Name: 异位骨化直接鼠标创伤/烧伤模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 了解异位骨化直接小鼠创伤/烧伤模型，通过跟腱切断术和30%体表面积部分厚度烧伤诱导异位骨形成。该方法无需外源性物质即可研究创伤后骨化机制，为开发治疗策略提供可靠平台。

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感谢Amanda Fair、CMI以及Kathy Sweet和密歇根大学ORL在µCT成像与分析方面的协助。资助：BL获得1K08GM109105-01和整形外科基金会国家奖助金资助。

伦理声明：所有动物实验均严格遵循美国国家研究委员会实验动物管理和使用指南（第八版）（ILAR，2011）中规定的要求进行，并已获得密歇根大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（批准编号：PRO0001553）。
1. 小鼠手术操作
注意：使用 8-10 周龄的 C57BL/6 小鼠。也可使用其他年龄、遗传背景和品系的小鼠来测试不同条件或基因组成。在进行切断术操作时，应佩戴口罩、头帽，并使用无菌手术衣、手套和器械，以维持无菌环境。手术区域应使用聚维酮碘进行无菌准备，并覆盖无菌手术单。为避免低体温，使用兽用加热垫，并在给药前将复苏溶液预热至 37 °C。
<ol>
	<li>使用2.5%吸入式异氟烷对小鼠进行麻醉。采用鼻罩固定，以便于暴露背部及后肢。调节异氟烷给药速率，以维持适当的呼吸频率和黏膜色泽，并通过检测肌张力、足趾夹捏反应和角膜反射来确认麻醉深度。在小鼠眼部涂抹温和的眼科软膏，以防止术中角膜干燥损伤。在手术区域下方使用兽用加热垫或循环温水装置，以维持小鼠体温。</li>
	<li>手术前立即皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡以进行镇痛。</li>
	<li>使用电推剪将左侧后肢从足跟至膝盖处的手术区域毛发仔细剃净。</li>
	<li>从脊柱开始，向左侧背中线方向剃除小鼠背部的毛发，清理出至少2 cm × 3 cm的区域，以容纳烧伤损伤。</li>
	<li>使用聚维酮碘对从后肢足部至膝盖的手术区域进行3次交替擦洗。</li>
	<li>沿左侧跟腱内侧做一纵行切口。延长切口至能够清晰显露跟腱，长度约为0.5 cm。</li>
	<li>在跟腱中点处使用锐利的组织剪进行锐性分离，完成跟腱切断术。将组织剪的一个刀片插入跟腱下方的组织平面，并沿该平面解剖，直至刀片到达跟腱中点。闭合剪刀刀片，以锐性切割方式完全切断跟腱。 
	注意：确保包含所有后侧肌腱，包括腓肠肌、比目鱼肌和跖肌肌腱。</li>
	<li>用无菌纱布按压以达到止血效果（出血应极少），并用5-0薇乔缝线缝合皮肤切口。</li>
	<li>使用一个重35 g、尺寸约为2 cm × 2 cm × 3 cm的铝块，在水浴中加热至60 °C后，将其置于小鼠剃毛的背部，持续17秒，以制备背部部分厚度烧伤模型。 
	注意：通过将烧伤模块置于麻醉后的小鼠体表，使模块的整个底面与小鼠接触，从而达到所需的烧伤深度，但避免对模块施加额外压力。 即， 让重力成为固定该金属块的唯一作用力。在金属块一侧附有一个薄塑料手柄，便于操作、稳定以及从热水浴中取出。该方法可在8至10周龄的C57BL/6小鼠身上造成约30%体表面积的烧伤。相较于其他方法（火焰烧伤或烫伤），该接触性烧伤模型因在创面内烧伤深度均匀且动物间可重复性高而被选用。</li>
	<li>用纱布擦干烧伤部位，并贴上Tegaderm敷料。</li>
	<li>给予加温的复苏液体：乳酸林格液，1 ml 腹腔注射，0.5 ml 皮下注射。该次复苏处理足以支持动物从烧伤损伤及跟腱切断术中恢复。 
	注意：不要将麻醉后的小鼠放回与其他小鼠共用的饲养笼中，应将其单独饲养在清洁的笼具中并进行监测，直至小鼠完全恢复。通常恢复时间为1-6小时。烧伤部位一般在2-4周内愈合，若饲养环境清洁，极少出现伤口感染。</li>
	<li>术后每12小时皮下注射一次0.1 mg/kg的布托啡诺，持续3天。在适当的时间间隔内，通过连续的µCT扫描监测异位骨（HO）的生长情况。术后约3周，µCT可首次明确显示异位骨的形成。 
	注意：异位骨化（HO）的大部分发育在术后9周内已完成。与在15周时进行一次终点µCT扫描相比，每两周重复进行µCT扫描持续15周，并未观察到HO体积或位置的差异。实验结束时，使用CO₂处死所有小鼠2 根据机构指南进行吸入麻醉，并在10分钟后通过颈椎脱位确认死亡。</li>
</ol>
2. µCT 采集与分析
<ol>
	<li>将麻醉后的小鼠以俯卧位固定在扫描仪床面上，用胶带将后肢牢固地固定在床面上，以防止呼吸运动伪影。在小鼠下方放置含有空气、水和羟基磷灰石的模体，用于图像校准。</li>
	<li>打开骨分析软件，定义一个感兴趣区域（ROI），范围包括从近端髋关节至远端后足掌尖的双侧后肢。使用以下参数获取图像：80 kV、500 µA、曝光时间 1,300 msec，体素大小为 48 µm。14,15</li>
	<li>通过在三个模体腔室内分别绘制 ROI，并将各自的平均密度输入软件中相应字段，将图像校准至亨氏单位（HU）。</li>
	<li>使用软件中的“抓取”工具重新调整图像方向，使左侧后肢胫骨沿 Z 轴平行排列，以便获得最清晰的解剖视图，用于界定原位皮质骨结构及异位骨化（HO）。</li>
	<li>从膝关节开始，沿图像切片向远端滚动，直至发现异位骨化（HO）。使用手动样条工具，在每第 5个切片上对异位骨周围绘制 ROI，持续向远端延伸至足掌或完全越过 HO 区域。使用外推工具将各 ROI 延伸并拼接成一个包含全部 HO 的单一 ROI。</li>
	<li>创建三维 ROI 并选择分析菜单。通过设定最能显示骨窗的上下限阈值来计算骨体积。所有扫描均使用相同的固定阈值。</li>
</ol>

