Name: 常温离体肾脏的灌注肾的移植保护移植前 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 了解常温离体肾脏灌注技术用于移植前肾脏保护的方法。该技术通过维持肾脏在生理条件下灌注，有效减少冷缺血损伤，提高边缘供肾的存活率，为临床器官保存提供新方案。

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我们感谢意大利米兰的Sorin Group为我们提供了定制的肾脏灌注回路。此外，我们感谢瑞典哥德堡的XVIVO Perfusion Inc.提供了Steen溶液，感谢德国美尔茨堡的BBraun AG提供了注射泵，以及感谢德国罗伊伯格的Rieber GmbH &amp;#38; Co KG。

注意：研究方案的示意图见图1。
<img alt="示意图展示带有SCS和KTx阶段的NEVKP系统。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1">
图1. 研究方案。 常温下研究方案离体肾脏灌注基于猪模型。在对移植肾的血管进行外科解剖并用500 ml组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐（HTK）溶液冲洗后，可获取移植肾。经过3小时的冷保存（SCS）后，对移植肾进行常温灌注。 离体 （NEVKP）数小时，直至指定的移植时间。
所有动物均按照加拿大安大略省国家医学研究协会制定的《实验动物护理原则》以及美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理指南》接受人道护理。多伦多综合研究所动物护理委员会批准了所有研究。
1. 动物
<ol>
	<li>本方案中使用雄性约克夏猪（27 - 33 kg）。</li>
</ol>
2. 器官获取
<ol>
	<li>术前准备
	<ol>
		<li>将雄性约克夏猪饲养于研究机构中至少一周，以降低其应激水平。在麻醉诱导前至少禁食6小时。</li>
		<li>通过肌肉注射氯胺酮（25 mg/kg）、阿托品（0.04 mg/kg）和咪达唑仑（0.15 mg/kg）启动猪的麻醉。随后将动物从饲养设施转移至手术室（OR）。</li>
		<li>将猪仰卧位置于手术台上。让其自主呼吸含5%异氟烷的氧气2 L。待肌肉松弛后，使用喉镜暴露声门，并喷洒2%利多卡因以防止插管引起的痉挛。使用6.5 mm气管导管插管后，向套囊内注入3–5 ml空气进行封闭。 
		注：二氧化碳波形监测（capnometry）可确认气管导管位置正确。</li>
		<li>将异氟烷浓度下调至2.5%。将呼吸机参数设置为呼吸频率14–16次/分钟，潮气量10–15 ml/kg体重。密切监测猪的生命体征。心率和血氧饱和度通过脉搏血氧仪记录。</li>
		<li>在无菌条件下，采用Seldinger技术13将一根8.5 Fr. × 10 cm导管插入颈静脉。首先使用穿刺针刺入静脉血管，导入导丝后，撤出穿刺针并置入导管。撤出导丝后将导管固定于皮肤。术中持续以每小时200 ml的速度输注乳酸林格液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>消毒并覆盖手术区域后，从剑突至耻骨联合行正中切口。为改善术野暴露，可延伸为左侧腹壁切口。用布巾覆盖大小肠并将其推向左侧，以充分暴露右侧肾脏。</li>
		<li>分离下腔静脉（IVC）与腹主动脉。结扎主动脉后壁发出的分支动脉。</li>
		<li>完成腹主动脉后方的充分游离后，在肾动脉分支头侧绕置结扎线。此外，在髂总动脉分叉头侧放置两道结扎线。在左肾动脉周围放置一道结扎线。</li>
		<li>游离右肾周围粘连组织。解剖肾静脉、肾动脉和输尿管。</li>
		<li>切开膈肌，经心脏注入每公斤供体体重1,000 IU的肝素。对于DCD模型，在全身肝素化3分钟后经心内注射40 mval氯化钾，诱发心脏停搏。心脏停搏被视为热缺血开始的时间点。</li>
		<li>同时，为采集血液，将CPDA血袋（枸橼酸盐、磷酸盐、葡萄糖、腺苷）的采血管连接至左侧颈外静脉已置入的导管。进行低速离心（1,500 × g，无刹车）。在无菌条件下（II级生物安全柜内）去除血浆和白细胞层（buffy coat），并将红细胞保存用于后续输注。</li>
		<li>在髂总动脉分叉上方的腹主动脉插入器官灌注导管。结扎腹主动脉及左肾动脉处的结扎线。</li>
		<li>以100 cm H2O压力用组氨酸-色氨酸-酮戊二酸（HTK）溶液灌注肾脏。夹闭胸腔段下腔静脉，并通过颈静脉导管收集血液。在肾静脉下方切断腹段下腔静脉，以确保肾脏充分灌注。</li>
		<li>完成右肾充分灌注后，连同一段腹主动脉一并切取移植物。切断肾静脉，保留较长的输尿管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肾脏移植物在台面的灌注前准备
	<ol>
		<li>清除肾脏周围粘连组织。用结扎线闭合主动脉头端，并在远端使用1/4” × 3/8”变径接头进行插管。结扎从主动脉发出的较小动脉分支。</li>
		<li>直接使用1/4” × 3/8”变径接头插管肾静脉。用8 Fr.喂养管插管输尿管。</li>
		<li>将肾脏置于冰上保存，直至开始NEVKP灌注。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 常温 离体 肾脏灌注（NEVKP）
<ol>
	<li>灌流回路的准备 
	灌流回路由新生儿体外循环设备组成（图2）。 
	<img alt="离体灌流示意图；注射器、输液泵、器官腔室；循环流动、氧合过程。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
	图2. 灌流回路示意图。 该回路由新生儿体外循环技术构成。灌流液收集于静脉储液器中。离心泵将液体泵入氧合器，在其中进行氧合并加热至37 °C。经过动脉气泡过滤器后，灌流液以60–80 mmHg的压力经肾动脉进入肾脏。静脉流出液（0–3 mmHg）将灌流液返回至静脉储液器。注射器和输液泵用于补充额外化合物。在整个灌流过程中收集尿液。持续记录灌流回路的各项参数。每小时采集动、静脉血气样本，并检测肾损伤标志物。
