Name: Hemogenic内皮细胞直接诱导和血液中转录因子在人多能干细胞表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 了解利用转录因子强制表达从人多能干细胞高效诱导生血内皮和多能造血祖细胞的方法。该技术可在体外观察内皮向造血转化过程，为研究造血发育和转录调控提供可靠模型。

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感谢 Matt Raymond 提供的编辑协助。本工作获得了美国国立卫生研究院（U01HL099773、R01HL116221 和 P51 RR000167）以及 Charlotte Geyer 基金会的资金支持。

1. 病毒制备与转录因子组合
<ol>
	<li>使用含有ETV2、GATA1、GATA2、TAL1和LMO2蛋白编码DNA的pSIN-EF1α慢病毒表达质粒制备溶液（表1）。</li>
	<li>通过分光光度计在230 nm、260 nm和280 nm处测定吸光度，测量用于慢病毒生产的质粒制备物的浓度和纯度。注意：A260/280和A260/230值均大于1.8的DNA制备物通常被认为是高质量的。较低的A260/280值可能提示存在蛋白质污染，而较低的A260/230&#160;值则提示存在盐类或苯酚等溶剂杂质。推荐的质粒浓度为1–3 µg/µl。</li>
	<li>按照先前发表的方案11生产用于转导的慢病毒。诱导具有泛髓系潜能的造血内皮细胞（HE）需要共表达ETV2与GATA1，或ETV2与GATA2。诱导具有红系和巨核细胞潜能的HE则需要GATA2与TAL1。在GATA2和TAL1存在的情况下，加入LMO2可显著提高人多能干细胞（hPSCs）向红-巨核细胞系分化细胞的产量10。</li>
</ol>
2. hPSCs 培养方案
<ol>
	<li>在传代前，将多能干细胞培养至70-80%融合度，形成边缘清晰的紧密克隆。传代前标记并去除自发分化的克隆。</li>
	<li>根据制造商说明稀释商用细胞外基质凝胶（见表2），并在使用前于4 °C过夜包被6孔板，或于37 °C孵育至少1小时。细胞传代前，吸除基质，每孔加入2 ml新鲜的商用完全培养基（见表2），将培养板置于37 °C、5% CO2 环境中，直至细胞准备接种。</li>
	<li>传代hPSCs
	<ol>
		<li>吸除含hPSCs的6孔板中一个融合孔的培养基，加入1.5 ml预热的Dispase II溶液（2 mg/ml，溶于DMEM/F12，经0.22 µm滤器过滤除菌）。在37 °C、5% CO2 条件下孵育5-7分钟，直至克隆边缘开始从表面脱离。</li>
		<li>吸除Dispase II溶液，用2 ml新鲜DMEM/F12培养基轻柔洗涤克隆两次（加入后立即吸除）。随后使用5 ml玻璃血清移液管，加入3 ml新鲜商用完全培养基（见表2），反复吹打数次以解离hPSCs。</li>
		<li>将0.5 ml细胞悬液加入含有1.5 ml商用完全培养基（见表2）的6孔板各孔中。将培养板前后、左右轻轻摇晃数次，以确保细胞均匀分布，然后放入培养箱。于37 °C、5% CO2 条件下培养18-24小时。</li>
		<li>次日更换为新鲜商用完全培养基（见表2），并观察hPSCs形态。成功传代应形成小而贴壁良好、保持hPSC形态的克隆。hPSCs需每日每孔补充2.5-3 ml新鲜培养基，并在每4-5天、融合度不超过70-80%时进行传代。 
		注意：若hiPSCs原在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上维持培养，则需转移至无饲养层条件，并传代2-3次后再进行转导，以确保高效分化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从人多能干细胞诱导造血内皮前体细胞（第0天，人多能干细胞的转导）
<ol>
	<li>制备反应体系时，将1.3 ml商用完全无血清培养基（参见 表 2），病毒，polybrene，以及Y27632 ROCK抑制剂（表1加入1.3 µl 10 mM ROCK抑制剂至1.3 ml培养基中，终浓度为10 μM，并加入polybrene至终浓度6 µg/ml。
	<ol>
		<li>按每种病毒每个细胞0.5–1.0 MOI（感染复数）的终浓度，加入适量的病毒浓缩液。在单细胞悬液准备好之前，将反应液置于冰上或4 °C保存。 