<ol><li>Leblanc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-9-induced+muscle+heterotopic+ossification+requires+changes+to+the+skeletal+muscle+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment.</a> J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).</li>
<li>Shore, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoinductive+signals+and+heterotopic+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Osteoinductive signals and heterotopic ossification.</a> J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).</li>
<li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li>
<li>Potter, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification+following+combat-related+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification following combat-related trauma.</a> J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).</li>
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<li>Yu, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+type+I+receptor+inhibition+reduces+heterotopic+%5Bcorrected%5D+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification.</a> Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).</li>
<li>Culbert, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alk2+regulates+early+chondrogenic+fate+in+fibrodysplasia+ossificans+progressiva+heterotopic+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification.</a> Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).</li>
<li>Dinther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK2+R206H+mutation+linked+to+fibrodysplasia+ossificans+progressiva+confers+constitutive+activity+to+the+BMP+type+I+receptor+and+sensitizes+mesenchymal+cells+to+BMP-induced+osteoblast+differentiation+and+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation.</a> J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).</li>
<li>Peterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+injury+enhances+bone+formation+in+heterotopic+ossification+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model.</a> Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).</li>
<li>Scott, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+review+of+models+of+ectopic+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Brief review of models of ectopic bone formation.</a> Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).</li>
<li>Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification+after+extremity+blast+amputation+in+a+Sprague-Dawley+rat+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model.</a> J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).</li>
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<li>Peterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+of+burn+induced+heterotopic+ossification+using+transcutaneous+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy.</a> Bone. 54 (1), 28-34 (2013).</li>
<li>Perosky, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+of+heterotopic+ossification+using+near-infrared+optical+imaging+reveals+dynamic+turnover+and+progression+of+mineralization+following+Achilles+tenotomy+and+burn+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury.</a> J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).</li>
<li>Peterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Aging+on+Osteogenic+Response+and+Heterotopic+Ossification+Following+Burn+Injury+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li>
<li>Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast+injuries+and+heterotopic+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+and+Joint+Research%22%5BJournal%5D)">Blast injuries and heterotopic ossification.</a> Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).</li>
<li>Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification+revisited%3A+a+21-year+surgical+experience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Burn+Care+Res%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience.</a> J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).</li>
<li>Ring, D., Jupiter, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operative+release+of+ankylosis+of+the+elbow+due+to+heterotopic+ossification.+Surgical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique.</a> J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).</li>
<li>Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopic+analysis+of+combat-related+heterotopic+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification.</a> Bone. 57 (2), 335-342 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