	<ol> 
		<li>将定制的灌流回路连接至肾脏灌流装置。</li>
		<li>将管路连接至静脉储液器和氧合器。将动脉管路连接至氧合器的动脉出口，并将气泡过滤器置于其支架中。连接排气管路。将静脉管路连接至静脉储液器的入口。</li>
		<li>为便于灌流期间监测，将温度探头插入动脉出口，将流量计和气泡传感器连接至动脉管路，并连接压力监测管路。连接液位传感器。</li>
		<li>将静脉和动脉采样管路分别连接至静脉和动脉采样端口。</li>
		<li>将器官腔室固定于支架上，并将静脉和动脉管路穿过预设孔洞引入。牢固地将管路固定在桌面和腔室上。</li>
		<li>将吸引管路插入滚压泵，并将一端置于腔室内以收集液体。</li>
		<li>将氧气管路连接至含有95% O2 / 5% CO2的气瓶和氧合器。将加热装置管路连接至氧合器和器官腔室。</li>
		<li>使用管夹关闭静脉和动脉流出管路。另用一个管夹夹闭静脉储液器的出口管路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌流液、附加补充剂的配制及回路预充
	<ol>
		<li>使用一台输液泵以乳酸林格液替代所产生的尿液。</li>
		<li>使用一台注射泵向静脉储液器中输注营养物质（葡萄糖0.5 ml/hr，氨基酸0.5 ml/hr）和胰岛素（5 IU/hr）。使用第二台注射泵直接向动脉管路中输注血管扩张剂（维拉帕米，0.25 mg/hr）。</li>
		<li>用灌流液填充静脉储液器。具体操作为：向静脉储液器中加入乳酸林格液（175 ml）、STEEN溶液（200 ml）、去氧水（27 ml）、肝素（1,000 IU）、碳酸氢钠（用于调节pH）和葡萄糖酸钙。最后加入洗涤红细胞（125 ml）。</li>
		<li>开启人工心肺机（HLM）。启动压力、温度、液位和气泡传感器面板。启动数据管理系统（DMS），以全程记录数据。开启加热装置，将灌流液和器官腔室加热至37 °C。打开O2供气。</li>
		<li>打开静脉储液器后方的管夹，并彻底排除离心泵头内的空气。以1,000 rpm启动离心泵，使液体在回路中循环。夹闭旁路动脉过滤器的管路，并排出动脉过滤器中的空气。</li>
		<li>校准压力监测管路。启动注射泵和输液泵。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肾脏移植物灌流
	<ol>
		<li>将肾脏从冰中取出，放置于器官腔室内的垫料上。将尿管插入尿液收集器中。确认静脉和动脉管路无气泡后，将连接器接入管路。</li>
		<li>关闭动脉与静脉管路之间的旁路。通过调节离心泵转速，将动脉压力设定为75 mmHg。</li>
		<li>使用DMS持续记录压力、动脉流量、温度及气泡情况。在整个灌流过程中密切观察各项数值。灌流期间，漏入腔室的血液通过吸引管路回收至静脉储液器。</li>
		<li>记录产生的尿量。每小时采集静脉血和尿液样本。通过检测动、静脉血气以及天冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸水平来监测灌流状态。</li>
		<li>灌流结束后，断开肾动脉和肾静脉处的管路，用冷HTK溶液冲洗移植物，并将其置于无菌器官袋中冰存，直至移植使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mortality+in+all+patients+on+dialysis%2C+patients+on+dialysis+awaiting+transplantation%2C+and+recipients+of+a+first+cadaveric+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant.</a> The New England journal of medicine. 341 (23), 1725-1730 (1999).</li>
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<li>Dittrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cold+storage+on+renal+ischemia+reperfusion+injury+after+non-heart-beating+donor+explantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Experimental+nephrology%22%5BJournal%5D)">Influence of cold storage on renal ischemia reperfusion injury after non-heart-beating donor explantation.</a> Nephron. Experimental nephrology. 96 (3), e97-e102 (2004).</li>
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<li>Hosgood, S. A., Patel, M., Nicholson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conditioning+effect+of+ex+normothermic+perfusion+in+an+experimental+kidney+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+surgical+research%22%5BJournal%5D)">The conditioning effect of ex normothermic perfusion in an experimental kidney model.</a> The Journal of surgical research. 182 (1), 153-160 (2013).</li>
