml&amp;nbsp; 无热原 Eppendorf 管</td></tr><tr><td>BD 25 G × 1 英寸无菌针头</td><td>VWR</td><td>BD305125</td><td>25 G 针头</td></tr><tr><td>Slp Tip SRNG 1 ml，每包200个</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>1 ml 注射器吸头</td></tr><tr><td>1 ml 鲁尔锁注射器，Pk 100</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td>1 ml 注射器</td></tr><tr><td>VWR 组织镊 6</td><td>VWR</td><td>82027-446</td><td>镊子</td></tr><tr><td>Cyromold 中号 15 x 15 x 5 mm，100 个/包</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td>Cyromold</td></tr><tr><td>Cryo-oct 化合物 4 盎司</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>辛化合物</td></tr><tr><td>VWR 载玻片 25 x 75 mm，每包72片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>载玻片</td></tr><tr><td>VWR 盖玻片 #2 22 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48-382-128</td><td>盖玻片</td></tr><tr><td>VWR 载玻片盒 True North Fm Pu</td><td>VWR</td><td>89140-278</td><td>载玻片盒</td></tr><tr><td>Super HT PAP笔</td><td>VWR</td><td>89427-058</td><td>PAP笔</td></tr><tr><td>无RNase和DNase的水，2 L</td><td>VWR</td><td>101454-204</td><td>无核酸酶水</td></tr><tr><td>Tris缓冲液超纯级500 g</td><td>VWR</td><td>97061-796</td><td>Tris 缓冲液</td></tr><tr><td>氯化铵 ACS 级 2，5 千克</td><td>VWR</td><td>97062-048</td><td>氯化铵缓冲液</td></tr><tr><td>Falcon 组织培养皿 60 x 15 mm 聚苯乙烯材质</td><td>VWR</td><td>353002</td><td>组织培养皿</td></tr><tr><td>Clorox 杀菌漂白剂，常规型</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Clorox 漂白剂</td></tr><tr><td>不含钙的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） &amp;和镁（500 ml）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21-040-CV</td><td>PBS，1×</td></tr><tr><td>DMEM，1倍浓度&amp;nbsp; 含4.5 g/L葡萄糖 &amp;L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10-017-CV</td><td>用于BNL 1ME A.7R.1细胞的DMEM 1x培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35-010-CV</td><td>FBS</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>30-002-Cl</td><td>青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>Sorvall Biofuge pico</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75002411</td><td>13,000 rpm 离心机</td></tr></tbody></table>

从小鼠癌症模型中分离与扩增循环肿瘤细胞

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

癌症转移是导致癌症相关死亡的首要原因。近期研究表明，循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移过程中具有重要作用。事实上，CTCs的数量与肿瘤大小相关。本文详细描述了一种从同源小鼠肝细胞癌（HCC）模型中分离和扩增CTCs的方法，该方法可用于后续分析实体器官肿瘤转移中潜在的重要分子机制。该方法高效且可重复，是一种非侵入性技术，因此有望替代可能伴随并发症的人体组织侵入性活检。因此，本文所述方法能够从全血样本中分离和扩增CTCs，以便对其进行检测和表征。该技术未来有望被改进并应用于临床，例如用于诊断和个体化靶向治疗。

本文所述方法已证明可成功分离循环肿瘤细胞（CTCs）。在实验终点，小鼠被实施人道安乐死，过程包括二氧化碳窒息、心脏穿刺放血以及颈椎脱位。该操作的关键步骤示意图见图2。通过心脏穿刺获取的全血样本采用上述方案进行处理。随后，通过离心分离获得白膜层，并对其进行红细胞裂解。接着再次离心以收集白色沉淀，该沉淀用PBS洗涤后重悬于完全细胞培养基中，用于细胞培养扩增。可能出现的一个问题是所获得的沉淀颜色不够清晰。此问题可通过延长红细胞裂解缓冲液的孵育时间至10–15分钟，或重复裂解步骤来轻松解决。在图1中展示了来自三只不同小鼠的CTCs在培养中扩增的代表性图像，并与BNL 1ME A.7R.1细胞进行了对比。快速增殖能力和细胞形态有助于判断接种的细胞是否为CTCs。然而，仍需通过第5.1–5.2步中所述的PCR和免疫染色等验证技术来确认是否成功建立可存活的CTC细胞系。
<img alt="细胞显微镜图像，四幅图片，40倍放大；用于研究分析细胞形态。" ...