		注意：在 GATA1/ETV2、GATA2/TAL1 和 GATA2/TAL1/LMO2 反应体系中，每种病毒使用相同 MOI 值对于诱导分化最为理想。然而，在 ETV2/GATA2 转导的培养物中，相对于 ETV2 将 GATA2 的 MOI 值加倍可增强分化效果。因此，对于这些培养物，推荐 ETV2 与 GATA2 的 MOI 比例为 1:2（ETV2 为 1 MOI，GATA2 为 2 MOI）例如 若病毒浓缩液的浓度估计约为 6.8 x 107 颗粒/ml，向 0.68 × 10⁶ 个细胞中加入 10 µl ETV2 和 20 µl GATA2 病毒浓缩液6 每个ETV2/GATA2反应使用一个6孔板中的35 mm孔，每孔细胞数</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将hPSCs制备成单细胞悬液。
	<ol>
		<li>在无饲养层条件下培养人多能干细胞（hPSCs），具体操作如第2节所述。在末次传代后的第4天，在倒置显微镜下观察细胞密度和形态。hPSCs应形成边界清晰、排列紧密的克隆，无自发分化现象，并在转导当天达到约60–70%的融合度。</li>
		<li>吸弃培养基，加入 1.5–2 ml 商业细胞解离试剂（表1每孔加入，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 5-7 分钟。</li>
		<li>将细胞收集到等体积的商用完全培养基中（参见 表2) 加入10 µM ROCK抑制剂，计数细胞并测定活力。以200 × g离心5分钟沉淀细胞，然后将细胞重悬于含10 µM ROCK抑制剂的商用完全培养基中，调整细胞浓度至3.4–5 × 106 每毫升细胞数 
		注意：细胞活力对于成功的病毒转导及后续分化至关重要。通常，转导前的细胞活力应超过90%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入200 µl细胞悬液，其中含有0.68–1×10⁶6 细胞，加入到3.1中制备的1.3 ml反应液中</li>
	<li>从2.2步骤中准备的过夜包被的6孔板中吸出基质溶液，将反应混合物转移至6孔板的一个孔中，并均匀分布细胞。在37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 孵育24小时。24小时后，至少80%的细胞应贴附于基质上。</li>
</ol>
4. 从人多能干细胞诱导造血内皮前体细胞（第1-7天）
<ol>
	<li>转导后24小时，移除含病毒的培养基，并用商品化的不完全细胞培养基（见表1）洗涤贴壁细胞，然后每孔加入3 ml含有造血细胞因子的商品化不完全细胞培养基：SCF 100 ng/ml、TPO 50 ng/ml、bFGF 20 ng/ml（以下简称3F培养基）。</li>
	<li>在第2、3和第4天更换全部培养基为新鲜的3F培养基，以去除死亡细胞和碎片。第4天后，当出现悬浮的造血细胞时，每隔一天更换一半的3F培养基，同时保持总体积为4 ml。 
	注意：pSIN-EF1α慢病毒表达质粒含有嘌呤霉素抗性基因，因此可用于转导细胞的阳性筛选。可在分化开始的前1–2天在培养基中加入1 μg/ml嘌呤霉素，以清除残留的未分化hPSCs。</li>
	<li>第4天在倒置显微镜下观察细胞形态：开始出现具有典型内皮细胞形态的紧密细胞簇（图2A、图3A）。圆形血细胞从分化第5天至第7天出现，而某些区域可能仍保留hPSCs形态。按以下方法分析HE细胞及造血分化情况。 
	注意：成功的造血内皮分化会产生折射性强的圆形细胞，这些细胞松散地附着于底层扁平的内皮细胞上。这些细胞活跃增殖并形成小的细胞团，最终脱离并悬浮于培养基中（图2A和图3A）。活的血细胞可根据其在培养条件下对光线的反射能力以及细胞扩张状态，与死亡或濒死细胞进行肉眼区分。</li>
</ol>
5. 血源性内皮（HE）分化阶段的分析。
<ol>
	<li>通过显微镜观察细胞内皮样形态，在分化第3至第4天检测造血内皮（HE）的形成。在此分化阶段，培养物中无悬浮的血细胞。可通过使用VE-cadherin、CD73、CD226和CD43抗体进行免疫荧光染色及流式细胞术分析，确认HE的存在。
	<ol>