<li>Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+transplantation+after+ex+vivo+normothermic+perfusion%3A+the+first+clinical+study.+American+journal+of+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22official+journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. American journal of transplantation.</a> official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 13 (5), 1246-1252 (2013).</li>
<li>Seldinger, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catheter+replacement+of+the+needle+in+percutaneous+arteriography%3B+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+radiologica%22%5BJournal%5D)">Catheter replacement of the needle in percutaneous arteriography; a new technique.</a> Acta radiologica. 39 (5), 368-376 (1953).</li>
<li>Stubenitsky, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exsanguinous+metabolic+support+perfusion--a+new+strategy+to+improve+graft+function+after+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Exsanguinous metabolic support perfusion--a new strategy to improve graft function after kidney transplantation.</a> Transplantation. 70 (8), 1254-1258 (2000).</li>
<li>Delpech, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+warm+ischaemia+combined+with+cold+preservation+on+the+hypoxia-inducible+factor+1%CE%B1+pathway+in+an+experimental+renal+autotransplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+journal+of+surgery%22%5BJournal%5D)">Effects of warm ischaemia combined with cold preservation on the hypoxia-inducible factor 1α pathway in an experimental renal autotransplantation model.</a> The British journal of surgery. , (1002).</li>
<li>Cypel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+ex+vivo+lung+perfusion+in+clinical+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation.</a> The New England journal of medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).</li>
<li>Knaak, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnormothermic+Ex+vivo+liver+perfusion+reduces+endothelial+cell+and+bile+duct+injury+after+DCD+pig+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+transplantation+%3A+official+publication+of+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases+and+the+International+Liver+Transplantation+Society%22%5BJournal%5D)">Subnormothermic Ex vivo liver perfusion reduces endothelial cell and bile duct injury after DCD pig liver transplantation.</a> Liver transplantation : official publication of the American Association for the Study of Liver Diseases and the International Liver Transplantation Society. , (2014).</li>
