在生物液体介质中制备可扩展的高长径比金属纳米复合材料

本实验的总体目标是利用含铜起始材料和半胱氨酸制备具有线性结构和高长径比的微米及纳米复合物。首先，将经超声处理的铜纳米颗粒或硫酸铜与胱氨酸及水在无菌通气培养瓶中混合。合成的第二步是将混合后的组分置于37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育至少六小时。

接下来，通过肉眼观察和白光显微镜检查烧瓶，以确定线性结构形成的程度。最后一步是将合成烧瓶置于保持在 4°C 的冰箱中，以终止合成反应。最终，使用数字显微镜对合成的结构进行表征。该方法相较于现有方法（如电极定位法）的主要优势在于，该合成过程以液态形式进行，易于放大，且反应在生理条件下完成。

该技术的应用前景涉及癌症等疾病的治疗或诊断，因为所合成的结构可被细胞降解，从而可能为药物递送提供一种途径。当我所在团队在开展不同纳米材料潜在毒性的相关实验时，首次提出了该方法的构想。对该方法进行直观演示至关重要，因为其最终合成步骤可能较难掌握。

操作不当可能导致形成聚集结构或完全无法形成结构。要使用铜纳米颗粒或 CMP 进行自组装合成，请通过称取至少两毫克 CMP 来制备铜纳米颗粒溶液。此步骤中应佩戴一次性手套，以防止 CMP 与皮肤接触。

将纳米颗粒放入一个空的无菌16毫升玻璃小瓶中，然后加入含有CMPs的小瓶。加入适当体积的无菌去离子水，配制成2毫克/毫升的溶液，并涡旋震荡20秒，以在合成开始前使纳米颗粒充分分散。加水时不要超过小瓶容量的一半，否则将影响分散效果。

通过涡旋混合后，CMPs 会迅速沉降到离心管底部，且颜色变深。在合成开始前，将 CNP 溶液在室温下超声处理 17 分钟，以实现 CMPs 的最大程度分散。需定期检查，确保 CMPs 因超声而充分混合；成功超声后，CMPs 在溶液中至少保持悬浮状态 30 分钟，且溶液呈深色。

称取7.29毫克胱氨酸用于合成。由于胱氨酸在水中不能直接溶解，将称量好的胱氨酸转移至含有半胱氨酸的抗静电称量容器中。加入足量无菌1摩尔/升氢氧化钠溶液，使胱氨酸完全溶解，配制成72.9毫克/毫升的溶液。

将半胱氨酸完全溶解于100 µL的一摩尔氢氧化钠溶液中。然后取7 µL溶解后的半胱氨酸与6,643 µL无菌水加入无菌合成烧瓶中混合。将装有混合溶液的烧瓶置于37°C培养箱中孵育30分钟，瓶盖需打开通气，以确保充分混匀。

此为半胱氨酸工作液。对于7毫升的总合成体积，将CNPs在超声处理步骤后已沉淀的每毫升含2毫克的CNP溶液通过涡旋振荡30秒重新悬浮。将半胱氨酸工作液转移至25平方厘米的细胞培养瓶中，并加入350微升重悬的CNPs。

盖上烧瓶盖并拧紧，确保密封。将合成所需的所有组分混合后，轻轻旋转摇动烧瓶四到五次，使溶液混匀。将烧瓶放入二氧化碳培养箱中，并将瓶盖稍许松开，以使烧瓶内外能够进行气体交换。

合成过程中，将反应置于培养箱中孵育约24小时。在此期间，可通过显微镜观察及肉眼观察到高度线性复合结构的形成。此步骤至关重要，以确保已有部分结构形成，同时避免自组装过程持续过长。

一旦在烧瓶中观察到线性结构，立即通过 tightly 封闭合成烧瓶来终止生物复合材料的合成，并在烧瓶上标注合成条件，包括合成和孵育所使用的日期以及终止前的合成时间。随后将容器置于冰箱中储存，生成的结构在此形式下至少可稳定保存一年。或者，若采用硫酸铜进行自组装合成，可使用无菌操作技术将 CMPs 替换为硫酸铜盐，将至少两毫克的硫酸铜溶解于适量无菌去离子水中，配制成浓度为 2 毫克/毫升的溶液。

