Name: 在联合电子能谱成像miniSOG标记的DNA修复蛋白可视化（ESI） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 了解如何使用电子能谱成像技术结合miniSOG标记系统，在纳米尺度上可视化DNA修复蛋白在双链断裂位点的分布，并分析损伤染色质的超微结构。

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感谢 Roger Tsien 博士为我们提供 miniSOG 载体。感谢 Xuejun Sun 博士在透射电子显微镜（TEM）方面的协助。感谢 Cross 癌症研究所的 Lisa Lem 和 Peter Shipple 提供氧气。Hilmar Strickfaden 获得阿尔伯塔癌症基金会的博士后奖学金，并得到巴伐利亚研究联盟的支持。本研究获得了加拿大卫生研究院和阿尔伯塔癌症基金会资助项目的资助。

1. 生成 miniSOG 细胞系
<ol>
	<li>在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中，将U2OS（人骨肉瘤）细胞培养于含有2 ml&#160;低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的35 mm培养皿中，该培养基添加有10%胎牛血清（FBS）。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%时，按照转染试剂生产商提供的方案，通过脂质体转染法将纯度合格（A269/280比值为1.8–2.0）的质粒构建体导入细胞，该质粒含有编码miniSOG和mCherry标记的修复蛋白的序列19。miniSOG表达质粒可从Tsien实验室订购：&#160;<a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a></li>
	<li>转染后两天，通过荧光激活细胞分选法筛选表达带有miniSOG和mCherry标签的重组蛋白的细胞。选择荧光强度中等的细胞，以避免过度表达的细胞20。</li>
	<li>将阳性细胞接种于10 cm培养皿中，使用10 ml&#160;DMEM培养基进行培养，该培养基补充有10% FBS和0.6 µg/ml&#160;筛选剂G418（遗传霉素）。</li>
	<li>当培养皿上出现可见克隆后，使用倒置荧光显微镜筛选mCherry阳性克隆，并用永久性记号笔在培养皿底部围绕其画圈。使用低倍率空气物镜（例如，10×），采用无菌操作技术，小心刮下克隆并缓慢吸入无菌的1,000 µl&#160;移液器吸头中进行挑取。</li>
	<li>扩增所选克隆，并使用步骤1.1中所述的生长培养基（添加10%二甲基亚砜）将部分细胞冻存。通过将细胞培养在无菌的18 × 18 mm2盖玻片上并暴露于2 Gy辐射，检测细胞中DRF（DNA修复灶）的形成情况。稳定表达miniSOG-mCherry标记修复蛋白的细胞经照射后，在荧光显微镜下使用mCherry成像滤光片组观察时，必须显示出双链断裂（DSB）典型的灶状荧光分布模式。</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>在步骤1.1所述条件下培养稳定表达miniSOG和mCherry标记修复蛋白的U2OS细胞。将细胞接种于含2 ml培养基的35 mm玻璃底培养皿中，生长至80%汇合度&#160;DMEM。确保将盖玻片粘附到塑料材料上的胶水以及所使用的塑料材料均耐水溶液、醇溶液，并耐受所用树脂！</li>
	<li>实验前，先勾画出约1 mm的小区域2 使用无菌钻石笔在荧光显微镜下刮取表达异位蛋白的细胞区域，以标记目标区域。或者，使用带有预刻网格系统的玻璃底培养皿，其中盖玻片内嵌有网格系统。 
	注意：如果使用高质量的相关显微技术结合ESI与荧光显微图像21，确保盖玻片的厚度与油浸物镜兼容，应选用厚度为1.5号（0.16–0.18 mm）的盖玻片。选择一个区域 &#160;靠近培养皿中心区域进行透射电子显微镜（TEM）观察，以避免树脂在边缘处发生聚合的问题（参见步骤4.10–4.13）。</li>
</ol>
3. DNA损伤诱导
<ol>
	<li>使用伽马辐射照射细胞，或使用模拟辐射的药物，或通过共聚焦显微镜上的激光微照射诱导损伤（例如，如文献18,22或&#160;23中所述）。</li>
	<li>在本示例中，使用铯-137辐射源对细胞进行2 Gy和6 Gy的伽马辐射照射，或在用0.5 µg/ml&#160;Hoechst对细胞致敏20分钟后，利用共聚焦显微镜的405 nm固态激光器进行激光微照射。</li>
