Name: 可扩展的，金属的高宽比纳米复合材料在生物液体中产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 了解如何在生理条件下利用铜纳米颗粒和胱氨酸合成高长径比生物复合材料。该方法可在液体中轻松放大规模，适用于材料科学和生物医学研究。

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作者谨此感谢路易斯安那理工大学微制造研究所的 Alfred Gunasekaran 在电子显微镜研究中提供的技术协助，以及 Jim McNamara 博士在其他显微镜研究方面提供的帮助。本研究所述工作部分由路易斯安那州立大学系统 PKSFI 合同编号 LEQSF (2007-12)-ENH-PKSFI-PRS-04 及路易斯安那理工大学 James E. Wyche III 特聘教授职位基金（资助对象：M.D.）支持。

1. 实验设计
<ol>
	<li>确定合成所需的铜纳米复合材料体积。根据此体积选择适量的小容量烧瓶（25 cm2）或下文所述的较大烧瓶，用于材料制备。</li>
	<li>本合成过程需使用37 °C、含5% CO2且湿度至少为40%的培养箱。确保该培养箱可用，并在合成期间（约24小时）不会被频繁开启干扰。 
	警告：频繁开关培养箱必然导致温度波动，可能影响纳米复合材料结构的正常合成。</li>
</ol>
2. 材料准备
<ol>
	<li>在实验开始前，将固体材料直接加入溶剂中，现配现用。不建议长时间将胱氨酸和铜起始原料的储备液保存在液体状态，否则可能导致实验结果不稳定。从供应商处取出后，用Parafilm封住容器口部，保持起始材料干燥。 
	注意：以下方案以在25 cm2细胞培养瓶中进行反应为例，使用7 µl胱氨酸、6,643 µl无菌水和350 µl CNPs。</li>
	<li>通过称取至少2 mg CNPs，配制2 mg/ml的铜纳米颗粒溶液。此步骤中需佩戴一次性手套，避免CNPs与皮肤接触。将纳米颗粒置于一个空的无菌16 ml玻璃小瓶中。
	<ol>
		<li>向含有CNPs的小瓶中加入适量体积的无菌去离子水，配制成2 mg/ml的溶液，并涡旋震荡20秒，以在合成开始前使纳米颗粒充分分散（建议总体积至少为1 ml）。加水时不要超过小瓶容量的一半，以免影响涡旋混合效果。CNPs会迅速沉降至瓶底，溶液呈深色（灰色至黑色）。</li>
		<li>在室温下对CNPs溶液进行17分钟的超声处理，以在合成开始前实现最大程度的分散。期间应定期检查，确保超声过程中CNPs充分混合。成功超声后，CNPs可在溶液中保持悬浮状态至少30分钟，且溶液呈深色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称取足量的胱氨酸，用于配制72.9 mg/ml的溶液。由于胱氨酸不能直接溶于水，应将称量好的胱氨酸置于防静电称量容器中。
	<ol>
		<li>向含有胱氨酸的称量容器中加入足量的无菌1 M NaOH，使胱氨酸完全溶解。例如，将7.29 mg胱氨酸完全溶解于100 µl的1 M NaOH中，即可得到72.9 mg/ml的溶液。</li>
		<li>为保持无菌条件，此步骤应在无菌层流细胞培养罩中进行。 
		警告：1 M NaOH具有强腐蚀性，操作时需佩戴一次性手套，防止浓NaOH接触皮肤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌细胞培养罩中操作，先将7 µl胱氨酸与6,643 µl无菌水加入无菌合成瓶中，并在37 °C培养箱中孵育30分钟，瓶盖保持松开（通气），以实现充分混合。由于在超声步骤后CNPs已沉降，使用前需将2 mg/ml CNP溶液涡旋震荡30秒使其重悬。
	<ol>
		<li>采用无菌操作技术，向合成瓶中加入适量的CNP溶液，以维持以下组分比例：在25 cm2细胞培养瓶中，按1份胱氨酸、50份CNPs和949份无菌水的比例开始合成。例如，对于7 ml的总合成体积，需加入7 µl胱氨酸储备液、350 µl CNPs和6,643 µl无菌水。盖上瓶盖并拧紧，确保密封。</li>
		<li>所有组分混合后，轻轻晃动培养瓶4–5次进行混匀。将培养瓶放入CO2培养箱中，并将瓶盖略微松开以保持通气，使合成过程中瓶内外可进行气体交换。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让合成反应在培养箱中持续进行约24小时。在此期间，可通过显微镜观察或肉眼观察到高度线性复合物的形成。 
	注意：结构的形成过程可能突然发生，即初期难以察觉，随后迅速出现并密度逐渐增加。因此，结构可能在24小时之前即已完成形成。当结构变大且密度升高后，也可通过肉眼观察。虽然可在不同时间点通过显微镜和肉眼持续观察结构的生成过程，但频繁中断合成条件和温度将导致合成效果不佳。</li>
	<li>通过拧紧合成瓶盖并将容器置于冰箱（4 °C）中，终止生物复合物的合成。一旦形成，这些结构在此条件下至少可稳定保存一年。在瓶上标注合成条件，包括所用组分、合成日期以及合成终止前的孵育时间。</li>
</ol>
3. 使用硫酸铜进行合成
<ol>