循环肿瘤细胞（CTCs）已被证实对肿瘤转移具有重要作用。本文介绍了一种从同基因型小鼠肝细胞癌（HCC）转移模型的全血中分离并扩增循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。

癌症转移是癌症相关死亡的首要原因。近期研究表明，循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症……

本实验的总体目标是从具有肝细胞癌转移的同系小鼠肿瘤模型的全血中分离并扩增循环肿瘤细胞。首先离心收集自小鼠的全血，分离出白膜层。接着，裂解白膜层中的红细胞，并将循环肿瘤细胞收集于沉淀中。随后对细胞进行洗涤，重悬于完全培养基中，并在细胞培养条件下进行传代培养。这些快速增殖的肿瘤细胞在多次传代后仍保持活性，可利用标准的分子诊断技术进行验证。采用本技术分离循环肿瘤细胞的意义在于，它提供了一个可重复的模型，该模型可进一步优化，有望应用于临床环境。与我共同演示该实验步骤的是来自我们实验室的本科学生 Michelle Nadu。首先开始采集。采集自肝细胞癌转移的 Ciea Kamau 肿瘤模型的全血，具体模型构建方法见另文所述。将收集的全血在室温下以 1,167 ×g 离心五分钟。分离成层后，小心移除上层的血浆层，并将其转移至另一个1.5毫升无ROGEN的离心管中，用于后续实验，例如游离核酸的检测。接着，将血沉棕黄层转移至另一个1.5毫升无ROGEN的离心管中，以进行红细胞裂解的准备。此步骤是必要的，可在分离循环肿瘤细胞之前去除血沉棕黄层中残留的红细胞。首先配制1升红细胞裂解缓冲液，其中氯化铵终浓度为155毫摩尔/升，Tris浓度为10毫摩尔/升。将溶液pH值调节至7.5。从储存的1升红细胞裂解缓冲液中取出2至4毫升等份使用。然后向含有采集的血沉棕黄层的试管中加入1 mL红细胞裂解缓冲液。通过反复倒置试管混匀管内液体。随后将试管置于室温下孵育5分钟。随后将混合物离心5分钟，离心条件为1,167 ×g。离心后将获得白色沉淀。小心缓慢地弃去红色上清液，将其加入10%次氯酸钠溶液中，注意不要扰动沉淀。弃去上清液后，用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤白色沉淀。再次离心收集细胞沉淀，并将细胞重悬于完全培养基中。将重悬的细胞接种至细胞培养皿中，在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育细胞。每两到三天更换一次细胞培养基。五到七天后，循环肿瘤细胞将附着于细胞培养皿并开始增殖。为验证肝细胞癌循环肿瘤细胞是否被正确分离。按照 Stu 描述并验证的方法，对小鼠 β 珠蛋白基因的特定片段进行 PCR 扩增。然后使用针对肝细胞特异性标志物的抗体对细胞进行免疫染色。采用标准技术对环磷酸腺苷反应元件结合蛋白 3 样 3（Cyclic AMP responsive element binding protein 3 like 3）进行检测，此处展示的图像分别来自两只不同小鼠的循环肿瘤细胞的代表性结果。源自肝细胞癌原位同系小鼠模型的培养。转移性肿瘤细胞贴附于培养皿并快速增殖。这些细胞可传代超过25代，并能耐受反复的冻融循环。通过观看本视频，您应能充分理解如何分离和扩增具有活性的环形肿瘤细胞，并从分子和功能层面对其进行表征。

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从小鼠癌症模型的循环肿瘤细胞的分离和繁殖

该视频介绍了将癌细胞进行盲肠内注射以建立具有高度均一性肿瘤的原位小鼠模型的技术。因此，这种原位小鼠模型能够真实模拟转移过程，为研究肿瘤生长和扩散过程中的表型变化提供了有价值的工具。...