</ol>
4. 样品制备
<ol>
	<li>在室温避光条件下，用 1 ml&#160;含 4% 多聚甲醛的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液或 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）固定细胞 30 分钟。 
	警告：多聚甲醛和二甲胂酸钠具有毒性！请佩戴手套，并妥善处理有毒物质。</li>
	<li>用 4 ml&#160;0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）或磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤细胞两次。</li>
	<li>为阻断未反应的醛基并抑制血红素基团产生的活性氧物种（可增加背景信号），将固定后的细胞置于 2 ml&#160;含 50 mM 甘氨酸、5 mM 氨基三唑和 10 mM 氰化钾的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液或 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中处理 30 分钟（请检查 pH！）。 
	警告：氰化钾剧毒！请佩戴手套，在通风橱内操作，并妥善处理有毒物质。该反应对 pH 高度敏感，因此必须确认 pH 准确无误。</li>
	<li>若需进行相关显微成像，请在倒置荧光显微镜下以二维或三维方式记录第 2.2 步中选定的区域。</li>
	<li>通过将一片 10 mg 盐酸二氨基联苯胺片剂放入 2 ml&#160;微量离心管中，制备 1 mg/ml&#160;盐酸二氨基联苯胺溶液。加入 980 µl&#160;蒸馏 H2O 和 20 µl 浓盐酸（11.65 M），混匀至溶液呈浅棕色且半透明。将此溶液用 0.1 M 磷酸盐缓冲液或 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液稀释至终浓度为 1 mg/ml&#160;，同时用氢氧化钠调节 pH 至 7.0–7.6 之间（推荐 pH 7.4）。 
	警告：二氨基联苯胺具有毒性！请佩戴手套，并妥善处理有毒物质。</li>
	<li>进行光氧化时，将缓冲液替换为 2 ml&#160;含 1 mg/ml&#160;盐酸二氨基联苯胺的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。避光保存并将溶液置于冰上冷却至 4 oC，以提高氧气溶解度。通过向溶液中通入氧气（使用插入溶液并连接氧气瓶的软管）使溶液饱和。再次检查 pH，必要时进行调节。 
	注意：光氧化反应的关键在于 pH 必须维持在 7.0 至 7.6 之间。</li>
	<li>将固定后的细胞培养皿小心安装在配备 40 倍油浸物镜的倒置荧光显微镜上，并移动至目标区域。使用 GFP 或 CFP 滤光片组，以蓝光激发 miniSOG 标签。miniSOG 在 448 nm 处有激发峰，在 473 nm 处有肩峰10。</li>
	<li>即使绿色的 miniSOG 荧光完全消失后，仍需继续照射，直至在透射光通道中观察到棕色的聚合二氨基联苯胺光氧化产物。当大多数细胞中均可观察到氧化产物时，关闭荧光照明以终止光氧化反应。 
	注意：光氧化所需时间可达数分钟，具体时长取决于物镜、滤光片透射波长与效率以及照明光源。</li>
	<li>用 1 ml&#160;含 2% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）或磷酸盐缓冲液（pH 7.4）对细胞进行后固定 30 分钟。</li>
	<li>用 0.1%–0.5% 四氧化锇在 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）或 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中固定细胞膜 20 分钟。 
	注意：建议使用能稳定细胞膜所需的最低浓度四氧化锇。由于聚合的 DAB 沉淀物含有高密度氮元素，可直接通过 ESI 检测，因此无需强四氧化锇染色来识别 miniSOG 标记蛋白，过度染色反而可能对 ESI 产生不利影响。四氧化锇剧毒！请在通风橱内操作，并妥善处理有毒废弃物。</li>