		<li>为通过流式细胞术分析评估HE形成，取自同一实验的第3天和第4天的细胞。将培养物在37 °C、5% CO2条件下，用商业细胞解离试剂（见Table 1）孵育5–10分钟以收集细胞，每项染色反应使用最多1 × 105个细胞（流式细胞术染色步骤详见12）。 
		注意：VE-cadherin+的HE细胞表达早期造血标志物CD226，但不表达CD73和CD436。相反，非HE细胞表达CD73（图2B、图3B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人多能干细胞（hPSC）来源的HE的免疫荧光染色。
	<ol>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁的单层细胞，然后在室温下用4%多聚甲醛固定30至60分钟。</li>
		<li>再次用PBS洗涤细胞，然后在室温下用含0.1% Triton X-100的PBS通透20分钟。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞2至3次，随后在阻断缓冲液（含10%胎牛血清（FBS）的PBS）中孵育30至120分钟。</li>
		<li>配制含两种一抗的染色液：将小鼠抗人CD43和兔抗人VE-cadherin抗体按1:1,000稀释于含5% FBS的PBS中（Table 1）。</li>
		<li>吸除细胞上的阻断缓冲液，每孔加入1 ml含一抗的染色缓冲液；在室温下孵育3小时，或4 °C过夜。</li>
		<li>用含5% FBS的PBS洗涤细胞三次。</li>
		<li>配制第二步染色缓冲液：将驴抗兔二抗（绿色荧光染料标记）和抗小鼠二抗（红色荧光染料标记）按1:500稀释于含5% FBS的PBS中（Table 1）。每孔加入1 ml二抗染色缓冲液，在室温下孵育1小时。</li>
		<li>用不含血清的PBS洗涤三次。用dH2O中300 nM DAPI工作液染色10–15分钟。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞两次，每孔加入2–3 ml PBS。使用绿色、红色和蓝色显微镜滤光片观察荧光信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 诱导造血前体细胞的分析
<ol>
	<li>维持分化培养，直至悬浮细胞显著扩增，持续培养 10–14 天，每两天更换一半的 3F 培养基（更换方法见 3.1 节）。</li>
	<li>使用商用细胞解离试剂（见表 1）在 37 °C、5% CO2 条件下处理细胞 5–10 分钟，以解离并收集正在分化的单层细胞。</li>
	<li>使用抗 VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）、CD43 和 CD45 抗体进行流式细胞术，以评估培养物中的造血情况12。需注意，大量细胞（高达经 ETV2 和 GATA2 转导的细胞的 40%）共表达 VE-cad 和 CD43。以下抗体可用于检测诱导产生的血细胞前体扩增或分化后特定细胞谱系的表达：CD235a（红系细胞）、CD41a（巨核细胞系）、CD32（所有类型的髓系细胞）、CD66b（中性粒细胞）和 CD163（巨噬细胞）。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用商用克隆形成培养基（表 1）进行集落形成细胞（CFC）实验。
	<ol>
		<li>将 1–2 × 104 个细胞转移至 3 ml 商用克隆形成培养基中（见表 3），以评估集落形成细胞的数量及造血集落的类型。最佳接种密度应能确保识别和分离独立生长、互不重叠的单个集落。接种密度可根据分化效率在不同实验间有所调整，但每 1 ml 商用克隆形成培养基中接种的细胞数不应超过 1 × 104 个。</li>
		<li>用轻柔涡旋混匀细胞与商用克隆形成培养基的混合液，将 3 ml 悬液分装至两个 35 mm 超低吸附培养皿中用于 CFC 实验，每皿加入 1.5 ml 悬液。均匀分布培养基后，在 37 °C、5% CO2 条件下培养 14 天。避免扰动培养皿，并在实验第 7 天和第 10 天观察集落形成情况。</li>
		<li>在第 14 天根据集落形态识别并计数造血集落。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