	<li>通过将CNPs替换为硫酸铜盐来进行自组装合成。采用无菌技术，将至少2 mg的硫酸铜溶解于适量无菌去离子水中，配制成2 mg/ml的溶液。在此浓度下，硫酸铜晶体易于溶解，必要时可涡旋振荡容器，并肉眼检查以确保所有晶体完全溶解。</li>
	<li>配制好硫酸铜溶液后，按照前述方法进行合成，但以硫酸铜替代CNPs。 
	注意：以硫酸铜为起始材料制备的自组装纳米复合物在最终形态上比由CNPs合成的结构具有更高的均一性。</li>
	<li>终止硫酸铜生物复合物的合成过程，方法同CNPs复合物（步骤2.6），并将产物长期保存于4 °C。</li>
</ol>
4. 生物复合材料合成后的表征与处理
<ol>
	<li>通过白光显微镜9和电子显微镜9对源自CNPs和硫酸铜的生物复合材料进行表征。
	<ol>
		<li>合成后对生物复合材料进行白光显微镜表征与观察时，使用倒置显微镜，因为复合材料在将烧瓶平放数分钟后会沉降至烧瓶底部表面，随后可进行调焦。使用显微镜的明场模式以最大化复合材料与液体介质之间的对比度。源自CNPs和硫酸铜的复合材料均呈透明至不透明状，而未反应的CNPs聚集体则呈深色。
		<ol>
			<li>使用连接至显微镜的数码相机拍摄复合材料图像。可观察到单个结构具有不同的长度范围。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对合成后并已在4 °C下储存的生物复合材料进行表征与观察时，需将烧瓶置于室温下至少15分钟，因为在刚从冰箱取出时烧瓶表面会形成冷凝水，影响显微成像时的有效聚焦。待其恢复至室温后，用洁净的纸巾擦拭烧瓶的顶部和底部表面，以提高显微成像质量。</li>
		<li>处理或成像长期储存的复合材料时，将烧瓶涡旋振荡30秒，以解离在冰箱储存期间形成的复合材料团块。涡旋后使用倒置显微镜检查结构，确认聚集体已解离，必要时重复涡旋操作。</li>
		<li>使用倒置白光显微镜评估基于CNPs的特定实验中合成的有效性。例如，记录用于合成CNPs来源生物复合材料的烧瓶中未反应CNPs的存在与否，比较不同参数（如合成时间）的烧瓶结果。 
		注：单个CNPs因尺寸过小无法通过光学显微镜观察，但未反应的CNPs聚集体呈圆形、深色颗粒；而成功合成的CNP-复合材料则具有高长径比、线性形态，并呈现多种长度。应避免在终止前进行过长时间的合成，否则将形成高度分支的“海胆”状结构，一旦形成则难以分散为单个结构。</li>
		<li>使用倒置白光显微镜评估基于硫酸铜的特定实验中合成的有效性。由于在此方案中硫酸铜完全溶解，溶液颜色较使用CNPs合成的溶液更浅。通过比较不同合成条件（如终止前的合成时间）的烧瓶，记录硫酸铜复合材料的尺寸与分布情况。 
		注：成功合成的复合材料将呈现多种长度。应避免在终止前进行过长时间的合成，否则将导致复合材料形成高度分支的聚集体，部分呈“类海胆”结构，且一旦形成后难以分散为单个结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>合成后为浓缩生物复合材料，将复合材料溶液置于离心管中进行离心。向15 ml离心管中加入6 ml源自CNPs或硫酸铜的结构。在室温下以500 × g离心10分钟，形成沉淀。对于较小体积，将500 µl含结构的溶液加入0.6 ml规格的离心管中，在室温下以2,000 × g离心至少10分钟，形成沉淀。
	<ol>
		<li>离心足够时间（微型离心机至少10分钟）后，小心移除沉淀上方的上清液，保留管底可见的沉淀，其中结构已浓缩。源自硫酸铜的生物复合材料结构呈蓝色，而源自CNPs的结构颜色较深（灰色至黑色）。</li>
		<li>如需进一步浓缩，可向同一离心管中添加更多复合材料并重复上述过程。为分散浓缩后的沉淀，向管中加入所需体积的溶液，并涡旋振荡10–30秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结构形成后进行超声处理，以降低结构群体的平均尺寸（长度）。将结构置于无菌去离子水中，超声处理至少10分钟。通过此过程，结构随时间推移逐渐断裂，平均长度减小（参见正文图6）。使用倒置白光显微镜和数码相机记录不同超声时间下复合材料尺寸的变化。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在评估包括碳纳米颗粒（CNP）在内的纳米材料潜在毒性效应时，观察到在长期作用下，CNP从最初较为分散的颗粒分布逐渐转变为更大尺寸的聚集态（图2）。在某些情况下，这些在细胞培养皿中、生物条件下形成的高度聚集结构，会从中心聚集体延伸出高度线性的突起，类似于先前报道的含铜“海胆状”结构6。需要指出的是，在本研究展示的条件下，添加至细胞的CNP浓度为亚最大浓度，因此并未导致培养细胞全部死亡（见图2）。基于这些初步观察，后续实验通过逐步去除细胞培养条件中的各种组分（最终甚至去除细胞本身），以确定合成线性铜生物复合物所必需的关键成分。
我们发现，在适当的生物条件下，原始细胞培养物中添加的组分胱氨酸与碳纳米颗粒（CNPs）结合后，可导致纳米颗粒形态转变为一种高度线性的生物复合物，扫描电镜结合能谱分析（EDX）结果显示该复合物同时含有金属和生化组分（图5）。因此，硫元素在起始的CNP材料中并不存在，但在合成的生物复合物中呈现出显著的峰信号，表明铜和生化物质胱氨酸的组分对于线性...

