原子力显微镜成像和支持的脂质双层力谱
July 22nd, 2015
我们描述了一种制备支撑脂质双层的方案，并使用原子力显微镜和力谱法对其进行表征。
以下实验的总体目标是使用原子力显微镜对相分离膜的物理特性进行成像和探测。这是通过首先将二醇、磷脂酰胆碱、fgo、髓鞘和胆固醇以 2 比 2 比 1 的比例混合以形成分离脂质混合物的相来实现的。接下来，通过使用原子力显微镜将脂质体悬浮液沉积到 MICA 表面来制备支撑的脂质双层。
然后扫描双层的表面，生成地形图像，可以测量高度等结构特征。接下来，对双层的特定区域进行力谱分析，以探测双层的物理特性，最明显的是穿透力和膜厚度。最终，结果显示了基于 FM 图像和力曲线的不同脂质相之间的特性差异。
与荧光显微镜等现有方法相比，该技术的主要优点是提高了 FM 可以探测样品的分辨率和附加特性。这种方法可以帮助回答生物物理学领域的关键问题，例如生物膜的结构以及嵌入在这些膜上的蛋白质。此外，我们还可以查看膜的物理特性，并监测膜活性剂的成分变化或添加如何改变这些特性。
一般来说，由于样本的脆弱性，刚接触这种方法的人会很挣扎。这对样品制备、悬臂的处理选择以及 FM 成像和光谱条件有影响首先将 DOPC、spino、髓鞘和胆固醇溶解到所需浓度的氯仿中。然后将 18.38 微升 DOPC、17.1 微升 sing 髓鞘和 11.3 微升胆固醇混合，分别制成含有 1 毫克总脂质和摩尔比为 2 比 2 比 1 的溶液。
通过涡旋混合溶液，使用惰性气体（如氮气）干燥混合物，然后在真空下进一步干燥至少 1 小时。接下来，将干燥的脂质溶解在 100 微升 PBS 中，浓度为 10 毫克/毫升。剧烈涡旋至混合物约 1 分钟。
获得含有多层囊泡的混浊悬浮液。确保没有脂质膜附着在样品瓶的侧面。取 10 μL 多层脂质悬浮液，并加入 150 μL 支持的脂质双层缓冲液。
然后混合溶液，将其转移到一个 2 毫升带盖的小玻璃瓶中，并用对位膜超声处理液密封。将混合物在室温下放入浴中超声处理 10 分钟。在此期间，溶液应变得透明，并产生直径约为 50 纳米的小 uni 或囊泡。
用水清洗玻璃盖片，然后用乙醇清洗，然后让它们风干。接下来，取出弥迦圆盘，用胶带撕下外层。使用一滴透明光学透明胶水将 MICA 光盘连接到盖玻片上。
然后使用真空润滑脂将塑料圆筒连接到 MICA 上，并确保没有泄漏。将整个脂质体溶液直接吸到云母上，并额外添加 140 微升支持的脂质双层缓冲液，以达到 300 微升的体积。接下来，加入 0.9 微升 1 摩尔氯化钙溶液，达到 3 毫摩尔钙的最终浓度，将样品在 37 摄氏度下孵育 2 分钟，然后在 65 摄氏度下孵育至少 10 分钟在此步骤中，还将支撑的脂质双层缓冲液预热至 65 摄氏度。
如有必要，添加缓冲液以确保样品不会变干。用盖玻片覆盖样品室也可以保持样品水合。然后用预热的脂质通过层缓冲液轻轻冲洗样品 10 至 15 次，以去除钙和未融合的囊泡。
在洗涤步骤中要格外小心，以防止双层在洗涤步骤后变干。将支撑的双层冷却至室温。在原子力显微镜上进行测量之前，设置原子力显微镜或 FM 以对溶液中的脂质双层进行成像。
根据制造商的规格使用接触模式，向样品中添加缓冲液，使其在整个实验过程中保持浸入缓冲液中。将样品安装在 A FM 载物台上，并确保所有隔振模块都已打开。等待至少 15 分钟，让系统达到平衡并减少热漂移。
接下来，使用柔软的 FM 悬臂尖端在接触模式下接近样品，直到接触。由于双层非常脆弱，因此在接触模式成像期间，请尽量减少 A FM 尖端的设定点，以将力保持在最小，并在保持与样品接触的同时校正热漂移。成像完成后，通过将每条扫描线拟合到多项式水平函数来处理图像。
对失去与膜接触的扫描件执行线去除。使用 A FM 制造公司的专有软件，按照制造商的协议校准悬臂，以确定将电信号正确转换为力测量。对双层区域进行成像后，在双层中选择一个 5 微米 x 5 微米的区域进行力谱分析。
将 AFM 设置为在该区域的 16 x 16 网格中采用力曲线，从而每个区域产生 256 条力曲线。然后将 Z piso 位移设置为 400 纳米。这决定了 z 压电陶瓷的最大移动范围，并确保悬臂在两次测量之间完全从样品中缩回。
接下来，将接近速度设置为 800 纳米/秒，将缩回速度设置为 200 纳米/秒。此外，在本例中，请为每条力曲线设置最大目标力，即 12 纳牛顿。设置完所有参数后，按下 A FM 软件的运行按钮获取力曲线。
为每个条件获取至少 500 条力曲线以确保良好的统计数据，绘制值的直方图，然后将直方图拟合到高斯分布，以获得分布的峰值和宽度。由于使用这项研究的脂质组成，形成了两个主要的膜区域。有一个由 fing、髓鞘和胆固醇组成的液体有序区，以及一个主要由 DOPC 组成的液体无序区。
A FM 成像的高度剖面可以通过查看高度剖面来提供有关膜结构的重要信息。双层厚度可以通过利用膜上存在的缺陷来测量。高度贴图还可用于测量有序相位和无序相位之间的高度差。
从力谱模式得出的力曲线用于通过对力曲线峰值处的力值进行维增来测量穿透力，如下所示。此外，可以通过减去从力曲线峰值到距离值的距离值来得出膜厚度。当力曲线再次开始上升时，在尝试此过程时，重要的是要记住保持 B 分层解决方案并不断监测 FM 组件，以纠正热漂移和 D 累积对尖端的影响遵循此程序。
可以执行共聚焦荧光显微镜等其他方法来回答其他问题，例如膜动力学。观看此视频后，您应该对如何准备 Supported by layers 以及使用 FM 对这些双层的物理特性进行成像和研究有一个很好的了解。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文描述了一种用于制备支持的脂质双层膜并使用原子力显微镜（AFM）和力谱学对其进行表征的协议。该研究主要集中在成像和探测相分离膜的物理特性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 膜生物学
背景
- 支持的脂质双层膜对于研究膜性质至关重要。
- 原子力显微镜允许高分辨率成像膜。
- 力谱学提供了对脂质双层膜机械性质的洞察。
- 膜中的相分离对于理解细胞过程至关重要。
研究目的
- 为分析准备支持的脂质双层膜。
- 表征这些双层膜的物理特性。
- 调查各种脂质相之间的性质差异。
所用方法
- 以特定比例混合脂质（dilio、磷脂酰胆碱、fgo、髓磷脂、胆固醇）。
- 将脂质体悬浮液沉积到MICA表面。
- 使用原子力显微镜扫描双层膜表面。
- 进行力谱学测量以测量突破力和膜厚度。
主要结果
- 地形图揭示了双层膜的结构特征。
- 力曲线指示了脂质相的物理性质的差异。
- 结果表明AFM在研究膜特性方面的有效性。
- 发现有助于理解膜中的相分离。
结论
- 该协议有效地准备和表征了支持的脂质双层膜。
- AFM和力谱学是膜研究的有价值工具。