	<li>通过梯度乙醇（30%、50%、70%、90%、98%、100%）对细胞进行脱水（每步 5 分钟）。随后，将细胞置于 100% 乙醇与丙烯酸树脂（LR White）1:1 混合液中，将培养皿置于摇床上孵育 4 小时以促进树脂渗透，再于 100% 丙烯酸树脂（LR White）中继续孵育至少 4 小时。</li>
	<li>为聚合树脂，用剃刀片切下标记好的 2 ml&#160;微量离心管的管盖，并在管口涂覆丙烯酸树脂加速剂。确保加速剂仅覆盖管口边缘，不流入管内。随后，用巴氏吸管小心将 LR White 树脂注入管中约三分之二体积。注意避免树脂接触管口的加速剂！</li>
	<li>移除培养皿中已渗透的树脂，将培养皿倒扣在直立的微量离心管上，使管的宽度几乎完全覆盖培养皿的玻璃观察窗区域。</li>
	<li>等待 1 至 2 分钟&#160;，使加速剂密封管与盖玻片，然后翻转管体，使管内的树脂覆盖细胞。</li>
	<li>将带有管的培养皿放入 60 °C 烤箱中，固化 12 小时。</li>
	<li>树脂块固化后，从烤箱中取出附有树脂填充微量离心管的培养皿，并将微量离心管与培养皿分离。可通过液氮冷冻与热水解冻的冻融循环辅助分离。</li>
	<li>弃去玻璃底培养皿，用剃刀片小心切开微量离心管以取出树脂块。</li>
	<li>用永久性记号笔标记树脂块。</li>
	<li>用剃刀片修整树脂块，仅保留含有先前用金刚石或钨笔标记区域（或含有目标细胞区域）的约 1 mm2 区域。</li>
	<li>将树脂块安装至超薄切片机上，先用修块刀修整，再用金刚石刀切割约 50 nm 的超薄切片。</li>
	<li>将切片捞取至高透射性 300 目载网上。此类载网栅条极细，可减少对目标区域细胞的遮挡。</li>
	<li>使用碳镀膜仪在载网切片上镀约 0.2–0.4 nm 厚的碳层，以增强其在透射电子显微镜电子束下的稳定性。</li>
</ol>
5. 电子显微镜
<ol>
	<li>将载网装入配备能量过滤器的透射电子显微镜（TEM）中。根据制造商的说明对显微镜和能量过滤器进行调校后，在低倍率模式（正常透射）下检查切片中的细胞，并在适当时与荧光数据进行比较（来自步骤4.4）。</li>
	<li>一旦发现具有显著特征的细胞核（如DNA损伤轨迹或DNA修复焦点），切换至能量过滤模式并记录厚度图。 
	注意：该过程包括记录零损失图像和未过滤图像。样品厚度不超过0.3个平均自由程（入射电子束中约30%的电子被样品散射）时，足以生成高质量的元素分布图。</li>
	<li>使用控制显微镜能量过滤器的软件，记录磷和氮元素的比值图。磷元素图的后边缘图像在175 eV能量损失处采集，狭缝宽度为20 eV；前边缘图像在120 eV能量损失处采集，狭缝宽度同样为20 eV。氮元素图的后边缘图像在447 eV处采集，狭缝宽度为35 eV；前边缘图像在358 eV处采集，狭缝宽度也为35 eV。 
	注意：由于成像元素（磷和氮）的含量相对较低（约1%），为获得更高的信噪比，应选择“比值图像”（定性元素图）而非“三窗口法”（定量元素图）来生成图像。</li>
</ol>
6. 图像处理
<ol>
	<li>在能够处理所获取图像文件格式的图像处理软件中（例如，Digital Micrograph）打开元素比例分布图。将氮元素分布图复制到RGB图像的红色通道，将磷元素分布图复制到绿色通道，然后叠加并对齐这些图像。</li>
	<li>将合成图像导出为TIFF（标签图像文件格式）文件，并在支持图层功能的图像处理软件中（例如，Photoshop）打开该图像。</li>
	<li>通过将每个通道图像的最小值和最大值重新缩放至8位数据集（0到255），调整其动态范围。</li>
	<li>使用“图层”窗口，从氮元素分布图中减去磷元素信号，以生成显示蛋白质分布的定性图谱。</li>
	<li>将上一步生成的核酸（磷）和蛋白质（氮）分布图&#160;转换为“索引颜色”模式，并在CMYK色彩空间中为显示核酸分布的图像创建黄色查找表，为非核蛋白分布图创建青色查找表。颜色选择旨在使两种元素分布图之间获得最大对比度。</li>
	<li>创建新图像，并将显示磷和蛋白质分布的图像作为不同图层导入。使用“滤色”（screen）透明度模式，使两个图层叠加显示。</li>
	<li>打开步骤5.2中获取的零损失图像。该图像代表所记录区域的图像，外观类似于常规透射电子显微镜（TEM）图像，但仅包含穿过样品而未与样品发生碰撞的电子信号。将此图像导出为TIFF格式。</li>
	<li>在图像编辑软件中打开导出的零损失图像，并将其复制到显示元素分布图的图像的最上层图层中。使用“滤色”透明度模式对图像进行对齐。</li>
	<li>可选地对零损失图像进行阈值分割，以分离来自miniSOG的信号。将处理后的图像作为单独图层按上述方法添加。</li>
</ol>