<li>Hosgood, S. A., Nicholson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+normothermic+perfusion+of+declined+human+kidneys+after+inadequate+in+situ+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+transplantation+official+journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Ex vivo normothermic perfusion of declined human kidneys after inadequate in situ perfusion.</a> American journal of transplantation official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 14 (2), 490-491 (2014).</li>
<li>Op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+normothermic+machine+perfusion+and+viability+testing+of+discarded+human+donor+livers%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+transplantation+official+journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers.</a> American journal of transplantation official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 13 (5), 1327-1335 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究表明，在猪模型中使用基于红细胞的溶液进行NEVKP可在较长时间内获得极佳的效果。在10小时&#160;ex vivo灌注期间，肾脏表现出稳定的灌注参数、活跃的肾代谢、良好的内环境稳态以及极轻微的肾损伤。
尿液生成和肾脏损伤取决于灌注液的成分。保持灌注液的胶体渗透压和渗透压在生理范围内至关重要。特别是，过低的胶体渗透压将导致非生理性的尿量增多，并伴随明显的肾水肿以及肾损伤标志物的升高。本模型中选用含白蛋白的 STEEN 溶液，以调节胶体渗透压并模拟肾脏的生理环境。向系统中添加碳酸氢钠和葡萄糖酸钙，以达到生理水平的 pH、HCO3、钠、钾、钙和氯。血管扩张剂的选择及其剂量至关重要，以确保充足的血流和氧气供应。
常温灌注技术 离体 肾脏灌注存在若干局限性。 离体 灌注并不涉及对肾脏的激素支持，这可能对较长时间的灌注产生不利影响。此外，目前这项新技术与较高的成本相关。未来的技术改进可能会简化设备并降低成本。便携式肾脏灌注装置的发展有望在未来完全避免肾脏的冷保存。
严重的器官长期短缺导致边缘器官（ECD 或 DCD 肾移植器官）的使用日益增加7。目前，器官保存主要依赖静态冷保存或低温机械灌注。由于长时间的冷缺血时间对符合标准标准的移植器官15以及边缘移植器官8,9的肾功能预后具有显著影响，因此，能够最大限度减少冷保存时间的新型保存技术备受关注16-19。
更广泛使用边缘供体器官的主要障碍在于无法在移植前评估器官的质量和活力。目前，仅依靠供体年龄、供体相关疾病以及移植物的热缺血时间等临床参数来决定器官是否可用于移植。通过在常温条件下保存移植物，可根据灌注特性和相关数据对其进行评估。肾血管流量、压力、肾内阻力、尿量、氧耗量以及肾脏损伤参数（如AST和乳酸）等实时参数，被认为可用于评估移植物活力的重要指标。
此外，NEVKP 期间活跃的代谢状态使得在移植前应用修复策略以改善边缘性肾移植物成为可能。例如，在保存期间通过抑制促炎通路、免疫调节、基因转移以及干细胞输注等技术对肾移植物进行修饰，有望成为改善受者预后的未来手段。

肾脏是最常进行移植的实体器官。对于终末期肾病患者而言，与透析相比，肾移植能够提供更长的预期寿命和更高的生活质量1-4。持续存在的器官短缺是移植医学领域面临的一个严峻问题（表1）&#160;5。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>美国*</td>
			<td>欧洲移植区**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待肾移植的患者人数</td>
			<td>101,563（2015年2月）</td>
			<td>10,689（2014年12月）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2014年完成的 deceased donor 肾脏移植数量</td>
			<td>10,650</td>
			<td>3,119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等待 deceased donor 肾移植的中位时间（年）</td>
			<td>最长5年*</td>
			<td>最长4年**</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 美国与Eurotransplant地区的肾脏移植供体短缺情况。
肾移植的预后受到等待时间的负面影响，接受长期透析的患者预后更差6。这促使人们关注边缘性肾移植物作为额外的供体来源，例如来自老年供体、合并多种并发症的供体（扩展标准供体，ECD）以及心脏死亡后捐献的肾脏（DCD）。过去可能被拒绝使用的边缘性供体肾脏，如今已被考虑用于移植7。
使用边缘性肾移植物的主要障碍在于冷缺氧保存技术。目前，肾移植物通常在冰上静态保存，或在4 °C无氧条件下进行灌注保存。这种冷缺氧保存技术在肾脏保存期间会导致持续的移植物损伤，并且由于缺乏代谢活动和尿液生成，无法对移植物功能进行评估。特别是边缘性肾移植物对冷保存耐受性差，导致显著的肾脏损伤以及较高的移植肾功能延迟恢复（DGF）发生率&#160;8,9。DGF是移植物长期功能不良的预后因素。
离体肾脏灌注是一种用于器官保存、评估和修复的替代方法。在猪模型中，灌注肾脏显示出有益效果 离体 在常温条件下10,112013年开展的首项临床试验表明，来自扩展标准供体的肾脏在移植前立即进行1小时的灌注，可降低延迟移植功能的发生率12.
