原子力显微镜成像与支持性脂双层的力谱分析

以下实验的总体目标是利用原子力显微镜对发生相分离的膜进行成像，并探测其物理特性。首先将二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、磷脂酰胆碱（FGO）、髓磷脂和胆固醇按2:2:1的比例混合，形成可发生相分离的脂质混合物。随后，通过原子力显微镜将脂质体悬浮液滴加到云母表面，制备支撑脂双层。

随后扫描双层膜表面，生成一幅地形图像，其中可测量高度等结构特征。接下来，在双层膜的特定区域进行力谱分析，以探测双层膜的物理性质，尤其是击穿力和膜厚度。最终结果表明，基于荧光显微图像和力曲线，不同脂质相之间的性质存在差异。

与荧光显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于分辨率的提升，以及原子力显微镜（FM）能够探测样品的额外特性。该方法有助于回答生物物理学领域的一些关键问题，例如生物膜及其嵌入蛋白的结构。此外，我们还可以研究膜的物理性质，并监测膜成分的变化或膜活性物质的添加如何影响这些性质。

通常，初次接触该方法的研究人员会因样品的脆弱性而遇到困难。这对方剂制备、样品处理、悬臂梁的选择以及调频成像和光谱条件均有影响。首先，将DOPC、spino、髓鞘和胆固醇按所需浓度溶解于氯仿中。然后取18.38 µL的DOPC、17.1 µL的sing髓鞘和11.3 µL的胆固醇混合，制备成总脂质为1毫克、摩尔比分别为2:2:1的溶液。

通过涡旋混合溶液，使用氮气等惰性气体吹干混合物，然后在真空条件下进一步干燥至少一小时。接着，将干燥的脂质溶解于100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中，使其浓度达到10 mg/mL。剧烈涡旋混合约一分钟。

获得含有多层囊泡的浑浊悬液。确保没有脂质薄膜残留在小瓶壁上。取10 µL多层脂质悬液，加入150 µL支撑脂双层缓冲液。

然后混合溶液，并转移至一个小型2毫升带盖玻璃小瓶中，用封口膜密封后进行超声处理。在室温下将混合液置于水浴超声仪中处理10分钟。在此期间，溶液应逐渐变澄清，并形成直径约为50纳米的小型单层或囊泡结构。

用水清洗玻璃盖玻片，随后用乙醇清洗，然后使其自然风干。接着，取 Micah 圆片，使用胶带剥离其外层。用一滴透明光学胶将 MICA 圆片粘附在盖玻片上。

然后使用真空脂将塑料圆筒固定在云母片（MICA）上，并确保无泄漏。将全部脂质体溶液直接移取到云母片上，并加入额外的140 µL支撑脂双层缓冲液，使总体积达到300 µL。接着，加入0.9 µL的1 M氯化钙溶液，使钙离子终浓度为3 mM，在37 °C孵育样品2分钟，随后在65 °C孵育至少10分钟。在此步骤中，同时将支撑脂双层缓冲液预热至65 °C。

必要时添加缓冲液，以确保样品不会干燥。用盖玻片覆盖样品室也可保持样品的水合状态。随后用预热的支持性脂质双层缓冲液轻轻冲洗样品10至15次，以去除钙离子和未融合的囊泡。

在洗涤步骤中需格外小心，确保双层膜在洗涤后始终保持湿润，避免其干燥。将支撑双层膜冷却至室温。在原子力显微镜测量前，设置原子力显微镜或调频（FM）仪器，以在溶液中对脂质双层膜进行成像。

根据制造商的说明，使用接触模式，在整个实验过程中向样品中加入缓冲液，以保持样品完全浸没在缓冲液中。将样品固定在原子力显微镜（AFM）载物台上，并确保所有振动隔离模块均已开启。等待至少15分钟，使系统达到平衡并减少热漂移。

接下来，使用柔软的调频原子力显微镜（FM-AFM）悬臂针尖以接触模式接近样品，直至与样品接触。由于双分子层极为脆弱，在接触模式成像过程中应尽量降低AFM针尖的设定点，以使作用力保持最低，同时在维持与样品接触的前提下校正热漂移。成像完成后，通过将每条扫描线拟合至多项式平整函数来处理图像。

对与膜失去接触的扫描进行线移除。使用原子力显微镜生产公司的专有软件，按照制造商的协议校准悬臂，以确定将电信号正确转换为力测量值的方法。在对双层膜区域成像后，选择双层膜中一个5微米×5微米的区域进行力谱分析。

设置原子力显微镜（AFM），使其在该区域的 16×16 网格上采集力曲线，每个区域共获得 256 条力曲线。然后将 Z 压电扫描器的位移设为 400 纳米。该参数决定了 Z 压电扫描器的最大移动范围，并确保在每次测量间隔期间悬臂完全从样品表面撤回。

接下来，将接近速度设置为800纳米每秒，回撤速度设置为200纳米每秒。同时，将本实验中每条力曲线的最大目标力设置为12纳牛。完成所有参数设置后，点击原子力显微镜（AFM）软件的运行按钮以采集力曲线。

每种条件下至少采集 500 条力曲线，以确保良好的统计性，绘制数值的直方图，然后将直方图拟合为高斯分布，以获得分布的峰值和宽度。由于本研究中使用的脂质组成，会形成两种主要的膜区域：一种是有序液相区，由 fing、髓鞘和胆固醇组成；另一种是无序液相区，主要由 DOPC 组成。

通过观察原子力显微镜（AFM）成像的高度分布图，可以获取关于膜结构的重要信息。利用膜中缺陷的存在，可通过高度图测量双分子层的厚度。高度图还可用于测量有序相与无序相之间的高度差异。

通过力谱模式获得的力曲线可用于测量穿透力，方法是读取力曲线峰值处的力值，如图所示。此外，膜厚度可通过从力曲线峰值对应的距离值减去力曲线开始再次上升时的距离值得到。在执行此操作过程中，重要的是要持续保持B层溶液稳定，并持续监测FM组件，以校正热漂移和尖端D积累所带来的影响。

还可以采用其他方法，例如共聚焦荧光显微镜，以回答诸如膜动力学等方面的进一步问题。观看本视频后，您应当能够充分理解如何制备支撑脂双层，并利用荧光显微镜对这些双层膜的物理性质进行成像与研究。