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<li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li>
<li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprint+of+%27Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+%28QuEST%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li>
<li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li>
<li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

ESI 可作为研究细胞核内不同染色质状态和核糖核蛋白的优秀工具，因为它能够特异性地定位富含磷的区域。它显著提高了透射电子显微镜所能获得的细节量，并且不依赖于非特异性的染色方法。ESI 的一个缺点是在相同加速电压下需要比常规透射电子显微镜更薄的切片。这一问题可通过连续切片或采用断层成像方法加以克服28。
尽管通过观察磷和氮的分布可以获得大量信息，但能够同时绘制特定蛋白质的分布图也具有重要意义。本文介绍的方法表明，电喷雾电离（ESI）可与基于邻苯二胺位点特异性聚合的方法相结合。虽然该方法并未为ESI增加一种全新的颜色，但在绘制蛋白质分布图方面显然具有实用价值，尤其适用于与染色质相互作用的蛋白质。如果研究需要同时可视化多种蛋白质群体，仍可采用免疫胶体金标记方法，但需在光氧化反应之前进行预包埋染色9。与稳定细胞系相比，瞬时转染的缺点在于不同细胞间的表达水平可能存在显著差异，从而难以找到多个表达标签蛋白量相近的细胞。因此，建议构建稳定细胞系。然而，在瞬时转染后，仍可通过荧光成像评估蛋白表达的相对水平，并筛选出中等表达水平的细胞进行后续分析。...