在此浓度下，硫酸铜晶体易于溶解，但必要时可涡旋小瓶，并通过肉眼观察确保硫酸铜配制后所有晶体均已完全溶解。按照刚刚演示的方法进行合成，但用硫酸铜替代CMPs。采用白光显微镜和电子显微镜对由CMPs和硫酸铜衍生的生物复合材料进行表征与检测。

利用白光显微镜进行寄生合成时，需使用倒置显微镜。将烧瓶平放后数分钟内，复合物将沉降至烧瓶底部表面，此时可将其调至清晰视野。使用显微镜的明场模式以最大化生物复合物与液体培养基之间的对比度；由CMPs和硫酸铜形成的复合物均呈透明至半透明状，而未反应的CNP聚集体则呈深黑色。

采用倒置白光显微镜评估特定实验中合成反应的有效性。例如，记录合成过程中是否存在未反应的CMPs。根据不同的实验参数（如孵育时间或超声处理持续时间），对用于制备CNP衍生生物复合材料的烧瓶进行区分。

单个CMP过小，无法用光学显微镜观察，但未反应的CNP聚集体将呈现为圆形、深色的物体。相比之下，成功合成的CNP复合物则具有较高的长径比、线性形态，并表现出多种不同的长度。应避免在终止前进行过长时间的合成，否则会形成高度分支的海胆状结构，一旦形成便难以分散为单个结构。

此外，使用倒置的白光显微镜评估在特定实验中利用硫酸铜进行合成的效率。由于硫酸铜完全溶于溶液，采用本方案时，该溶液的颜色将比使用CMPs合成的溶液更浅。

通过比较不同合成条件（如终止前的合成时间）下的烧瓶，记录硫酸铜复合物的尺寸和范围。为了首先浓缩生物复合物的副产物，将六毫升的氰化物纳米颗粒（CNP）衍生结构或硫酸铜衍生结构加入一个15毫升离心管中。在室温下以500 × g离心10分钟，形成沉淀，适用于较小体积的样品。

向溶液中的结构物加入500 µL，转移至0.6 mL离心管中，在室温下以2000 × g离心至少10分钟，形成沉淀。将结构物重悬于无菌去离子水中，并超声处理至少10分钟以充分分散。通过此过程持续操作，结构物会逐渐断裂，平均长度变小。

使用倒置白光显微镜和数码相机记录不同超声时间下复合物尺寸的变化，展示了我们在细胞培养基中发现生物复合物的代表性结果。在最初82小时，CMPs均匀分散并逐渐聚集形成微结构。随着时间推移，颗粒被清除，更大的聚集体形成。最终，出现具有线性结构的大型聚集体，形成海胆样结构。

展示了将CMPs转化为线性生物复合材料的过程。将CMPs与半胱氨酸和水混合，形成初始均匀分散的CMPs溶液。三小时后形成微结构聚集体，六小时后形成中间结构。

高长径比结构的电子显微镜表征。通过透射电子显微镜显示所合成的生物复合材料，其中以CNP为起始原料形成线性复合材料；而起始的CMPs呈圆形，如扫描电子显微镜（SEM）所示。由CMPs与半胱氨酸形成的复合材料的纳米和微米级形貌特征通过SEM展示。

通过扫描电镜能谱分析描绘了由硫酸铜和半胱氨酸形成的复合物的特征。图中展示了起始原料及合成线性组分的X射线能谱元素分析结果。起始CMPs显示出明显的铜峰，而无硫峰。

由CMPs和胱氨酸制备的生物复合材料因使用硫酸铜起始反应而出现硫和碳的特征峰。材料显示出铜和硫的峰。由硫酸铜和胱氨酸制备的生物复合材料因含有胱氨酸而出现碳的特征峰。一旦掌握，该技术若操作得当，可在12至24小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要始终通过肉眼和显微镜观察来监测合成过程，以防止合成的结构过度聚集。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如对结构进行荧光标记），以回答更多科学问题，例如合成的结构是否能够与细胞结合。观看本视频后，您应能够充分掌握如何准备合成所需的试剂、正确混合试剂、监测合成进程，以及在合成后对结构进行浓缩和修饰。