从小鼠癌症模型的循环肿瘤细胞的分离和繁殖

该程序的总体目标是从肝细胞癌转移的同基因小鼠肿瘤模型的全血中分离和增殖循环肿瘤细胞。这是通过首先离心，从小鼠身上收集全血并分离血沉棕黄层来完成的。接下来，裂解血沉棕黄层中的红细胞，并将循环肿瘤细胞收集在颗粒中。

然后洗涤细胞，悬浮在完全培养基中，并在细胞培养物中增殖。快速生长的肿瘤细胞通过多次传代仍能保持活力，并且可以使用标准分子诊断技术进行验证。使用我们的技术分离盘旋肿瘤细胞的意义在于它提供了一个可重复的模型，可以针对临床环境中的潜在使用进行优化。

与我一起演示该程序的是 Michelle Nadu，我们实验室的本科生 To begin harvest。来自肝细胞癌转移的 Ciea Kamau 肿瘤模型的全血，如立式离心机的单独 J 中所述。收集的全血在 1， 167 倍 G 下在室温下保存 5 分钟。

分离成层后，小心地去除顶部血浆层，并将其转移到单独的 1.5 ml rogen free 试管中，用于进一步的实验，例如检测游离核酸。接下来，将 Buffy 代码层转移到单独的 1.5 ml ROGEN 游离管中，为红细胞裂解做准备。这对于在分离循环肿瘤细胞之前去除 Buffy 外壳层中残留的红细胞是必要的。

首先制备 1 升红细胞裂解缓冲液溶液，终浓度为 155 毫摩尔氯化铵和 10 毫摩尔 triss。将溶液的 pH 值调节至 7.5。从原液中取约 2 至 4 毫升等分试样，即 1 升红细胞裂解缓冲液混合物。

然后将 1 毫升红细胞裂解缓冲液添加到含有收集的血沉棕黄层的试管中。通过多次颠倒试管来混合试管的内容物。然后在工作台上在室温下孵育试管 5 分钟。

接下来，将混合内容物离心 5 分钟。离心后 1， 167 倍 G 时，将获得白色沉淀。将微红色的上浆缓慢小心地倒入 10% 漂白剂中，不要破坏沉淀。

弃去上清液后，用 1 毫升 PBS 洗涤白色沉淀。然后再次沉淀细胞，并将其重悬于完全培养基中。将重悬的细胞放入细胞培养皿中，并在 37 摄氏度的加湿培养箱中用空气和 5% 二氧化碳孵育细胞。

每 2 到 3 天更换一次细胞培养基。5 到 7 天后，循环肿瘤细胞将粘附在细胞培养皿上并开始增殖。为了验证肝细胞癌循环肿瘤细胞是否被正确分离。

对小鼠 β 珠蛋白基因的特定片段进行 PCR，如 Stu 所述和验证。然后用对肝细胞特异性标志物具有特异性的抗体对细胞进行免疫染色。使用标准技术的 Cyclic A MP 反应元件结合蛋白 3 如 3，此处显示的是来自两只独立小鼠的循环肿瘤细胞的代表性图像。

来自肝细胞癌的原位同基因小鼠模型的培养物。转移性肿瘤细胞粘附在培养皿上并迅速增殖。它们可以扩展到 25 代以上，并经得起重复冻融循环。

因此，在观看此视频后，您应该对如何分离和增殖有活力的环状肿瘤细胞，以及从分子和功能上表征它们有很好的了解。