尽管近年来光学显微镜技术取得了显著进展1，细胞生物学家仍然面临分辨率上的局限，这限制了对涉及大分子复合物协同相互作用的基本细胞过程中结构与功能关系的理解例如在染色质重塑、DNA修复、RNA转录和DNA复制等过程中，染色质结构的解析至关重要。尽管透射电子显微镜（TEM）能够提供所需的分辨率，但由于无法在标记特定蛋白质的同时确定所观察结构的生物化学组成，这些过程的结构解析一直面临挑战。由于细胞核内缺乏可用于区分核结构的内膜系统，核内结构的识别尤为困难。电子光谱成像（ESI）技术在一定程度上克服了这些局限，能够同时检测并区分基于DNA、RNA和蛋白质的核结构。2-5.
电子能谱成像：
为了在电子显微镜中以高灵敏度和高分辨率绘制元素分布图，可以使用成像谱仪，该谱仪能够选择因与样品中元素的内壳层电子相互作用而发生非弹性散射的电子6。由于样品中原子电离时会损失特定于元素的能量，因此可通过连接在电子显微镜上的谱仪将这些电子分离并成像。因此，对与样品相互作用后的电子能谱进行分析，可揭示样品元素组成的定性和定量信息7。当电子穿过样品时未损失能量，它们将出现在电子能量损失谱的“零损失峰”中。这些电子的丰度与样品的质量、密度和厚度相关，其组成包括那些在穿过样品过程中未与样品发生碰撞或未损失能量的电子。该信息可用于对样品中特定元素的原子数目进行绝对定量8。
由于生物样本主要由轻元素组成，对透射电子显微镜（TEM）入射电子束的散射能力较弱，因此必须使用重金属盐染色方法以在样本中产生对比度。大多数此类对比剂缺乏特异性，且在可能实现特异性的条件下也无法同时观察多种染色，这限制了传统电子显微镜在细胞核研究中的应用价值。能量选择成像（ESI）相较于传统透射电镜具有显著优势，尤其适用于细胞核结构的研究。可以利用DNA和RNA所含大分子复合物富含磷的特性，将核蛋白复合物与纯蛋白复合物区分开，并根据核酸密度的不同来分辨不同的核蛋白复合物。其余生物物质则可根据其氮元素的丰度进行成像。仅通过磷和氮这两种元素的分布图及其在不同亚细胞结构中相对丰度的分析，即可获得大量关于细胞核的信息。例如，在磷丰度分布图中可清晰识别染色质和核糖体；而核间质区域、核孔复合体以及核内小体则在氮分布图中易于辨认。
微型单线态氧发生系统（miniSOG）
尽管ESI是一种研究的有力技术 原位 染色质结构，因为它利用了磷和氮元素组成之间的特征比例，但元素组成通常不能用于区分不同的蛋白质复合物群体。用纳米级小金颗粒标记的抗体已被广泛用于定位单个分子的位置。由于金颗粒通常连接在二抗上，因此它会出现在由一抗识别的表位周围约20 nm的范围内。在包埋后样品中，抗体只能检测暴露在切片表面的表位。尽管可以证明某种抗原的存在并将其与细胞的特定解剖结构相关联，但所获得的信息并不完整，因为大多数表位被树脂遮蔽。包埋前技术采用与荧光显微镜类似的实验流程，可使抗体在整个样品深度范围内接触抗原，但为使抗体穿透细胞而必需的通透化步骤通常需要去除脂质膜，并会移除无法被醛类固定的组分。此外，用于超微结构保存的最佳醛类固定剂——戊二醛，通常会破坏表位，因此通常需使用多聚甲醛。然而，后者在蛋白质-蛋白质交联方面效果较差。用金纳米颗粒标记抗体的另一个缺点是，金是一种电子密度极高的材料，会产生强烈的对比度，可能掩盖样品中对比度较弱但具有重要意义的结构细节。
绿色荧光蛋白（GFP）作为一种可表达的蛋白标签的出现，彻底改变了荧光显微镜在细胞生物学问题研究中的应用。通过将一种小的荧光结构域标记到目标蛋白上，可实现对该蛋白分布的定位与追踪 体内 无需进行可能改变结构的透化处理。为了将利用蛋白质标签来绘制细胞内蛋白质分布的精巧原理应用于透射电子显微镜（TEM），需要一种能够在目标结构附近产生信号并在TEM中生成对比度的系统。聚合的二氨基联苯胺（diaminobenzidine）是一种常用于组织学中检测抗体结合的染色剂。这种染色剂通常通过与二抗偶联的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）沉积而成。尽管该反应能够产生可靠的结果，但HRP在细胞质中不具备催化活性。9HRP 的反应产物也可能从生成位点扩散，导致其分辨率低于纳米金法。10为了解决这些问题，开发了FlAsH/ReAsH系统11它由带有四半胱氨酸基序的重组融合蛋白组成。该基序可结合双砷荧光团。当被激发时，结合的FlAsH或ReAsH能够产生活性极高的单线态氧，从而将二氨基联苯胺（DAB）光转化为聚合物，该聚合物立即在标记蛋白所在位置沉淀。DAB聚合物可用四氧化锇染色，后者具有高电子密度，因此可用于在透射电子显微镜（TEM）下描绘重组融合蛋白的分布。
2011年，Shu 等10 介绍了miniSOG系统，该系统包含一个来源于黄素蛋白的106个氨基酸的小型融合标签 拟南芥 在448 nm蓝光激发下可发出荧光，并能产生大量单线态氧自由基。这些单线态氧自由基可用于光氧化二氨基联苯胺，使其在标记蛋白表面及附近形成聚合物，其标记精度显著高于免疫金标记抗体11尽管FlAsH/ReAsH系统需要引入荧光团 和 在进行光转化之前，将二氨基联苯胺引入细胞，miniSOG系统仅需二氨基联苯胺和光照，且其聚合二氨基联苯胺的效率约为传统方法的两倍。此处，miniSOG与ESI结合使用，以绘制DNA修复焦点的超微结构图谱。
DNA修复灶（DRF）
未修复的DNA双链断裂对细胞构成严重威胁，因为它们可能导致染色体易位和遗传信息丢失。这继而可引发细胞衰老、癌症以及细胞死亡。许多参与DNA双链断裂修复的蛋白质会聚集在围绕DNA双链断裂位点形成的焦点结构中12-14。尽管这些焦点结构的具体功能尚不明确，但它们代表了细胞核中存在DNA双链断裂的位点，也是DNA双链断裂修复的发生位置。
DNA修复灶（DRF）已通过荧光显微镜进行表征，可作为DNA损伤的生物标志物12,15。相较于双链断裂的尺寸，这些修复灶体积较大，过去被认为具有相对均一的结构，直到近期的超分辨率显微镜研究揭示了每个修复灶内部分子存在一定程度的亚区室化分布16。为了理解这些位点的组织方式，有必要对所有潜在的生物结构进行相互间的相对可视化。这一目标无法通过荧光显微镜实现，但可通过电子显微镜达成17,18。本文描述了一种将电子光谱成像与miniSOG方法相结合的技术，以展示该联合方法在探索DNA双链断裂修复超微结构方面的潜力。