异位骨化是创伤、烧伤及侵入性肌肉骨骼手术患者面临的主要功能障碍。在现代战争中，遭受简易爆炸装置（IED）等机制造成严重爆炸伤的士兵属于最高风险人群。18 随着防护装甲的改进以及前线医疗单位的部署，严重肢体损伤患者的存活率显著提高。然而，在肢体损伤初步稳定和修复后，这些患者发生异位骨化的风险极高。18 尽管异位骨化发病率较高且带来沉重的医疗负担，但目前对其发生机制的细节仍知之甚少。特别是关于参与其中的特异性受体与信号通路，以及负责异位骨化的细胞谱系，仍是当前研究的重要方向。近期研究报道提示，异位骨化在某些方面与进行性骨化性纤维发育不良（FOP）及其他先天性异位骨化形式存在相似性。8,14,17 因此，建立一种可稳定模拟创伤后内源性异位骨化发生的动物模型，是推进该领域研究的关键工具。
尤其值得关注的是开发新型诊断方法，以便在异位骨化（HO）形成的早期阶段、即预防性治疗尚可行时，就能检测到其发生位置。目前的治疗方法依赖于手术切除和放射治疗，但这些方法伴随显著的合并症以及较高的复发率。5,19,20 这...

异位骨化（HO）是指骨潜能细胞异常诱导，在骨骼系统以外形成软骨内骨的异位成骨过程。尽管目前对异位骨化形成通路的具体机制仍知之甚少，但公认的理论模型包括三个关键因素：炎症性诱发事件、允许性微环境，以及具有成骨能力的间充质干细胞。1-3 异位骨化是一种常见的并发症，在超过60%的重大烧伤病例、65%的战伤相关损伤病例以及10%的侵入性骨科手术病例中出现。4,5 然而，异位骨化的发生位置往往难以预测，因其既可出现在局部损伤部位，也可出现在原本无损伤的远端区域。这种位置上的变异性使得难以采取局部靶向的预防性干预措施以阻止反应性骨组织的形成。此外，还存在一些先天性异位骨化类型，例如进行性骨化性纤维发育不良（FOP），此类患者在轻微创伤或炎症刺激后极易发生显著的异位骨化。利用转基因小鼠构建的强有力动物模型成功再现了该表型，并揭示了可能在创伤诱发的异位骨化中同样重要的分子通路。6-9 针对非先天性异位骨化的转化医学研究，已采用了多种实验模型，从单纯损伤模型到植入外源性成骨诱导材料和/或细胞的复合模型均有涉及。10-13
在我们之前的研究中，我们验证了一种在小鼠体内形成异位骨化（HO）的简单且可靠的模型，该模型无需给予任何外源性物质。14-17 该模型通过创造两个关键条件来启动HO的形成：局部创伤和全身性炎症。这通过跟腱切断术（局部创伤）联合远端烧伤损伤（全身性炎症）来实现。小鼠同时接受这两种处理后，可形成大量HO，并可通过组织学、影像学和分子方法进行分析。有趣的是，同时发生的烧伤损伤显著增加了HO的形成量，并加速了其发育进程。14-16 HO在跟骨周围、踝关节以及接受跟腱切断术肢体的胫骨/腓骨等可预测部位形成。HO在已知部位的可靠形成，使得研究人员能够集中分析异位骨化早期阶段的分子和组织学特征。14,17 至今，所有接受跟腱切断术并同时遭受烧伤损伤的小鼠（超过50只）均100%出现了HO。此外，还进行了纵向二维和三维成像以及光谱分析，以研究HO的生长模式及其生化组成。15,16