I.S. 是 Cynata 的创始股东和顾问。

上述通过过表达转录因子实现人多能干细胞（hPSCs）向造血方向分化的方案，是一种快速且高效的方法，可用于从人胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）生成造血内皮细胞（HE）以及髓系和红-巨核系祖细胞，从而实现由一百万个未分化干细胞产生多达三千万个血细胞10。该方法在多种hESC和iPSC细胞系中均表现出稳定的分化效率10。在ETV2与GATA2、GATA1因子，以及GATA2与TAL1因子诱导的分化过程中，细胞会形成具有造血能力的内皮细胞，即造血内皮（HE），并经历由内皮向造血细胞转变的过程。造血内皮（HE）的形成通常出现在分化第3至第4天。在GATA2与TAL1组合基础上加入LMO2（TAL1的转录共因子），可显著增强分化的稳健性，同时使HE阶段明显缩短。
转录因子介导的人多能干细胞定向分化成功与否主要取决于以下三个因素：（i）将核酸有效递送至细胞内；（ii）基因操作后细胞的存活率；（iii）细胞内外源转录本的有效翻译。
所述方法的关键步骤之一是有效慢病毒颗粒的制备...

人类多能干细胞（hPSCs）具有自我更新能力，并可分化为三胚层来源的细胞，包括血液细胞，因此成为研究造血发育机制、血液疾病建模、药物筛选、毒性研究以及细胞治疗开发的宝贵工具。由于胚胎中的血液生成由生血性内皮（HE）通过内皮-造血转化过程实现1,2，在体外培养中生成HE对于研究调控内皮向造血转化及造血特化过程的分子机制至关重要。目前研究HE的方法主要包括：在添加造血细胞因子的细胞聚集体（EBs）中诱导血液-内皮共同分化3-5，将hPSCs与支持造血的基质细胞共培养6,7，或在含有细胞外基质和细胞因子的二维培养体系中进行诱导8,9。这些经典分化方法依赖于外源信号作用于细胞表面，启动一系列分子通路级联反应，最终激活指导血液-内皮发育的转录程序。因此，这些体系中hPSCs分化的效率取决于这些信号的有效诱导、信号向细胞核的转导，以及特异性转录调控因子的继而激活。此外，在传统分化培养体系中研究HE通常还需通过细胞分选技术额外分离HE细胞。本文介绍一种通过过表达造血转录因子直接诱导HE和血液细胞的简便方案。该方法可在培养皿中高效诱导HE生成，并可直接观察内皮向造血转化过程，无需借助繁琐的细胞分选步骤来分离HE细胞。
通过过表达少数几个转录因子（TFs），可高效诱导人多能干细胞形成内皮-造血双潜能细胞（HE）和血液细胞。能够从人多能干细胞（hPSCs）诱导强效全髓系造血的最优转录因子组合包括ETV2与GATA1或GATA2。相比之下，GATA2与TAL1的组合则诱导红系-巨核系造血10。通过过表达这些因子对hPSCs进行重编程，可直接将其分化为VE-cad+CD43-CD73-的HE细胞，这些细胞随后逐步获得由早期造血标志物CD43表达所定义的造血表型7。这种基于慢病毒的直接重编程人多能干细胞的方法，适用于开展机制研究、内皮细胞向造血细胞转变过程的研究，以及造血发育与命运决定的转录调控研究。尽管当前方案描述的是利用转基因的组成型表达来生成血液细胞，但使用修饰后的mRNA也可获得类似结果10。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;始终&quot;&gt;&lt;strong&gt;表1.&lt;/strong&gt; &lt;strong&gt;利用转录因子诱导人多能干细胞分化并分析生血性内皮细胞与血细胞&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>质粒 #61061</td><td>慢病毒载体</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>质粒 #61063</td><td>慢病毒载体</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>质粒 #61062</td><td>慢病毒载体</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>质粒 #61062</td><td>慢病毒载体</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>质粒 #61064</td><td>慢病毒载体</td></tr><tr><td>六亚甲基溴化铵（Polybrene）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>用于提高感染效率的阳离子聚合物</td></tr><tr><td>Y-27632（盐酸盐）ROCK 抑制剂</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>RHO/ROCK 信号通路抑制剂 抑制 ROCK</td></tr><tr><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>A11105-01</td><td>细胞解离试剂</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>不完全（无生长因子）培养基&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; mTeSR1 定制配方&amp;nbsp;</td><td>WiCell 研究所（美国威斯康星州麦迪逊市）</td><td>MCF</td><td>&lt;a 名称=&quot;RANGE!D12&quot;&gt;无 bFGF 和 TGFb 的无血清 mTeSR1 培养基&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>人源 SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>优质级</td></tr><tr><td>人 TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>科研级</td></tr><tr><td>人碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>优质级别</td></tr><tr><td>CD144（VE-钙黏蛋白）FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>内皮标志物（流式细胞术）</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>造血（FACS）</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560199</td><td>造血（FACS）</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R&amp;amp;D 系统</td><td>FAB5795A</td><td>内皮细胞标志物（流式细胞术）</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>造血（FACS）</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>活细胞/死细胞检测（流式细胞术）</td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>细胞固定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML&amp;nbsp;</td><td>透化&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>用于免疫荧光（IF）染色的纯化初级抗体</td></tr><tr><td>兔抗人 VE-钙黏蛋白</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>初级（IF）</td></tr><tr><td>抗兔 Alexa Fluor 488 标记</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>二抗（IF）</td></tr><tr><td>抗小鼠 