铜是一种高反应活性的金属，在生物体系中，它对某些酶的功能至关重要1,2，但在较高浓度下具有强烈毒性，包括以纳米颗粒形式存在时亦如此3,4。随着铜纳米颗粒（CNP）及其他铜基纳米材料的应用日益广泛，由于纳米结构具有更大的比表面积，铜的毒性问题变得愈发重要。因此，即使少量的铜，若以纳米颗粒形式存在，也可能因其能够穿透细胞并分解为活性形式而引发局部毒性。某些生物物种能够与金属离子形成络合物并螯合这些离子，甚至可将金属整合入生物结构中，例如在海洋贻贝中已有相关描述5。在研究纳米材料潜在毒性效应的过程中4，研究人员发现，在常规细胞培养条件（37 °C 和 5% CO2）下随着时间推移，可形成具有高长径比（线性）结构的稳定铜生物复合物。
通过排除法，最初在完全细胞培养基中发现的这些线性生物复合材料，被简化为一个定义明确的方案，仅需必要的组分即可实现生物复合材料的自组装。研究发现，利用两种起始金属组分即可实现两类高度线性生物复合材料的自组装：1）CNPs 和 2）硫酸铜，其共同的生物组分为胱氨酸。尽管此前已有报道更为复杂的含铜结构，如所谓的“海胆状”和“纳米花状”结构，具有纳米和微米尺度的特征，但这些结构是在非生物条件下制备的，例如在100 °C或更高温度下6-8。据我们所知，在生物条件下于液相中可规模化合成独立的线性含铜纳米结构此前尚未见报道。
已有文献报道，用于合成纳米复合材料的一种起始原料——碳纳米颗粒（CNPs），对细胞具有很高的毒性4。最近有研究报道，在形成纳米复合材料后，这些结构按单位质量计算的毒性低于起始的纳米颗粒（NPs）9。因此，本文所描述的合成过程可能源于一种具有生物学和生物化学意义的反应，该反应在稳定活性铜物种方面具有应用价值，既可将纳米颗粒转化为更大的结构，又能生成对细胞毒性更低的复合材料。
与许多其他已知在接触生物液体介质时会发生聚集或结块的纳米材料形式不同10,11，本文所描述的这些高度线性的复合结构一旦形成便不会发生聚集，这可能归因于电荷的重新分布，此前已有相关报道9。如本研究中详述，这种抗聚集特性在处理已形成的结构时具有至少三方面的便利性：1）复合结构形成后可通过离心进行浓缩，并可通过涡旋混合轻松重新分散；2）可通过不同时间的超声处理降低所形成结构的平均尺寸；3）所形成的线性结构可能有助于避免近期报道的“咖啡环效应”12，从而为制备分布更均匀的材料涂层（特别是含有球形颗粒的材料）提供一种掺杂手段。