本文介绍了一种常温下 离体 肾脏灌注（NEVKP）。本研究旨在将应用的冷缺血时间缩短至最低，并延长NEVKP的持续时间。NEVKP是一种替代性器官保存方法，旨在减少冷保存技术可能造成的损伤。

<table><tbody><tr><td>新生儿体外循环技术</td><td>SORIN GROUP Canada Inc（加拿大万锦）</td><td>定制</td><td>新生儿静脉储液袋 D100（500 ml，1/16）&quot; 流入和流出管路）、新生儿氧合器 D100、离心泵头（Revolution）、动脉端气泡滤器 D130</td></tr><tr><td>心脏肺机，St&amp;ouml;ckert S3</td><td>SORIN GROUP Canada Inc（加拿大万锦）</td><td>定制制作</td><td>离心泵、滚压泵、控制面板（含压力、流量、温度、气泡和液位传感器）、氧气混合器、加热装置</td></tr><tr><td>导管</td><td>SORIN GROUP Canada Inc（加拿大万锦）</td><td>01906BPC SG XS</td><td>3/16&quot; x 1/16&quot;</td></tr><tr><td></td><td></td><td>019071PC SG XS</td><td>1/4&quot; x 1/16&quot;</td></tr><tr><td></td><td></td><td>019060PC SG XH</td><td>3/8&quot; x 1/16&quot;</td></tr><tr><td>管路连接器</td><td>SORIN GROUP Canada Inc（加拿大万锦）</td><td></td><td>不同尺寸</td></tr><tr><td>STEEN 溶液</td><td>XVIVO (G&amp;ouml;哥德堡，瑞典</td><td>19004</td><td>200 ml</td></tr><tr><td>乳酸林格氏液</td><td>Baxter（加拿大安大略省密西沙加）</td><td>JB2324</td><td>175 ml</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Hospira（Montr&amp;eacute;魁北克省，加拿大</td><td>6625050</td><td>pH依赖性</td></tr><tr><td>葡萄糖酸钙</td><td>加拿大制药合作伙伴公司（安大略省，列治文山）</td><td>C31110</td><td>钙依赖性</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sandoz Canada Inc (Toronto, ON, CAN)</td><td>10750</td><td>1,000 IU</td></tr><tr><td>氨基酸和葡萄糖，Travasol 10%</td><td>Baxter（加拿大安大略省密西沙加）</td><td>JB6760</td><td>1 ml/小时</td></tr><tr><td>速效胰岛素，Novorapid</td><td>诺和诺德加拿大公司（密西沙加，安大略省，加拿大）</td><td>DS6H748</td><td>5 IE/hr</td></tr><tr><td>维拉帕米</td><td>Sandoz Canada Inc (Quebec, QC, CAN)</td><td>52216</td><td>0.25 mg/小时</td></tr></tbody></table>

常温 离体 移植前用于保存肾移植物的肾脏灌注

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

肾移植已成为终末期肾功能衰竭患者的一种成熟治疗选择。器官短缺问题依然严峻。因此，器官捐献者的接受标准已逐步放宽，导致边缘性肾移植物的使用增加。这些边缘性器官对冷保存耐受性较差，导致保存损伤加重以及移植物延迟功能恢复的发生率升高。为克服冷保存的局限性，大量研究正致力于探索替代性的常温保存方法。
离体 常温器官灌注是一种创新的保存技术。最早的实验和临床试验用于 离体 肺、肝和肾灌注显示出良好的结果。
