Name: 基于人类腺病毒5型高容量腺病毒载体的克隆及规模化生产 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: 学习高容量腺病毒载体的克隆与规模化生产技术，利用归巢内切酶和辅助病毒在 producer 细胞中扩增，可递送高达35 kb外源DNA，为基因治疗提供安全高效的递送工具。

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本工作由德国研究基金会（DFG）资助项目 EH 192/5-1（A.E.）、欧盟（E-rare-2）项目 Transposmart（A.E.）、乌普萨拉大学医院研究基金（UWH Forschungsförderung）（E.S. 和 W.Z）、维滕/黑尔德克大学博士培养计划（P.B.）提供支持。J.L. 获得中国国家留学基金管理委员会奖学金资助，T.B. 和 M.G. 获得Else Kröner-Fresenius基金会（EKFS）资助。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述方案基于人5型腺病毒（human adenovirus type 5），采用此前已报道的方法对高容量腺病毒载体（HCAdV）进行纯化 4,12pAdFTC 质粒中的 HCAdV 基因组缺失了所有腺病毒基因，仅保留 5'-和 3'-ITRs 以及包装信号。在此策略中，HV AdNG163R-2 4 提供高效病毒生产所需的全部必要基因 在转染中。这提供了高达 35 kb 的包装容量，明显优于第一代和第二代腺病毒（AdV）或广泛使用的慢病毒（LV）或腺相关病毒（AAV）载体。HCAdV 的第二个优势，尤其对于 体内 与第一代或第二代腺病毒载体相比，其应用优势在于表达病毒蛋白所导致的细胞毒性和免疫原性副作用显著降低 5-8.
然而，与LV或AAV载体以及第一代或第二代AdV载体相比，此处所述方案在时间和工作量上更为密集。主要障碍在于大尺寸转基因的克隆及其随后向病毒生产质粒pAdV-FTC的转移。利用归巢内切酶PI-SceI和I-CeuI可实现从穿...

