建立具有临床相关性的模型 离体 用于在天然微环境中研究上皮伤口修复的模拟白内障手术模型

本实验的总体目标是建立一个具有临床相关性的模型，以便在天然微环境中观察伤口修复过程。该目标首先通过移除鸡胚眼球中的晶状体来实现，第二步是在晶状体前部制造一个小切口。

然后用水洗脱晶状体纤维细胞团。接着，通过在前囊上进行额外切割，将带有相关上皮的晶状体囊膜展平。最后一步是将受损的培养物固定在组织培养皿中，以便观察其伤口愈合过程。

最终，通过延时显微镜、共聚焦显微镜和生物化学分析，揭示在高度模拟体内环境的模型中伤口修复的机制。该方法有助于回答伤口愈合领域中的关键问题，例如细胞如何协调一致地移动以闭合伤口。尽管该方法能够深入揭示伤口修复过程的机制。

它还可应用于 ABER 伤口愈合的研究，特别是纤维化和瘢痕形成。首先将三个 100 毫米的培养皿放入无菌超净工作台中。将其中两个培养皿用室温的三羟甲基氨基甲烷-葡萄糖缓冲液（tris dextrose buffer）填充至一半，第三个保持空置。

然后从37.7°C的培养箱中取出一枚受精后第15天的白来航鸡胚蛋，用70%乙醇擦拭蛋壳外表面以进行消毒。接着小心敲开蛋壳，将内容物倒入空的100毫米培养皿中。使用普通镊子和精细剪刀将胚胎头部剪下，并将其放入盛有TST葡萄糖缓冲液的培养皿之一中。

在15分钟内，将鸡胚头部移至培养皿盖上。使用高精度镊子夹住眼睛后部，于眼后部制造一个小开口。然后用镊子夹住玻璃体，并以滚动动作轻轻牵拉玻璃体。

带有晶状体的玻璃体会从眼球中脱离。将晶状体和玻璃体放入另一个含有 Tex extras Buffer 的培养皿中。晶状体在缓冲液中放置时间不得超过30分钟，随后继续进行解剖操作。

接下来，使用高精度镊子将晶状体转移至解剖显微镜下的一个新的培养皿盖中，用镊子边缘小心刷去随晶状体脱落的睫状体细胞。然后通过夹断玻璃体与晶状体后囊膜之间的连接，将晶状体与玻璃体分离。分离后，将晶状体转移至35毫米组织培养皿中盛有200微升三羟甲基氨基甲烷-葡萄糖缓冲液（Tris dextrose buffer）的液滴内，并使其前表面朝上摆放。

通过观察组织中存在一个致密环，可轻松识别晶状体前部，该致密环标记了晶状体上皮内部区域与赤道区的边界。使用两把高精度镊子，用左右手各持一把镊子夹住组织，向相反方向轻轻牵拉，在晶状体前囊中央做一长约850微米的小切口。接着，取一支1毫升注射器，安装27.5号针头，吸入300微升TST葡萄糖缓冲液。

将针尖插入前囊膜切口，并深入至晶状体约一半位置。然后轻柔推动注射器，将TST葡萄糖缓冲液注入晶状体。纤维细胞团块。

注入50至200微升缓冲液，以使纤维细胞团块从周围的上皮和晶状体囊中松脱。切勿注入超过300微升。使用高精度镊子，通过前部切口处将松脱的纤维细胞团块从晶状体中移除。

将晶状体纤维细胞团块从其附着于后囊膜的位置移除，可在基底膜上形成一个高度可重复的伤口区域，周围被受损的上皮组织环绕。从晶状体囊袋开始，在晶状体前部向赤道部方向做五个切口。将由此产生的五个带有附着上皮的晶状体囊瓣平铺于培养皿中，囊膜侧朝下，细胞侧朝上。

用镊子在星形的每个点上轻轻按压，以将囊膜固定在培养皿上。这会在x explan的五个最外端产生微小的凹痕，从而实现与培养皿的稳定附着。然后，从35毫米培养皿中移除三糖葡萄糖缓冲液，并加入1.5毫升预热的M199培养基。

在培养基中添加1%的L-谷氨酰胺和青霉素。用链霉素覆盖培养皿并盖上皿盖，然后放入培养箱中。将培养皿置于解剖显微镜下，观察上皮细胞中央迁移区与原始附着区之间的分界线。

然后使用两把高精度镊子夹住两个区域分界线两侧的边缘。沿着分界线轻轻拉动原始附着区域，即可轻松分离两个区域。继续沿整个培养区域的边缘进行分离，直至两个区域完全分开。

使用标准的分子或生化分析技术研究这两个组分。在晶状体纤维细胞团被移除后，一部分富集的间充质修复细胞亚群即被激活，并迁移至上皮细胞层的伤口边缘。这些细胞迅速移动到内源性基底膜囊无细胞区域的中央迁移区，开始修复过程。

该伤口以及此处描述的技术使该模型系统非常适合通过显微镜或摄像机观察伤口愈合过程。伤口愈合进展迅速，在培养的第一天即可覆盖伤口的显著区域。到第三天，随着中央迁移区与原始附着区的分离，伤口愈合过程通常已完成。本文分析了这两个不同区域之间的分子差异。

在两个区域中测定了黏着斑激酶的水平，发现迁移特异性中央迁移区域中磷酸化的黏着斑激酶含量增加。一旦掌握，如果操作得当，这种模拟白内障手术技术可在三分钟内完成。观看本视频后，您应能够很好地理解如何构建一种模拟白内障手术的模型，该模型可紧密模拟自然微环境中的伤口修复过程。