<table><tbody><tr><td>迷你涡旋振荡器</td><td>VWR (https://us.vwr.com)</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱型号 #2425-2</td><td>VWR (https://us.vwr.com)</td><td>联系供应商</td><td>当前型号目录号 98000-360</td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机（制冷型微量离心机）</td><td>Labnet (http://labnetinternational.com/)</td><td>C2500-R</td><td>Prism R 型号</td></tr><tr><td>细胞培养离心机 Z323K 型</td><td>Labnet (http://labnetinternational.com/)</td><td>联系供应商</td><td>当前型号 Z206A，目录号 C0206-A</td></tr><tr><td>超声波破碎仪（超声波清洗器）</td><td>Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)</td><td>1510R-MTH</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Sartorius (http://dataweigh.com)</td><td></td><td>CP225D 型，类似型号 CPA225D</td></tr><tr><td>Olympus IX51 倒置光学显微镜</td><td>Olympus (http://olympusamerica.com</td><td>联系供应商</td><td></td></tr><tr><td>Olympus DP71 显微镜数码相机</td><td>Olympus (http://olympusamerica.com</td><td>联系供应商</td><td></td></tr><tr><td>外部电源装置 — Olympus 显微镜用白光光源</td><td>Olympus (http://olympusamerica.com</td><td>TH4-100</td><td></td></tr><tr><td>10X、20X 和 40X 显微镜物镜</td><td>Olympus (http://olympusamerica.com</td><td>联系供应商</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)</td><td>S-4800 型</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)</td><td>Libra 120 型</td><td></td></tr><tr><td>台式单向气流洁净工作台</td><td>Envirco (http://envirco-hvac.com)</td><td>PNG62675 型</td><td>用于无菌细胞培养技术</td></tr></tbody></table>

在生物液体介质中制备可扩展的高长径比金属纳米复合材料

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

本实验方案旨在描述两种具有高长径比结构的新型生物复合材料的合成方法。这些生物复合材料由铜和半胱氨酸组成，其中金属组分来源于铜纳米颗粒（CNPs）或硫酸铜。合成过程在液体中进行，并在生理条件（37 °C）下反应24小时后自组装形成复合物。一旦形成，这些复合物在液态介质和干燥状态下均表现出高度稳定性。复合物的长度尺度从纳米到微米级不等，直径范围从几微米至25 nm。场发射扫描电子显微镜结合能谱分析（EDX）结果显示，来源于纳米颗粒的线性结构中含有硫元素，而起始的CNP材料中则不含硫，从而证实半胱氨酸是最终纳米复合物中硫的来源。在线性纳米和微米复合物的合成过程中，反应容器中会形成多种不同长度的结构。实验表明，合成完成后对液体混合物进行超声处理，可通过延长超声时间来减小结构的平均长度，从而有效调控产物的平均尺寸。由于所形成的结构高度稳定、不发生团聚，且在液相中生成，因此也可采用离心法对合成的复合物进行浓缩和分离。

图1 展示了本研究中所述线性生物复合材料合成步骤的流程图示意图。以碳纳米颗粒（CNPs）或硫酸铜为起始材料，与无菌水混合制成 2 mg/ml 的溶液；该溶液经混合与超声处理以获得均匀混合物，随后按以下比例混合用于合成：949 份无菌水 : 50 份铜混合液 : 1 份胱氨酸储备溶液。实际体积可根据该比例相应增加或减少，以放大或缩小最终合成产物的产量。在如图所示条件下孵育至少 2 小时后，形成线性生物复合结构，随着时间推移，可通过普通白光显微镜或肉眼观察到液体溶液外观的变化。
图2 展示了在为期82小时的完整细胞培养基中首次发现这些线性结构的代表性结果。本实验室当时正在评估不同纳米材料（包括碳纳米颗粒）对正常细胞和癌细胞的潜在毒性，图中所示细胞即为 图2 是一种源自ATCC（CRL-2020）的快速生长的脑肿瘤细胞系。这些细胞所用完全培养基的一种关键添加成分是胱氨酸，而该成分恰好成为揭示培养物中为何形成这些线性结构的关键因素（见下文及讨论部分）。从最初均匀分散的CNPs迅速聚集成微结构（<s...