在基因治疗应用中，避免由病毒蛋白、目的基因本身或输入的病毒蛋白表达所引起的细胞毒性和免疫原性副作用至关重要。腺病毒载体（AdV）被广泛用于将外源DNA导入多种细胞中，以研究目的基因表达的影响1,2。其中最先进的版本是完全缺失所有病毒编码序列的高容量腺病毒载体（HCAdV）3,4，其包装容量可达35 kb，同时具有低免疫原性和低毒性5-8。由于其高包装容量，可利用单次剂量的载体递送大片段或多个目的基因，因此成为科研领域的重要工具。
与可使用商业试剂盒轻松制备的缺失早期基因E1和/或E3的第一代或第二代腺病毒（AdV）不同，高容量腺病毒（HCAdV）的载体基因组构建和病毒制备更为复杂。HCAdV基因组的构建系统基于质粒pAdFTC和穿梭质粒pHM59-12，其中pAdFTC携带一个缺失所有病毒编码序列的HCAdV基因组。任何大小不超过14千碱基（kb）的目的基因均可克隆至穿梭载体pHM5中，该载体的多克隆位点两侧分别为归巢内切酶PI-SceI和I-CeuI的识别/切割位点。因此，可通过连续使用PI-SceI和I-CeuI进行酶切，将克隆的目的基因释放出来，并定向插入至pAdFTC质粒所携带的HCAdV基因组中相应的限制性酶切位点。在pAdFTC中，位于PI-SceI和I-CeuI切割位点之间的外源基因插入位点两侧含有填充DNA（stuffer DNA）以及基因组包装所必需的非编码腺病毒序列，包括两端的5'和3'反向末端重复序列（ITRs）以及5'ITR下游的包装信号。额外的填充DNA可使最终的HCAdV基因组大小维持在27至36 kb的适宜范围内，从而确保病毒制备过程中高效的基因组包装。由于pAdFTC是一个最大可达45 kb的大质粒（具体大小取决于插入的外源基因长度），且归巢内切酶具有较长的DNA识别序列并表现出强烈的DNA结合能力，因此在将外源基因从pHM5转移至pAdFTC的过程中，需要进行多次纯化步骤。操作时应谨慎，避免施加剪切力。
HCAdV 基因组的 ITR 两侧分别带有 NotI 限制性内切酶识别位点，这些位点位于 5'ITR 的正上游和 3'ITR 的正下游12。因此，可通过 NotI 酶切释放 HCAdV，随后将病毒基因组转染至 HCAdV 生产细胞系中。需要注意的是，使用限制性内切酶 NotI 从质粒 pAdFTC 中释放病毒基因组，意味着所插入的转基因序列中不能含有 NotI 的 DNA 识别位点。基于 HEK293 细胞的生产细胞（116 细胞）可稳定表达 Cre 重组酶。在病毒扩增过程中，116 细胞需与一种辅助病毒（HV）共感染，该辅助病毒以反式提供腺病毒复制和包装所需的所有基因in trans3,4。该辅助病毒是一种第一代腺病毒，其包装信号两侧带有 loxP 位点（floxed packing signal），在病毒扩增过程中，由 116 细胞表达的 Cre 重组酶将其切除4。这一机制可确保主要被衣壳化的基因组为含有完整包装信号的 HCAdV 基因组。
通过在培养皿表面培养的116细胞中连续传代来实现HCAdV的预扩增。每次传代后，通过进行三次连续的冻融步骤，从感染的细胞中释放病毒颗粒。每次传代时，使用上一代细胞裂解液的1/3感染数量逐渐增加的细胞。最后，使用最后一次预扩增步骤获得的裂解液感染在旋转瓶中悬浮培养的生产细胞，以进行大规模扩增。通过在氯化铯密度梯度中进行超速离心，从悬浮细胞中纯化病毒颗粒4,12。在此过程中，空颗粒和完整组装的颗粒分离为两条不同的条带。为进一步浓缩HCAdV颗粒，进行第二次非梯度超速离心步骤。随后收集含有HCAdV的条带，并在生理缓冲液中透析。最终的载体制剂需检测绝对病毒颗粒数、感染性颗粒数以及HV污染水平。绝对病毒颗粒数可通过裂解病毒颗粒后测定260 nm处的吸光度，或通过定量实时PCR（qPCR）来确定12。纯化病毒颗粒的感染性可通过qPCR测定感染后3小时细胞内存在的HCAdV基因组来评估。

<table><tbody><tr><td>I-CeuI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td><td>限制性酶切</td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td>限制性酶切</td></tr><tr><td>T4 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>连接反应</td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td>限制性酶切</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td>限制性酶切</td></tr><tr><td>小牛肠碱性磷酸酶（CIP）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>酶切质粒的去磷酸化</td></tr><tr><td>潮霉素B</td><td>PAN Biotech</td><td>P02-015</td><td>CRE表达116细胞的筛选</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>HEK293T细胞培养基</td></tr><tr><td>最低必需培养基（MEM）Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116细胞培养基&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td>细胞洗涤、细胞重悬</td></tr><tr><td>250 ml储存瓶</td><td>Sigma</td><td>CLS430281-24EA</td><td>悬浮培养116细胞的感染</td></tr><tr><td>500 ml聚丙烯离心管</td><td>Sigma</td><td>CLS431123-36EA</td><td>从悬浮培养物中沉淀细胞</td></tr><tr><td>旋转培养瓶</td><td>Bellco</td><td>1965-61030</td><td>悬浮培养116细胞</td></tr><tr><td>超透明超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>密度梯度离心</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>密度梯度离心</td></tr><tr><td>SW-41转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>密度梯度离心</td></tr><tr><td>Spectrum Laboratories Spectrapor透析膜</td><td>VWR</td><td>132129</td><td>透析管</td></tr><tr><td>即用型透析夹片&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>66383</td><td>透析</td></tr><tr><td>单次使用DH10B电转化感受态&lt;i&gt;E. coli&lt;/i&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-52</td><td>连接反应的转化</td></tr><tr><td>PureYield质粒中量提取系统</td><td>Promega</td><td>A2495</td><td>中量质粒提取</td></tr><tr><td>peqGOLD组织DNA小量提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td><td>基因组DNA提取</td></tr><tr><td>SuperFect转染试剂</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td>116细胞的转染</td></tr><tr><td>opti MEM（10% FBS）</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>116细胞的转染</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>&amp;nbsp;170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 touch&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td></td><td>qPCR仪</td></tr><tr><td>苯酚/氯仿/异戊醇&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td>DNA纯化</td></tr><tr><td>氯化铯</td><td>Carl Roth</td><td>8627.1</td><td>密度梯度离心</td></tr><tr><td>乙酸钠 99%</td><td>Carl Roth</td><td>6773.2</td><td>DNA沉淀</td></tr><tr><td>LB培养基&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.3</td><td>细菌生长培养基</td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;99.8%纯度</td><td>Carl Roth</td><td>9065.5&amp;nbsp;</td><td>DNA沉淀与洗涤</td></tr><tr><td>SDS 99.5%</td><td>Carl Roth</td><td>2326.2</td><td>裂解&amp;nbsp;缓冲液</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td>裂解&amp;nbsp;缓冲液</td></tr><tr><td>Tris-HCl 99%</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td>透析缓冲液/裂解&amp;nbsp;缓冲液</td></tr><tr><td>甘油 99.5%</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td>透析缓冲液</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;98.5%</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.2</td><td>透析缓冲液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td>可选透析缓冲液</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td>可选透析缓冲液</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Carl Roth</td><td>9286.1</td><td>可选透析缓冲液</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth</td><td>4984.2</td><td>可选透析缓冲液</td></tr><tr><td>1.5 ml离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72,730,005</td><td>病毒制备物在-80 &amp;deg;C下的储存</td></tr></tbody></table>