<table><tbody><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>带网格的 35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD&amp;nbsp;</td><td>不适用于浸没式物镜</td></tr><tr><td>LR White：丙烯酸树脂</td><td>emsdiasum</td><td>14381</td><td></td></tr><tr><td>LR White 加速剂</td><td>emsdiasum</td><td>14385</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-四盐酸联苯胺二胺 10 mg 片剂</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>细条纹格栅 300 目</td><td>SPI</td><td>1161123</td><td></td></tr><tr><td>钨尖实验室标记笔</td><td>emsdiasum</td><td>41148</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>emsdiasum</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>碳镀膜仪 208 碳</td><td>Cressington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机 Leica EM UC6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS5</td><td>Adobe</td><td></td><td>甚至可兼容更早版本</td></tr><tr><td>Digital Micrograph V.2.30</td><td>Gatan</td><td></td><td>甚至可兼容更早版本</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Quiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniSOG 载体</td><td>Tsien-Lab</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MDC1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>53BP1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rad52 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铯-137 辐射源 &quot;MARK 1&quot;</td><td>&amp;nbsp;(J.L. Shepherd &amp; Associated)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FiJi</td><td>开源软件</td><td></td><td>http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf 管</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-146</td><td></td></tr><tr><td>金刚石刀片 超薄 35&amp;deg;</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>修块刀片 ultratrim</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠三水合物</td><td>emsdiasum</td><td>12300</td><td>注意：有毒！</td></tr><tr><td>戊二醛 EM 级 8%</td><td>emsdiasum</td><td>16020</td><td>注意：有毒！</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>emsdiasum</td><td>21180</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>emsdiasum</td><td>21190</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>emsdiasum</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇 4% 溶液</td><td>emsdiasum</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜 Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisherbrand</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠溶液 10 M</td><td>Fluka</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>氧气</td><td>Medigas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-氨基-1,2,4-三氮唑</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>氰化钾</td><td>Sigma</td><td>207810</td><td>注意：有毒！</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>emsdiasum</td><td>15058</td><td>注意：有毒！</td></tr><tr><td>单刃碳钢剃刀刀片</td><td>emsdiasum</td><td>71960</td><td>注意：锋利！</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D 5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜 200 kV</td><td>JEOL</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>GIF Tridiem 863 能量过滤器</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