除了减少冷缺血损伤外，常温肾脏保存方法还提供了器官评估与修复的机会。本文提供了关于肾脏获取、器官保存技术以及离体灌注的相关信息。 离体 在猪模型中进行常温肾脏灌注（NEVKP）。展示了手术技术、灌注液与灌注回路的准备、潜在的评估方法及典型结果。

以下展示了六项采用心跳状态下肾脏获取模型的实验结果。在 原位 灌注与肾脏获取后，移植物在冰上保存3小时（SCS），同时制备红细胞。在临床情境下，该过程模拟了器官获取及修整台准备所需的时间。NEVKP持续进行10小时。
为维持生理条件并模拟一种 体内 肾脏周围环境，器官腔室应加热并密封。灌注液和尿液置换液的血气分析、胶体渗透压和渗透压应代表生理值。正常值（基线值）来自约克夏猪 原位，分别位于各图注中（图3 - 13). NEVKP 的目的是确保移植物获得充足的氧气和营养供应。由于缺血会引起血管收缩，从而增加肾内阻力，因此在稳定压力下实现恒定的灌注流量是判断氧合是否充分的良好指标。当移植物温度达到目标值时 37 °C 通过SCS后对器官进行复温即可达到，整个灌注过程中流量值和肾内阻力在约60-80 mmHg的恒定生理压力下保持稳定图3和图4）。尿液生成量主要取决于灌注液的成分（图5).
动静脉血氧分压的每小时测量2 揭示肾脏的代谢活性。氧消耗量通过以下公式计算：((pO2艺术 – pO2ven) × 流速 / 重量) (图6) 14灌流期间的 pH 和 HCO₃⁻3，且电解质稳定，无需干预措施（图7 - 10）。实时AST和乳酸测定用于监测细胞损伤。在NEVKP期间未检测到细胞损伤参数的升高（图11和图12）。灌注液的渗透压稳定（图13）。组织学评估显示轻微变化（图14 - 16).
<img alt="流速随时间变化的误差棒图；对10小时内数据变异性的统计分析" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 平均动脉血流量（ml/min）及标准差。 在整个灌注过程中，流速保持在生理范围内。猪的生理数值，经测量 原位：平均动脉流量：170 ± 57 ml/min（范围 83 – 325 ml/min）。
<img alt="显示IRR随时间变化的图表；包含误差条；药代动力学研究中的动力学数据分析。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 肾内阻力（IRR），均值与标准差（mmHg/ml/min）。 平均动脉压（MAP）在60至80 mmHg之间保持恒定。肾内阻力持续低于0.5 mmHg/ml/min。
<img alt="随时间变化的尿量图表，带误差线，显示10小时内的每小时毫升数。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 总尿量，均值与标准差（ml）。 总尿量主要取决于灌注液的成分。胶体渗透压和渗透压越高，尿液生成量越低。
<img alt="耗氧量随时间变化图；用于测量代谢率，显示方差分析的误差线。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 耗氧量，均值与标准差（ml/min/g）。
<img alt="10小时内静脉血pH稳定性图，显示误差条；生化数据分析" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. 静脉血pH值，均值与标准差。 pH在未给予碳酸氢盐的情况下仍保持在生理范围内稳定。猪的生理数值，经测量 原位pH 7.46 ± 0.06（范围 7.34 – 7.63）。
<img alt="HCO3- 浓度稳定图；误差条；测量持续10小时。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
图8. HCO3 静脉血，均值和标准差（mmol/L）。 HCO3 保持在生理范围内，无需给予碳酸氢盐。猪的生理值，经测量 原位HCO3 30.3 ± 2.4 mmol/L（范围 21.6 – 35.8 mmol/L）。
<img alt="随时间变化的钠浓度图；误差条；数据分析；Na+ 稳定性研究；线形图。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 9"> 
图 9. 静脉血钠浓度，均值与标准差（mmol/L）。 钠浓度保持在生理范围内。原位测得的猪生理数值：137.1 ± 3.8 mmol/L（范围 118.7 – 140.9 mmol/L）。