本文介绍一种在生物条件下及液相介质中合成新型高长径比生物复合材料的实验方案。该生物复合材料的直径和长度分别可达到纳米级和微米级。铜纳米颗粒（CNPs）以及与胱氨酸联合使用的硫酸铜是合成该材料的关键组分。

本实验方案旨在描述两种具有高长径比结构的新型生物复合材料的合成方法。该生物复合材料由铜……组成

本实验的总体目标是利用含铜起始材料和半胱氨酸制备具有线性结构和高长径比的微米及纳米复合物。首先，将经超声处理的铜纳米颗粒或硫酸铜与胱氨酸及水在无菌通气培养瓶中混合。合成的第二步是将混合后的组分置于37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育至少六小时。接下来，通过肉眼观察和白光显微镜检查烧瓶，以确定线性结构形成的程度。最后一步是将合成烧瓶置于保持在 4°C 的冰箱中，以终止合成反应。最终，使用数字显微镜对合成的结构进行表征。该方法相较于现有方法（如电极定位法）的主要优势在于，该合成过程以液态形式进行，易于放大，且反应在生理条件下完成。该技术的应用前景涉及癌症等疾病的治疗或诊断，因为所合成的结构可被细胞降解，从而可能为药物递送提供一种途径。当我所在团队在开展不同纳米材料潜在毒性的相关实验时，首次提出了该方法的构想。对该方法进行直观演示至关重要，因为其最终合成步骤可能较难掌握。操作不当可能导致形成聚集结构或完全无法形成结构。要使用铜纳米颗粒或 CMP 进行自组装合成，请通过称取至少两毫克 CMP 来制备铜纳米颗粒溶液。此步骤中应佩戴一次性手套，以防止 CMP 与皮肤接触。将纳米颗粒放入一个空的无菌16毫升玻璃小瓶中，然后加入含有CMPs的小瓶。加入适当体积的无菌去离子水，配制成2毫克/毫升的溶液，并涡旋震荡20秒，以在合成开始前使纳米颗粒充分分散。加水时不要超过小瓶容量的一半，否则将影响分散效果。通过涡旋混合后，CMPs 会迅速沉降到离心管底部，且颜色变深。在合成开始前，将 CNP 溶液在室温下超声处理 17 分钟，以实现 CMPs 的最大程度分散。需定期检查，确保 CMPs 因超声而充分混合；成功超声后，CMPs 在溶液中至少保持悬浮状态 30 分钟，且溶液呈深色。称取7.29毫克胱氨酸用于合成。由于胱氨酸在水中不能直接溶解，将称量好的胱氨酸转移至含有半胱氨酸的抗静电称量容器中。加入足量无菌1摩尔/升氢氧化钠溶液，使胱氨酸完全溶解，配制成72.9毫克/毫升的溶液。将半胱氨酸完全溶解于100 µL的一摩尔氢氧化钠溶液中。然后取7 µL溶解后的半胱氨酸与6,643 µL无菌水加入无菌合成烧瓶中混合。将装有混合溶液的烧瓶置于37°C培养箱中孵育30分钟，瓶盖需打开通气，以确保充分混匀。此为半胱氨酸工作液。对于7毫升的总合成体积，将CNPs在超声处理步骤后已沉淀的每毫升含2毫克的CNP溶液通过涡旋振荡30秒重新悬浮。将半胱氨酸工作液转移至25平方厘米的细胞培养瓶中，并加入350微升重悬的CNPs。盖上烧瓶盖并拧紧，确保密封。将合成所需的所有组分混合后，轻轻旋转摇动烧瓶四到五次，使溶液混匀。将烧瓶放入二氧化碳培养箱中，并将瓶盖稍许松开，以使烧瓶内外能够进行气体交换。合成过程中，将反应置于培养箱中孵育约24小时。在此期间，可通过显微镜观察及肉眼观察到高度线性复合结构的形成。此步骤至关重要，以确保已有部分结构形成，同时避免自组装过程持续过长。一旦在烧瓶中观察到线性结构，立即通过 tightly 封闭合成烧瓶来终止生物复合材料的合成，并在烧瓶上标注合成条件，包括合成和孵育所使用的日期以及终止前的合成时间。随后将容器置于冰箱中储存，生成的结构在此形式下至少可稳定保存一年。或者，若采用硫酸铜进行自组装合成，可使用无菌操作技术将 CMPs 替换为硫酸铜盐，将至少两毫克的硫酸铜溶解于适量无菌去离子水中，配制成浓度为 2 毫克/毫升的溶液。