Alexa Fluor 594 标记</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&amp;nbsp;</td><td>二抗（IF）</td></tr><tr><td>DAPI 核酸染色剂</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>D1306&amp;nbsp;</td><td>活细胞/死细胞检测（免疫荧光）</td></tr><tr><td>克隆形成培养基 MethoCult H4435 Enriched</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>4435</td><td>集落形成细胞实验</td></tr><tr><td>Wright染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32857</td><td>染色细胞离心涂片</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;在发育过程中，造血细胞起源于一类特殊的内皮细胞，即生血内皮（hemogenic endothelium, HE）。在体外建立HE发育的模型，对于研究内皮-造血转变及造血特化的分子机制至关重要。本文介绍了一种通过过表达不同组合的转录因子，高效诱导人多能干细胞（hPSCs）生成HE的方法。使用ETV2与GATA1或GATA2转录因子的组合可诱导产生具有广谱髓系潜能的HE，而GATA2与TAL1转录因子的组合则可生成具有红系和巨核系潜能的HE。在GATA2和TAL1的基础上加入LMO2可显著加速分化进程，并提高红系和巨核系细胞的产量。该方法为从hPSCs高效、快速地诱导HE提供了有效手段，并可在培养皿中实现对内皮-造血转变过程的观察。本实验方案包括hPSCs的转导操作及转导后对HE和血液前体细胞的分析流程。&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;始终&quot;&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;始终&quot;&gt;&lt;strong&gt;表2.&lt;/strong&gt; &lt;strong&gt;hPSCs 培养&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人类多能干细胞（hPSCs）&amp;nbsp;</td><td>WiCell 研究所（美国威斯康星州麦迪逊市）</td><td>hESCs（WA01、WA09）人胚胎干细胞；iPSCs（DF-19-9-7T、DF-4-3-7T）无外源基因诱导多能干细胞</td><td>人多能干细胞（hPSCs）具有自我更新能力，并可分化为三个胚层的细胞</td></tr><tr><td>hPSCs 培养用完全无血清培养基&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; mTeSR1 培养基&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>WiCell 研究所（美国威斯康星州麦迪逊市）</td><td>M500&amp;nbsp;</td><td>无血清&amp;nbsp; 用于无饲养层培养ESC/iPSCs的含生长因子培养基</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD 生物科学 / 康宁&amp;nbsp;</td><td>356234</td><td>人ESC/iPSC维持用培养基</td></tr><tr><td>DMEM/F-12，粉末&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>12500-062</td><td>基础培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's PBS 粉剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Dispase II，粉末</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>17105-041</td><td>中性蛋白酶，细胞解离</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;在发育过程中，造血细胞起源于一类特殊的内皮细胞，即生血内皮（hemogenic endothelium, HE）。在体外建立HE发育的模型，对于研究内皮-造血转变及造血特化的分子机制至关重要。本文介绍了一种通过过表达不同组合的转录因子，高效诱导人多能干细胞（hPSCs）生成HE的方法。使用ETV2与GATA1或GATA2转录因子的组合可诱导产生具有广谱髓系潜能的HE，而GATA2与TAL1转录因子的组合则可生成具有红系和巨核系潜能的HE。在GATA2和TAL1的基础上加入LMO2可显著加速分化进程，并提高红系和巨核系细胞的产量。该方法为从hPSCs高效、快速地诱导HE提供了有效途径，并可在培养皿中观察内皮-造血转变过程。本实验方案包括hPSCs的转导操作及转导后对HE和血液前体细胞的分析。&quot; fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot; fo:keep-with-previous.within-page=&quot;始终&quot;&gt;&lt;strong&gt;表3.&lt;/strong&gt; &lt;strong&gt;用于检测病毒基因组整合的引物。&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;正向（Fwd）&amp;nbsp; 5&amp;rsquo; --&gt;3&amp;rsquo;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;反向（Rev）5&amp;rsquo;--&gt;3&amp;rsquo;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;描述&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA</td><td>--</td><td>EF1a 启动子序列</td></tr><tr><td>GATA1 反向引物</td><td>--</td><td>TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td><td>&amp;nbsp;编码区&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GATA2 反向引物</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td><td>&amp;nbsp;编码区&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TAL1 反向引物</td><td>--</td><td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&amp;nbsp;编码区&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LMO2 反向引物</td><td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td><td>&amp;nbsp;编码区&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ETV2 反向引物</td><td>--</td><td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;编码区&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