minisog标记的dna修复蛋白与电子光谱成像（esi）联合可视化

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

光学分辨率的局限性以及在透射电子显微镜中识别特定蛋白质群体的挑战，一直是细胞生物学领域的障碍。许多现象无法通过 体外 简化系统中的分析需要额外的结构信息 原位，尤其是在1 nm至0.1 µm范围内，以实现充分理解。本文结合电子能谱成像技术（一种透射电子显微镜技术，可同时绘制蛋白质和核酸的分布图）与表达标签miniSOG，用于研究DNA双链断裂修复焦点的结构与空间组织。

ESI
比较细胞核的ESI图像（图1）与传统的透射电镜图像（例如，图7-1），可以发现可清晰分辨的解剖结构显著增多。染色质脊呈黄色，小鼠细胞中的染色中心也较易识别。核仁因其圆形结构和不同颜色而易于与染色质区分，因为预先组装的核糖体除了富含磷的RNA外，还含有大量富含氮的蛋白质。周边染色质以薄层形式位于细胞核边缘，核孔则表现为富含氮的结构，中断了周边染色质的连续性。通常，核纤层可被观察为位于周边染色质外侧的一层极薄的蓝色区域。在细胞质中，可见许多富含磷的小颗粒，根据其大小、丰度及位于细胞核外的位置，可将其鉴定为核糖体。染色质之间的间隙表现为富含蛋白质的区域，即间染色质区，其中包含核体以及富含微小黄色信号的区域，如核糖核蛋白颗粒和核糖核蛋白颗粒簇（图2）。后者被称为间染色质颗粒簇，其特征是富集了前体mRNA剪接所需的蛋白质。图1B、C和D展示了其他已知结构的形态，如有...