盲肠内肿瘤细胞注射：一种用于建立原位结直肠癌小鼠模型的癌细胞递送技术

本视频介绍了一种从安乐死的结直肠肿瘤小鼠模型全血样本中分离循环肿瘤细胞的详细方案。分离得到的循环肿瘤细胞可进行培养，并用于后续预定的分析。...

从小鼠结直肠癌模型全血样本中分离循环肿瘤细胞：一种获取循环肿瘤细胞的方法

癌症的转移扩散是导致癌症相关死亡的主要原因。本文详细介绍了我们用于建立“类患者”原位同系小鼠模型系统的生存手术方法，该系统可用于研究实体器官肿瘤转移的机制。...

一种模拟患者的同系小鼠原位肝细胞癌转移模型

我们报道了一种从基因工程小鼠模型中分离和培养原代肿瘤特异性内皮细胞的可靠方法。...

分离与培养扩增肿瘤特异性内皮细胞

本论文详细描述了一种利用循环肿瘤细胞（CTCs）建立前列腺癌患者来源的异种移植模型（PDXs）的方法。通过循环肿瘤细胞建立PDX模型，为研究前列腺癌提供了一种替代性实验模型；前列腺癌是男性中最常被诊断出的肿瘤，也是男性因癌症死亡的常见原因。...

从循环肿瘤细胞建立前列腺癌患者来源的异种移植模型

我们描述了通过将肿瘤细胞或类器官注射到小鼠盲肠中建立原位结直肠肿瘤模型，并从此模型中后续分离循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。...

结直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离

需要一种动物模型来解析循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移过程中促进肺部定植的作用。在此，我们建立并成功实施了一种体内检测方法，专门用于验证CTC表面聚合纤连蛋白（polyFN）组装对肺部定植的必要性。...

肺组织中循环肿瘤细胞可视化肺定植检测方法的建立

本文介绍了一种整合性工作流程，用于鉴定循环肿瘤细胞（CTCs）的表型和分子特征。我们将活细胞免疫染色与单个及成簇CTCs的机器人显微操作相结合，并利用基于单细胞的技术进行后续分析，评估其定植转移的能力。...

循环肿瘤细胞的显微操作用于下游分子分析及转移潜能评估

本方案描述了一种可重复的小鼠横纹肌肉瘤原代细胞分离、肿瘤球形成与处理以及异体移植的方法，起始于肿瘤球培养物。...

从小鼠横纹肌肉瘤原代肿瘤细胞中分离肿瘤球并进行处理

培养循环肿瘤细胞（CTCs）可通过检测特定标志物表达、评估耐药性以及定植肝脏等能力，从而对癌症进行更深入的功能学表征。总体而言，CTCs培养有望成为一种有前景的临床工具，用于个体化医疗，以改善患者的治疗预后。...

循环肿瘤细胞系：基础与转化研究的创新工具

活体显微镜的发现向临床转化面临的主要挑战是其对组织的穿透深度较浅。本文介绍了一种小鼠背部窗口腔模型，该模型可实现活体显微镜与临床适用的成像方式（如CT、MRI）的共同配准，从而进行直接的空间关联分析，有望加速活体显微镜发现成果的临床转化。...

用于转化癌症研究中活体显微成像与磁共振成像联合应用的背侧皮肤折叠窗室肿瘤小鼠模型

学习从小鼠肝细胞癌转移模型的全血中分离和扩增循环肿瘤细胞的方法。该技术通过离心、红细胞裂解和培养，建立可重复的临床前研究模型，为癌症转移机制研究提供可靠工具。

从小鼠癌症模型中分离与扩增循环肿瘤细胞

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