在发育过程中，造血细胞起源于一类特化的内皮细胞，即生血性内皮（hemogenic endothelium, HE）。对生血性内皮发育的建模研究 体外 对于内皮-造血转换及造血特化机制的研究至关重要。本文介绍了一种通过过表达不同组合的转录因子，高效诱导人多能干细胞（hPSCs）生成造血内皮（HE）的方法。使用ETV2与GATA1或GATA2转录因子的组合可诱导具有泛髓系潜能的HE，而GATA2与TAL1转录因子的组合则可生成具有红系和巨核系潜能的HE。在GATA2和TAL1组合基础上加入LMO2可显著加速分化过程，并提高红系和巨核系细胞的产量。该方法为从hPSCs高效、快速地诱导HE提供了有效途径，并可在培养皿中观察内皮-造血转换过程。本方案包括hPSCs的转导操作及转导后对HE和血液前体细胞的分析流程。

过表达转录因子诱导人多能干细胞分化为造血细胞和血液细胞的示意图如图所示 图1. ETV2 与 GATA1 或 GATA2 联合可诱导泛髓系造血，而 GATA2、TAL1 联合或不联合 LMO2 则主要诱导红系-巨核系造血。这两种转录因子组合均可直接诱导生成造血内皮（HE）细胞，随后转化为具有不同造血分化谱系的血液前体细胞。人多能干细胞（hPSCs）从多能状态分化为产血的造血内皮细胞平均需要 4 天。圆形血细胞最早在分化第 5 天出现。随后，大量悬浮血细胞在培养体系中出现并持续扩增。为最大化悬浮血细胞数量，转导后的培养可延长至 10–14 天。目标谱系细胞可在低黏附条件下，通过添加适当的造血细胞因子组合进行扩增。 图2 展示利用ETV2与GATA1或GATA2转录因子从人多能干细胞（hPSCs）诱导血液细胞的生成。在转导ETV2与GATA2后，细胞在分化第4天呈现典型的内皮细胞形态，并最终在分化第6至8天转变为圆形的血细胞图2A). 分化第3-4天收集的细胞显示出典型的VE-cadherin+<...