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>664</td><td>8-10 周龄</td></tr><tr><td>异氟烷 &amp;ndash; Fluriso</td><td>VET one，爱达荷州博伊西</td><td>V1 501017</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺 &amp;ndash; Buprenex</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>0.3 mg/ml 溶液</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>欧文斯和迈诺尔，弗吉尼亚州梅卡尼克维尔</td><td>2047PVP202</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Vicryl 缝合线</td><td>Ethicon，萨默维尔，新泽西州</td><td>J493</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm 薄膜，6 cm × 7 cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td>切成两半以充分覆盖烧伤部位</td></tr><tr><td>&amp;micro;CT - GE eXplore Locus SP</td><td>加拿大安大略省伦敦市通用电气医疗集团临床前成像部门</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microview 2.2 高级骨分析应用</td><td>加拿大安大略省伦敦市通用电气医疗集团临床前成像部门</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

直接小鼠创伤/烧伤型异位骨化模型

Direct Mouse Trauma/Burn Model of Heterotopic Ossification

异位骨化（HO）是指在骨骼系统以外形成骨组织，通常继发于重大创伤、烧伤以及骨科手术。目前用于研究 HO 的大多数动物模型依赖于外源性物质的应用，例如骨形态发生蛋白（BMP）、外源性细胞构建物，或 BMP 信号通路中的基因突变。尽管这些模型具有研究价值，但它们并不能准确再现导致大多数 HO 病例发生的炎症状态。本文介绍一种在小鼠中建立的烧伤/跟腱切断模型，可稳定诱导局部异位骨化。该方案包括在背部皮肤造成占体表面积 30% 的浅层接触性烧伤，同时在跟腱中点处进行切断。该方法仅通过创伤性损伤即可在可预测的部位诱导 HO 形成，从而允许仅基于内在生理过程和微环境，对软骨内成骨途径的异位骨化进行时间序列研究。该模型有望帮助深入理解创伤诱导 HO 中涉及的炎症与成骨信号通路。此外，由于在此模型中 HO 的发生部位和时间进程具有可预测性，因此可用于优化早期影像学检测策略及防治手段，以预防异位骨化的形成。

本研究描述了先前发表的小鼠创伤/烧伤诱导异位骨化（HO）模型的实验方案14-17。该模型包括通过跟腱切断术造成局部肌肉骨骼损伤，同时通过部分厚度烧伤造成全身性炎症刺激。这种联合处理可在跟腱切断部位稳定地诱导反应性骨组织形成，并可通过连续影像学手段进行监测。迄今为止，所有接受跟腱切断术和烧伤损伤的小鼠（超过50只）均在切断部位形成了可测量的异位骨化。为了定量分析异位骨的形成情况，可在每个预设时间点采用经校准的显微CT（µCT）成像方案。研究表明，与单独进行跟腱切断术相比，联合烧伤损伤是诱导显著异位骨化形成的关键因素。当两种损伤同时发生时，跟腱切断部位形成的异位骨量显著增加（图1）17。
<img alt="Bone healing, heterotopic ossification study; CT scans, bar graph; burn vs. non-burn comparison." src="/files/ftp_u...