<img alt="钾离子浓度稳定性图表；时间（小时）与 K+（mmol/L）；误差线，数据分析。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图10"> 
图10. 静脉血钾离子浓度，均值与标准差（mmol/L）。 钾离子浓度在生理范围内保持稳定。原位测量的猪生理数值：3.85 ± 0.46 mmol/L（范围 3.5 – 5.36 mmol/L）。
<img alt="AST酶活性随时间变化的曲线图、误差棒、酶动力学研究中的数据分析" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig11.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图11"> 
图11. 静脉血天冬氨酸氨基转移酶，均值与标准差（AST；U/L）。 在 离体 常温肾脏灌注过程中，AST 可作为细胞损伤标志物。在整个灌注期间，AST 值均较低。
<img alt="乳酸浓度随时间变化曲线图，以 mmol/L 为单位测量，持续 10 小时，突出显示变化趋势。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig12.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图12"> 
图12：乳酸，均值与标准差（mmol/L）。 在 离体 常温肾脏灌注中，乳酸代表细胞损伤标志物。其数值在灌注过程中保持稳定。
<img alt="血清渗透压随时间变化图，显示10小时内渗透压水平保持稳定，并带有误差线。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig13.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图13"> 
图13：血清渗透压的平均值与标准差（mosm/L）。 灌注液中稳定的渗透压可维持较低但恒定的尿液生成。原位测得的猪生理值：282 ± 1.7 mosm/L（范围 279 – 283 mosm/L）。
<img alt="显微镜下的肾脏组织病理学；细胞结构，病理学研究，分析。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig14.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图14"> 
图14：组织学（H&amp;E染色）。皮髓质交界处的50倍/200倍放大图像，显示轻度肾小管空泡变性，无坏死迹象。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52909/52909fig14large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学示意图；肾脏组织，放大倍数，细胞结构分析，显微镜检查。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig15.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图15"> 
图15：组织学（PAS染色）。 皮髓质交界处的50X / 200X放大图像，显示轻度肾小管空泡变性，未见坏死迹象。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52909/52909fig15large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学显微镜、肝脏组织、细胞结构、染色切片、病理分析。" src="/files/ftp_upload/52909/52909fig16.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图16"> 
图16：组织学（TUNEL染色）。 25倍/200倍放大。极少数情况下可见细胞核被染色，表明凋亡率极低。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52909/52909fig16large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