在此浓度下，硫酸铜晶体易于溶解，但必要时可涡旋小瓶，并通过肉眼观察确保硫酸铜配制后所有晶体均已完全溶解。按照刚刚演示的方法进行合成，但用硫酸铜替代CMPs。采用白光显微镜和电子显微镜对由CMPs和硫酸铜衍生的生物复合材料进行表征与检测。利用白光显微镜进行寄生合成时，需使用倒置显微镜。将烧瓶平放后数分钟内，复合物将沉降至烧瓶底部表面，此时可将其调至清晰视野。使用显微镜的明场模式以最大化生物复合物与液体培养基之间的对比度；由CMPs和硫酸铜形成的复合物均呈透明至半透明状，而未反应的CNP聚集体则呈深黑色。采用倒置白光显微镜评估特定实验中合成反应的有效性。例如，记录合成过程中是否存在未反应的CMPs。根据不同的实验参数（如孵育时间或超声处理持续时间），对用于制备CNP衍生生物复合材料的烧瓶进行区分。单个CMP过小，无法用光学显微镜观察，但未反应的CNP聚集体将呈现为圆形、深色的物体。相比之下，成功合成的CNP复合物则具有较高的长径比、线性形态，并表现出多种不同的长度。应避免在终止前进行过长时间的合成，否则会形成高度分支的海胆状结构，一旦形成便难以分散为单个结构。此外，使用倒置的白光显微镜评估在特定实验中利用硫酸铜进行合成的效率。由于硫酸铜完全溶于溶液，采用本方案时，该溶液的颜色将比使用CMPs合成的溶液更浅。通过比较不同合成条件（如终止前的合成时间）下的烧瓶，记录硫酸铜复合物的尺寸和范围。为了首先浓缩生物复合物的副产物，将六毫升的氰化物纳米颗粒（CNP）衍生结构或硫酸铜衍生结构加入一个15毫升离心管中。在室温下以500 × g离心10分钟，形成沉淀，适用于较小体积的样品。向溶液中的结构物加入500 µL，转移至0.6 mL离心管中，在室温下以2000 × g离心至少10分钟，形成沉淀。将结构物重悬于无菌去离子水中，并超声处理至少10分钟以充分分散。通过此过程持续操作，结构物会逐渐断裂，平均长度变小。使用倒置白光显微镜和数码相机记录不同超声时间下复合物尺寸的变化，展示了我们在细胞培养基中发现生物复合物的代表性结果。在最初82小时，CMPs均匀分散并逐渐聚集形成微结构。随着时间推移，颗粒被清除，更大的聚集体形成。最终，出现具有线性结构的大型聚集体，形成海胆样结构。展示了将CMPs转化为线性生物复合材料的过程。将CMPs与半胱氨酸和水混合，形成初始均匀分散的CMPs溶液。三小时后形成微结构聚集体，六小时后形成中间结构。高长径比结构的电子显微镜表征。通过透射电子显微镜显示所合成的生物复合材料，其中以CNP为起始原料形成线性复合材料；而起始的CMPs呈圆形，如扫描电子显微镜（SEM）所示。由CMPs与半胱氨酸形成的复合材料的纳米和微米级形貌特征通过SEM展示。通过扫描电镜能谱分析描绘了由硫酸铜和半胱氨酸形成的复合物的特征。图中展示了起始原料及合成线性组分的X射线能谱元素分析结果。起始CMPs显示出明显的铜峰，而无硫峰。由CMPs和胱氨酸制备的生物复合材料因使用硫酸铜起始反应而出现硫和碳的特征峰。材料显示出铜和硫的峰。由硫酸铜和胱氨酸制备的生物复合材料因含有胱氨酸而出现碳的特征峰。一旦掌握，该技术若操作得当，可在12至24小时内完成。在进行该实验操作时，重要的是要始终通过肉眼和显微镜观察来监测合成过程，以防止合成的结构过度聚集。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如对结构进行荧光标记），以回答更多科学问题，例如合成的结构是否能够与细胞结合。观看本视频后，您应能够充分掌握如何准备合成所需的试剂、正确混合试剂、监测合成进程，以及在合成后对结构进行浓缩和修饰。

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