- 理解脂质相行为对生物应用很重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy (AFM) imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers provide high-resolution, quantitative insights into membrane structure and mechanics, directly informing early-stage target validation and mechanistic de-risking. These capabilities enable biopharma teams to interrogate membrane-associated targets, assess the impact of lipid composition, and support predictive confidence in membrane protein studies. Integrating AFM-derived data at the discovery stage enhances portfolio decision-making by reducing ambiguity in membrane-targeted therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of membrane thickness and breakthrough force for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing ordered and disordered membrane phases.
- Provides quantitative data to clarify the impact of lipid composition on membrane properties.
- Facilitates hypothesis testing for membrane protein interactions and stability.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, quantitative outputs for membrane mechanical properties across conditions.
- Establishes validated model systems for downstream compound screening targeting membrane components.
- Enables standardization of assay conditions for cross-study comparability.
- Supports scalability by generating statistically robust datasets from force spectroscopy grids.
Translational & Preclinical Research
- Aligns membrane biophysical properties with disease-relevant models when studying membrane-active agents.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation for membrane-targeted modalities.
- Enables risk-adjusted advancement by quantifying the effects of candidate compounds on membrane integrity.
- Supports translational biomarker development by linking mechanical properties to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
AFM imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers fit within the early discovery to lead identification continuum, providing foundational data for membrane-targeted programs.
- Discovery Biology: Quantitative force and thickness measurements support hypothesis testing and mechanistic clarification.
- Screening: High-resolution imaging and force mapping enable assay readiness and reproducibility.
- Analytics: Statistical analysis of force curves and height profiles facilitates condition comparison and decision-making.
- Translational Research: Mechanical property data inform preclinical model selection and biomarker alignment when relevant.
- Enterprise Reuse: The AFM workflow is adaptable for diverse membrane systems and reusable across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in membrane-targeted research.
- Operational Value: Standardizes membrane property measurements and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of membrane-focused assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and membrane biophysics.
- Demands access to high-resolution AFM instrumentation and analytical software.
- Necessitates rigorous sample preparation and handling protocols to maintain bilayer integrity.
- Benefits from cross-team standardization of imaging and force spectroscopy parameters.
- Sample fragility and thermal drift are practical limitations that must be managed during experiments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:01
Preparation of Multilamellar and Unilamellar Vesicle Suspensions
3:42
Deposition of Unilamellar Vesicles on Solid Support
5:34
Atomic Force Microscopy Imaging
6:52
Force Spectroscopy
8:22
Results: Supported Lipid Bilayer Analysis Using AFM and Force Spectroscopy
9:28
Conclusion