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

光学分辨率的局限性以及在透射电子显微镜中识别特定蛋白质群体的挑战一直是……中的障碍

以下实验的总体目标是在纳米尺度上绘制双链DNA断裂周围DNA修复蛋白的分布图。为了利用电子光谱成像技术研究正在修复过程中的受损染色质的超微结构，通过构建编码DNA损伤应答蛋白融合蛋白的DNA表达载体来实现该目标，该融合蛋白包含荧光蛋白和微型SOG标签。第二步是通过转染将构建体导入细胞，随后利用激光或γ射线对细胞进行损伤处理。接着，对经辐照并固定的细胞进行透射电镜样品制备，以使标记了微型SOG的修复蛋白在电子显微镜下分布情况得以显现。最终获得的电子光谱成像可提供详细的图像，用于分析染色质的超微结构以及特定蛋白质与DNA修复焦点之间的关系。与免疫金标记等现有技术相比，该技术的主要优势在于不依赖抗体的可及性，并且能够对目标结构进行较为密集的标记。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为光氧化过程对pH值、光强度和氧气饱和度非常敏感。对该方法进行可视化演示至关重要，因为光氧化、氧气饱和度和光照步骤对微小变化极为敏感，因此必须准确展示该方法的操作过程，以确保可重复性。我实验室的博士后 Hilmar Fadden 将为您演示该培养方法。使用稳定表达迷你SOG和M樱桃标记的修复蛋白的人类骨肉瘤细胞，具体如随附文本方案所述。将细胞从10厘米培养皿中传代后，培养至80%汇合度。接下来，将细胞置于荧光显微镜下，使用无菌金刚石笔圈出一个约一平方毫米的小区域，该区域包含已标记的表达外源蛋白的细胞。标记后，向溶液中加入herx以使终浓度为0.5微克/毫升，对细胞进行致敏，然后将细胞置于37摄氏度培养箱中孵育20分钟。随后，使用共聚焦显微镜的405纳米固体激光器对细胞进行激光微照射，以诱导DNA损伤。在DNA损伤发生后，于室温下用1毫升含4%多聚甲醛的0.1摩尔柠檬酸钠缓冲液在避光条件下固定细胞，30分钟后完成固定。用4毫升pH为7.4的0.1摩尔儿茶酸钠缓冲液洗涤细胞两次。接着，将固定后的细胞用2毫升含有50毫摩尔甘氨酸、5毫摩尔氨基三唑和10毫摩尔氰化钾、pH为7.4的溶液处理30分钟。随后，弃去上述溶液，加入2毫升pH为7.4的光氧化缓冲液，该缓冲液的配制方法见随附的文字版实验方案。然后将样品置于冰上避光孵育，同时向溶液中通入氧气以维持溶液的氧饱和状态。接着，将含有固定细胞的培养皿小心地放置在倒置荧光显微镜上，配备40倍油浸物镜，并移动至此前标记的目标区域。使用绿色荧光蛋白的滤光立方，以蓝光激发mini SOG标签。即使绿色的微型SOG荧光已完全消失，仍需继续照射，直至在透射光通道中观察到聚合的二氨基苯并啶的棕色光氧化产物出现为止。然后用1毫升含2%戊二醛的0.1摩尔柠檬酸钠缓冲液（pH 7.4）对细胞进行后固定，持续30分钟。接下来，用0.1至0.5%四氧化锇在0.1摩尔的邻苯二酚钠缓冲液中固定细胞膜，pH值为7.4，固定时间为20分钟。固定完成后，通过一系列乙醇洗涤步骤

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在联合电子能谱成像miniSOG标记的DNA修复蛋白可视化（ESI）

我们介绍了一种利用二维琼脂糖凝胶分析来鉴定紫外线照射后产生的复制中间体结构的实验方法。...

紫外线诱导的复制中间体的可视化 E. coli 使用二维琼脂糖凝胶分析

在本视频中，我们介绍了免疫荧光方法，用于观察经辐射处理的细胞核中DNA双链断裂位点处DNA修复蛋白γH2AX和53BP1的定位情况。...

基于免疫荧光的DNA修复蛋白相互作用可视化

此处研究不同的DNA损伤识别方法 通过...

原子力显微镜研究核苷酸切除修复中的DNA损伤识别

在此演示了如何 原位 邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）可用于检测和可视化在基因毒性应激条件下悬浮培养细胞中ATM与p53之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。...

利用邻位连接技术在悬浮细胞培养物中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物

激光显微照射是研究活细胞中DNA修复的有用工具。本文展示了利用UVA激光诱导多种DNA损伤的方法学途径。我们优化了一种局部显微照射方法，能够维持正常的细胞周期；因此，经照射的细胞可正常进行有丝分裂。...

利用高级共聚焦显微镜技术研究DNA损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

研究DNA损伤修复动力学需要一种能够在细胞核内特定区域诱导损伤的系统。本文介绍一种利用配备405...

利用405 nm激光显微照射技术研究蛋白质向DNA损伤位点的招募

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。...

通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。...

可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

本方案描述了在患者来源的卵巢癌类器官中评估DNA损伤修复蛋白的方法。内容包括全面的铺板和染色方法，以及详细且客观的定量分析流程。...

可视化患者来源卵巢癌类器官中的DNA损伤修复蛋白 通过 免疫荧光检测

以下实验方案介绍了通过细胞周期同步化后进行RPA2免疫荧光染色，以检测细胞周期G1期中单链DNA焦点的方法。...

可视化细胞周期G1期中的单链DNA焦点

了解如何使用电子能谱成像技术结合miniSOG标记系统，在纳米尺度上可视化DNA修复蛋白在双链断裂位点的分布，并分析损伤染色质的超微结构。

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

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