基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

不含任何病毒编码序列的高容量腺病毒载体（HCAdV）因其高达35 kb的包装容量、低免疫原性和低毒性，被认为是目前最先进的基因递送载体之一。然而，由于载体基因组构建和病毒生产的流程较为复杂，许多实验室在使用HCAdV时面临困难。本文介绍了一种基于包含HCAdV基因组的质粒pAdFTC，高效克隆并生产HCAdV的详细实验方案。HCAdV基因组的构建依赖于一种利用归巢内切酶（I-CeuI 和 PI-SceI）的克隆载体系统。任何大小不超过14 kb的目的基因均可亚克隆至穿梭载体pHM5中，该载体包含一个两侧分别由I-CeuI 和 PI-SceI 限定的多克隆位点。在通过I-CeuI 和 PI-SceI 介导将目的基因从穿梭载体上释放后，可将其插入HCAdV克隆载体pAdFTC中。由于pAdFTC质粒尺寸较大，且所用酶具有较长的识别位点并伴随强烈的DNA结合特性，因此需谨慎操作克隆片段。在病毒生产过程中，通过NotI 消化释放HCAdV基因组，并将其转染至稳定表达Cre重组酶的HEK293来源的生产细胞系中。为提供腺病毒扩增所需的所有腺病毒基因，需使用一种包装信号两侧带有loxP位点的辅助病毒进行共感染。载体的预扩增在贴壁生长的生产细胞中进行，而大规模扩增则在悬浮培养的生产细胞中通过旋转瓶完成。病毒纯化过程包括两个基于氯化铯梯度的超速离心步骤，随后进行透析。本文汇总了近年来在使用该HCAdV载体系统过程中积累的经验、技巧和优化方法。

此处展示了HCAdV制备物的克隆、扩增和纯化的代表性示例。提供了克隆策略的概览（图1），以及通过限制性内切酶消化进行HCAdV基因组克隆和释放的代表性示例（图2）。展示了将目的基因（GOI）表达盒从pHM5质粒中用PI-SceI和I-CeuI酶切后，经酚-氯仿抽提及乙醇沉淀（另见步骤1.2–1.5）所得的典型限制性酶切图谱（图2A）。通常可观察到一条约3 kb的条带，对应于pHM5质粒骨架，以及另一条对应于GOI表达盒的条带。随后从琼脂糖凝胶中纯化含有GOI表达盒的条带。将纯化的GOI表达盒与经PI-SceI和I-CeuI分别酶切并去磷酸化的pAdVFTC质粒（步骤1.7）一同进行琼脂糖凝胶电泳分析，以确认其正确大小，并估算后续连接反应中分子的相对含量（图2B）。连接反应完成后（见步骤1.8），经酚-氯仿抽提及乙醇沉淀，并用SwaI酶切以去除未切割的...