严重的器官短缺导致边缘性肾移植供体的使用日益增加。这引发了人们对替代保存方法的兴趣，因为边缘性移植物尤其不耐受冷保存。常温灌注技术 离体 肾脏灌注（NEVKP）代表了一种在肾移植前对移植肾进行保存的新型方法 &#160;移植

肾移植已成为终末期肾功能衰竭患者的一种成熟治疗选择。器官供体的持续短缺仍然是一个……

本方案的总体目标是在移植前，于体外将肾脏移植物维持在正常的生理温度条件下。首先对供体肾脏的肾血管进行插管，然后将移植物连接至循环系统，并在常温条件下进行灌注。最终通过监测肾脏的损伤功能参数和组织学情况，以确定移植物是否适合移植。与现有的保存方法（如静态冷保存或低温机械灌注）相比，该技术的主要优势在于，常温机械灌注可在移植前避免标准或扩展标准供体移植物发生冷缺血性损伤。在完全游离供体的主动脉和下腔静脉后，于肾动脉分支头侧的主动脉周围穿过一根结扎线，随后在髂动脉分叉头侧放置两根结扎线。在髂动脉分叉上方远端的下腔静脉周围穿过一根结扎线，并在左肾动脉周围放置一根结扎线。然后游离右肾与其周围粘连组织，解剖肾静脉、肾动脉和输尿管。接着切开膈肌，按每千克供体体重1000国际单位的剂量将肝素注入心脏。采集血液时，将CPDA血袋的管路连接至左侧颈静脉导管。结扎左侧肾动脉、主动脉和下腔静脉，并在髂动脉分叉上方置入主动脉插管进行灌注。立即以100厘米H2O的压力用HTK溶液冲洗肾脏，同时在肾静脉下方剪开腹腔下腔静脉，以确保充分灌注。同时夹闭胸腔腔静脉，并通过颈静脉导管收集血液。当肾脏完全灌注冲洗后，连同一段主动脉一并取下移植肾，切断肾静脉，并保留较长的输尿管。随后用结扎线闭合主动脉的头端，并在远端使用一个直径1/4英寸×3/8英寸的减径接头进行插管。然后使用一个1/4英寸转3/8英寸的减径接头直接插管肾静脉。用8 Fr的饲管插管输尿管，并将肾脏置于冰上。开始灌注前，将自制的灌注回路连接至肾脏灌注装置。接下来，将器官腔室放置在支架上，并将静脉和动脉导管通过预先准备好的孔洞引入。固定导管后，将吸液管连接至静脉储液器，并将另一端置于腔室内，以收集渗漏的灌注液。使用导管夹关闭静脉和动脉的流出管路，以及静脉储液器的流出管路。使用输液泵将产生的尿液替换为乳酸林格液。在整个灌注过程中，根据产生的尿量，使用一台注射泵将营养液和胰岛素注入静脉储液器，另一台注射泵将血管扩张剂直接注入第九动脉管路。此时，也将灌注液注入静脉储液器中。然后启动人工心肺机的管路开关，并开启压力、温度、液位和气泡传感器面板。启动数据管理系统，以记录灌注过程中的数据，并启动加热装置，将灌注液和器官腔室加热至37摄氏度。打开氧气供应和静脉储液器后方的管夹，以彻底排除离心泵头内的空气。随后将离心泵启动至1000转/分钟，使溶液在管路系统中循环。夹闭旁路动脉过滤器的管路，以排出动脉过滤器内的空气。最后，在洗净的红细胞达到125毫升时将压力管路归零，并在管路完成预充后启动注射器和输注泵。将肾脏从冰上转移至器官腔室的垫层中，并将尿管插入尿液收集器。确保静脉和动脉管道中无气泡后，将连接器插入管路。然后关闭动静脉管路之间的短路，将动脉压力设定为75毫米汞柱。使用数据管理系统持续记录动脉压力、血流、温度及气泡情况，并在灌注过程中密切观察各项数值。每小时记录产生的尿液量，并收集静脉血和尿液样本，以监测器官在灌注期间的功能；同时获取静脉和动脉血液样本，进行血气、天冬氨酸氨基转移酶及乳酸分析。灌注结束时，断开与肾动脉和肾静脉连接的管路。用冷HTK冲洗移植物，并将肾脏置于无菌器官袋中的冰上保存，直至移植。常温离体肾灌注的目的是确保在灌注期间移植物获得充足的氧气和营养供应。事实上，在通过复温使移植器官达到目标温度37摄氏度后，经过3小时的冰上保存，灌注过程中的血流值和肾内阻力保持稳定，整个灌注期间维持约70毫米汞柱的恒定生理压力。尿液生成量主要取决于灌注液的成分。尽管动静脉血氧分压的每小时监测可证实灌注期间肾脏的代谢活性，但pH值、碳酸氢盐和电解质也保持稳定，无需干预。实时检测天冬氨酸转氨酶和乳酸水平可用于监测细胞损伤。在常温离体肾脏灌注期间，若未观察到这些细胞损伤指标升高，则灌注液的渗透压也保持稳定。此外，组织学结果显示，该处理后的组织仅呈现轻微的炎症变化和极低的凋亡率。一旦掌握，该技术可作为肾移植器官保存的一种替代方法，为移植前的器官评估与修复提供更多的选择。

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