一种跟腱切断联合烧伤诱导异位骨化的模型，可实现对创伤引起的异位骨形成进行可靠研究，且无需使用外源性因素。

异位骨化（HO）是指在骨骼系统以外部位形成骨组织，通常继发于重大创伤、烧伤以及骨科手术……

本实验的总体目标是在不使用外源性材料的情况下，诱导创伤性损伤后异位骨的形成。该目标首先通过制造一个集中的肌肉骨骼损伤来实现，本实验中为跟腱切断术。第二步，诱导全身性炎症状态。此处展示的是体表面积30%的浅二度接触性烧伤。随后，在接下来的五到九周内，允许在腱切断部位形成异位骨化（HO）。最终，可通过微型计算机断层扫描成像来评估异位骨组织的量及其位置。该技术相较于现有方法的主要优势在于，在此模型中具有临床相关性。小鼠会进一步形成软骨前体，继而生成异位骨组织，此过程无需额外的细胞因子，也无需对小鼠进行额外的基因突变。因此，我们认为这种方法将有助于更好地测试治疗手段及其他成像方式，因为它能够很好地模拟我们在异位骨化患者中所见到的骨组织类型。该技术的应用意义延伸至异位骨化（HO）的治疗与诊断，因为它能够在异位骨发生骨化酸化之前，对潜在的治疗方法进行研究。我们最初产生这一方法的构想，是源于在临床中观察到严重烧伤患者出现异位骨化，其发生部位远离烧伤区域，以及在其他患者中观察到在肌肉骨骼创伤部位出现异位骨化现象。麻醉给药后，确认动物对趾部刺激无反应，并给予镇痛剂。将八至十周龄的C57BL/6成年小鼠的眼部涂抹眼膏。随后将动物置于加热垫上，使用剪毛器将后肢从足跟至膝盖处的毛发紧密剃除。然后从脊柱开始，延伸至背侧中线左侧。清理出至少2厘米×3厘米的区域，以容纳烧伤创面。待所有毛发去除后，使用聚维酮碘溶液交替清洗手术区域和后肢足部三次，并穿戴适当的个人防护装备，包括口罩、头帽以及无菌手术衣和手套。然后使用无菌器械，在左侧跟腱内侧沿纵轴做一条0.5厘米的切口。当能够看到跟腱时，将一把锋利的组织剪的一侧刀片插入跟腱下方的组织平面，并沿该平面解剖，直至刀片到达跟腱中点。随后迅速闭合剪刀刀片以切断跟腱，并用无菌纱布加压以实现止血。用5-0薇乔缝线缝合皮肤切口后，将一块35克、2厘米×2厘米×3厘米的铝块置于水浴中加热至60摄氏度。待铝块加热完成后，将其放置于小鼠体表17秒，注意确保整个表面均与小鼠接触。随后用纱布吸干背部形成的浅层部分厚度烧伤创面，并覆盖Tegaderm敷料，通过腹腔和皮下注射温热的乳酸林格液对动物进行复苏处理。然后将小鼠放入单独的笼子中进行监测，直至其完全恢复。为了在背部部分厚度烧伤后的适当时间点通过微型CT分析监测损伤部位的异位骨化，将麻醉后的小鼠以俯卧位固定在扫描仪床面上。用胶带将后肢牢固地固定在床面上，以防止呼吸运动伪影，并在小鼠下方放置包含空气、水和羟基磷灰石的模体，用于图像校准。接下来，打开骨分析软件，定义一个感兴趣区域，该区域应涵盖从近端髋关节到远端后足垫尖端的双侧后肢。使用指定参数获取图像。然后在每个三个模体腔室中绘制感兴趣区域，并将平均密度输入软件中相应的字段，以将图像校准至Houndsfield单位。为了获得最清晰的解剖结构视图，使用软件中的抓取工具重新调整图像方向，使左侧后肢胫骨沿 Z 轴方向平行。然后从膝关节开始，向远端逐层滚动查看图像切片。当遇到异位骨化（HO）时，使用手动样条工具在每第三至第五个切片上围绕异位骨创建感兴趣区域，继续向远端延伸至足部，或直至完全越过异位骨化区域。然后使用外推工具将感兴趣区域延伸并拼接成一个包含全部异位骨化（HO）的单一感兴趣区域。最后，创建三维感兴趣区域并打开分析菜单，设置最能显示骨窗的下限和上限阈值，以计算当前的骨体积。所有如上所述同时接受跟腱切断术和烧伤损伤的小鼠，均在跟腱切断部位形成了可测量的异位骨化（HO），用于量化异位骨的形成。在每个期望的时间点均采用校准后的图像微型CT方案。烧伤损伤与跟腱切断术相结合已被证实是诱导显著异位骨化形成的关键因素；当这两种损伤同时发生时，与单独进行跟腱切断术相比，在切断部位形成的异位骨量显著增加。一旦掌握该技术，若操作得当，每只动物的操作时间可在10分钟或更短时间内完成。在进行该操作时，重要的是要确保所有后侧肌腱均被完全切断。完成该操作后，可采用成像技术（如RO波谱分析、生物发光成像或CT扫描）来评估骨形成量以及特定药物的作用效果。此外，还可通过组织学、免疫组织化学和免疫荧光技术，研究异位骨化发生背后的信号转导机制，以及药物的作用方式。

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科研

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Medicine

医学

异位骨化直接鼠标创伤/烧伤模型

来源： Wang, Y., 等. 在体 内 多重耐药菌的抗菌蓝光治疗研究 鲍曼不动杆菌 利用生物发光成像技术研究烧伤感染 J. Vis. Exp.

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直接小鼠创伤/烧伤型异位骨化模型

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