实施 体外 药物耐药性检测：充分挖掘揭示临床相关耐药机制的潜力

本实验的总体目标是促进临床相关单核苷酸变异体的快速临床前发现，这些变异体可能在功能上驱动对各类治疗药物的耐药性。该方法有助于回答肿瘤学领域中的关键问题，例如哪些基因突变可能导致临床上对治疗产生功能性耐药，从而最终指导优化治疗方案以及为耐药患者制定替代性的临床管理策略。该技术的主要优势在于，我们通过促进自发性突变的发生，并在耐药克隆中应用无偏倚的筛选技术，因此所发现的这些变异体更有可能确实在临床上驱动靶向治疗后的复发。

为展示该实验步骤，我实验室一位非常有才华的研究人员将进行操作，以评估细胞系的 GI 50。根据此处所示图谱，将细胞以 100 µL 细胞培养基接种于不透明透明底的 96 孔板中，制备检测用培养板。

以类似方式制备对照板，将细胞加入蓝色孔中，仅将培养基加入白色孔中。将板在37摄氏度下孵育过夜后，将发光细胞活力检测试剂平衡至室温，并通过倒置轻轻混匀。为获得均一溶液，向对照板的各孔中加入80 µL试剂，并振荡内容物30分钟。

为了诱导细胞裂解。使用曝光时间为0.1至1.0秒、检测波长为560纳米的发光仪记录发光信号。接下来，将待测化合物加入检测板中，用DMSO对化合物进行一系列1:4稀释，起始浓度为2000 µM，共进行10个稀释梯度。

然后将梯度稀释的化合物加入培养基中，配制成终浓度为10倍的化合物-培养基混合液。将化合物板在负20摄氏度保存，用于第三天的实验。接着，将10微升稀释后的化合物以三复孔方式加入细胞中，使最高剂量为10微摩尔。

将培养板在 37 摄氏度下孵育三天。第三天时，使用三天前制备的化合物培养板配制 400 微升的一倍浓度化合物培养基混合液。将检测培养板倒置以去除培养基，并在高压灭菌纸巾上轻拍 2 至 3 次使其干燥。

向蓝色阴影孔中加入一种 x 化合物，并向周边孔中加入 100 微升培养基以防止蒸发。在第六天，通过如视频前面所示的方法进行发光检测，评估活细胞的相对数量。然后使用 PRISM 等软件计算 GI 50 值，并利用计算得到的 GI 50 值设置细胞进行药物抗性实验。

若使用细胞抑制剂，将细胞以30%至40%的汇合度接种于150毫米方形培养皿中。若使用毒性试剂，则将细胞以70%至80%的汇合度接种。根据文本方案确定初始化合物浓度后，用待测化合物处理细胞，适用于在六天存活率检测中引起细胞死亡的高毒性化合物。

从 GI 50 开始，每两到三周逐步增加药物浓度，直至观察到明显的耐药性。为分离单细胞克隆，使用40倍放大倍数的相差显微镜观察培养皿，识别培养皿底部存活的细胞簇。使用记号笔标记大小适中且与其他克隆分离良好的细胞集落，以便用P200移液器挑选克隆。

从培养皿中移除生长培养基，用一份 XPBS 冲洗以去除任何漂浮的细胞。用移液枪头轻轻挑起克隆，并转移至含有 50 微升 0.25% 胰蛋白酶的 48 孔板孔中，37 摄氏度孵育 1 到 2 分钟。随后加入 200 微升新鲜培养基，其中化合物浓度为原来的一半，以促进细胞的最佳恢复。

使用3毫米克隆环分离克隆时，先将克隆环放入含有5毫升0.25%胰蛋白酶EDTA的10厘米组织培养皿中，作用2分钟。接着，吸去含有抗性克隆的培养皿中的培养基，将经胰蛋白酶浸润的克隆环覆盖在克隆上。根据克隆从培养皿上脱落的难易程度，在37°C下孵育1至2分钟。

然后使用无菌镊子夹取克隆环，转移至含有 200 µL 新鲜培养基的 48 孔板中，并将化合物浓度轻轻吹打混匀，以使细胞从克隆环上脱落，于 37°C 培养过夜。次日，移除克隆环，继续培养细胞，随后评估药物抗性。根据文中所述方案，如图所示，HCT116 细胞经长期暴露于细胞毒性化合物一后，自发出现了耐药性克隆，这些克隆在药物处理期间仍持续生长。

使用移液器手动挑取克隆。在本图中，抗性克隆1至3均表现出对化合物1及其结构类似物化合物2显著的抗性，而所有克隆对无关的细胞毒性化合物Velcade均表现出敏感性。在确认表型抗性后，提取基因组DNA并提交进行全外显子组测序分析。

对于反复出现且可能具有功能影响的结构变异，需通过独立的测序工具（如Sanger测序）进行验证。此处展示的一个实例携带一个杂合错义突变，随后对该突变cDNA进行改造并在亲本细胞系中表达。而野生型cDNA的过表达则未能赋予药物抗性。

突变的CD NA显著赋予了对化合物一号的表型耐药性，证实了该结构变异在驱动耐药性中的功能作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过诱导自发性耐药生长，筛选出癌细胞在产生耐药性后负责该特性的相关基因。该技术为肿瘤学领域的研究人员提供了一种无偏倚的方法，用于在癌细胞系和动物模型中探索药物耐药机制。