介绍了一种生成高容量腺病毒载体的方案，该载体缺失所有病毒编码序列。载体基因组中转基因的克隆基于归巢核酸内切酶技术。病毒在贴壁生长或悬浮培养的生产细胞中的扩增依赖于提供病毒基因反式表达的辅助病毒。

不含任何病毒编码序列的高容量腺病毒载体（HCAdV）因其高效的……而成为最先进的基因递送载体之一

本实验的总体目标是构建一种基因删除的高容量腺病毒载体，用于在活细胞或生物体内递送和表达治疗性转基因。该方法有助于基因治疗领域递送那些无法装入其他病毒载体的大片段转基因。该技术的主要优势在于，高容量腺病毒不含病毒基因。利用这些载体，最多可递送长达 35 kb 的外源 DNA。该技术的应用已扩展至遗传性疾病的治疗，因为它有助于递送用于基因校正或基因添加的治疗性载体。该方法为治疗性转基因的生物递送提供了先进的工具，既可用于细胞培养，也可应用于活体生物。该方法的可视化演示至关重要，因为载体扩增和载体纯化需要一定的操作经验。在载体纯化过程中，操作者必须掌握恰当的手法。通过琼脂糖凝胶电泳检测1:10稀释的线性化高容量腺病毒基因组表达质粒的等分试样。应能检测到一个九千碱基的pAd-FTC质粒骨架片段，以及另一个28至36千碱基的高容量腺病毒基因组DNA片段（包含目的基因）。接下来，按照标准操作流程，将5微克线性化的高容量腺病毒基因组转染至一个60毫米培养皿中、处于50%至80%汇合度的HEK293细胞。转染后16至18小时，小心移除培养基，并加入3毫升新鲜培养基。然后，用辅助病毒 AdNG 163R2 感染细胞，每个细胞加入五个转导单位。在 37 摄氏度、5%CO2 的组织培养孵箱中孵育，并在孵育的第 1 小时内每 20 分钟轻轻振荡培养板一次，以使辅助病毒均匀分布至所有细胞。感染后48小时，用培养基冲洗培养皿中的细胞以收获细胞。保留0.5毫升的第0代细胞用于基因组DNA的提取。随后，将2.5毫升的第0代细胞反复进行冻融处理，即将其浸入液氮中进行冷冻和解冻。或将细胞置于负80摄氏度冰箱中，然后在37摄氏度水浴中反复冻融3至4次。将2.5毫升裂解液与1毫升新鲜培养基混合，并加入辅助病毒，每细胞感染复数为2个转导单位。吸去一个60毫米培养皿中处于90%至95%融合度的一一六细胞的培养基，加入上述病毒混合液处理细胞。将细胞孵育 48 小时，操作同前。随后，收集细胞并重复冻融及感染步骤两次，以获得第一代和第二代裂解物。在获得第二代裂解物后，将 2.5 毫升裂解物与 17.5 毫升新鲜培养基混合，并加入每细胞 2 个转换单位的辅助病毒。吸弃一个汇合度为80%至100%的150毫米培养皿中的一代六细胞的培养基，并用病毒混合物感染细胞。感染后48小时，采用刚刚展示的方法收获第三代裂解物。开始此步骤时，向一个3升的旋转培养瓶中加入900毫升预热的培养基。从至少 10 个 150 毫米培养皿中去除培养基，每个培养皿中的细胞密度为 1:6，细胞融合度达到 90% 至 100%。用 10 毫升新鲜的预温培养基冲洗细胞，反复吹打数次，以获得均一的细胞悬液。然后将细胞直接转移至旋转培养瓶中。将旋转培养瓶置于组织培养孵育箱内的磁力搅拌器上，于37摄氏度及5% CO2条件下孵育24小时。调节磁力搅拌器

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

基于人类腺病毒5型高容量腺病毒载体的克隆及规模化生产

来源：Ehrke-Schulz, E., 等. 基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产。J. Vis. Exp.

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