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。

在发育过程中，造血细胞来源于一类特殊的内皮细胞，即造血内皮（hemogenic endothelium, HE）。在体外模拟HE的发育过程……

本实验的总体目标是通过强制表达转录因子，从人多能干细胞中生成红系和髓系血细胞。该方法适用于生成血液细胞中的同源性血管内皮，可用于研究内皮向造血转变过程以及造血发育与定向分化的转录调控机制。该技术的主要优势在于，能够以高效且快速的方式从人多能干细胞诱导产生同源性血管内皮，并可在细胞培养皿中直接观察内皮向造血细胞的转变过程。林博士实验室的研究助理Bruske博士将演示该实验流程。开始前，使用细胞外基质（如Matrigel）预包被六孔板，按照生产商说明书进行稀释后加入各孔中。将培养板在37摄氏度孵育30至60分钟。接着准备每组转导所需的慢病毒分装液，使感染复数（即病毒与细胞的比例，MOI）约为1个病毒颗粒对应1个细胞，并将病毒液置于4摄氏度保存。接下来，将hbsc病毒多脑完全无血清培养基与ROCK抑制剂Y 2 7 6 3 2混合，终浓度分别为每毫升6微克和10微摩尔，每套转导体系总体积为1.3毫升，并将混合液置于冰上预冷，以准备细胞。实验起始应使用健康状态的多能干细胞，细胞融合度约为70%，即上次传代后约第四天。若人多能干细胞原先在饲养层（maps）条件下维持培养，则必须在转导实验前经过两到三次传代，转移至无饲养层的培养条件，并确保为状态良好的多能干细胞培养物。无自发分化。吸除人多能干细胞培养基，每六孔板孔中加入两毫升盐类解离溶液（如Accutase），于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5至7分钟。随后加入两毫升含10微摩尔ROCK抑制剂的完全培养基，收集解离的细胞。制备单细胞悬液后，取少量细胞样品，用台盼蓝排斥法计数活细胞。接着，将细胞在200 × g条件下离心5分钟，并将沉淀重悬于完全培养基中，加入终浓度为10 µM的ROCK抑制剂，调整细胞密度至每毫升含3.4 × 10⁶个活细胞。然后，向先前制备的每份1.3 mL转导培养基中加入200 µL细胞悬液，其中含有0.68 × 10⁶个细胞。从37摄氏度环境中取出包被基质的六孔板。接着吸除基质溶液，将每种转导混合物转移至孔中，并轻轻晃动培养板使细胞在孔内均匀分布。24小时。转导后，在显微镜下观察各孔，确保至少有80%的细胞已贴壁。弃去病毒溶液，用不含任何生长因子的不完全培养基洗涤贴壁细胞。随后，向细胞中加入3毫升添加了细胞因子的培养基，即所谓的三F培养基。于次日将细胞过夜孵育。更换含有每毫升1微克嘌呤霉素的新鲜三F培养基，以清除残留的未转导细胞。每24小时更换一次培养基，以去除死亡细胞。处理48小时后，停止使用嘌呤霉素，从第四天起仅使用新鲜的3F培养基。转导后，在显微镜下观察细胞，检查是否出现具有内皮细胞形态的成簇细胞，以确定血-内皮细胞的形成。首先，在培养第3至第4天，使用细胞解离液将培养皿中的细胞进行解离。用完全培养基收集解离后的细胞，离心后在室温下用最大缓冲液重悬细胞，并用血细胞计数板计数细胞。随后，每项染色反应取1 × 10⁵个细胞，与用于检测vimentin、CD226、CD73和CD43等细胞表面标志物的合适抗体共同孵育。流式细胞术的操作在第四天的文本方案中有详细描述。转导后，每48小时更换每孔一半的培养基，持续5至7天；在此期间，圆形血细胞将出现在内皮细胞层上方，呈松散聚集状态。继续培养最多14天，期间悬浮细胞应显著扩增。ETV2、GATA1 和 ETV2 的流式细胞术分析。GATA2 转导的细胞显示出 TER1 阳性血-内皮样细胞的形成，该细胞群在分化第 3 至第 4 天可通过表达 CD236 且不表达 CD73 来鉴定。ETV2、GATA1 和 ETV2 的流式细胞术分析显示，GATA2 转导的细胞在分化第 7 天诱导出表达 CD43 的血细胞。转导后第14天，对GATA2-TAL1-LMO2诱导的细胞进行流式细胞术分析，结果显示形成了表达CD235a和CD41a的血细胞；GATA2-TAL1-LMO2诱导的造血细胞经瑞氏染色的细胞涂片显示，在集落形成细胞实验中可观察到红系、巨噬细胞系及巨核细胞系的细胞形态。人多能干细胞的转导可在不到一小时内完成。在进行转导操作时，需始终注意干细胞的活力，反应体系中应始终加入ROCK抑制剂，并在转导后的前三天内使用每细胞最适剂量的病毒。转导后，可通过免疫染色、集落形成实验和流式细胞术等方法来评估分化效率以及所诱导的血液疾病类型。观看本视频后，您应能够充分掌握如何扩增和感染人类多能干细胞，并了解在转导因子成功导入人类多能干细胞后，细胞通常在前7至10天内失去多能性并逐渐向造血命运定向分化的预期结果。因此，研究人员将拥有一个便捷的体外模型，用于研究内皮细胞向造血细胞转变的分子机制。请注意，操作含有慢病毒的区域可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取预防措施，例如佩戴个人防护装备，并妥善处理含有病毒的区域。

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

Hemogenic内皮细胞直接诱导和血液中转录因子在人多能干细胞表达

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

已建立一种方法，可直接从外周血细胞中富集的造血祖细胞诱导生成人类神经干细胞。...

直接诱导人外周血造血祖细胞生成神经干细胞

本文所述方案详细介绍了通过过表达少量转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导造血程序的方法。该技术可被拓展至人类体系，为未来研究造血过程、血液系统疾病以及造血干细胞移植提供平台。...

利用转录因子重编程小鼠胚胎成纤维细胞以诱导造血程序

我们提出了一种将外周血单个核细胞（PBMCs）重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的实验方案。通过将转导后的血细胞接种至经基质包被的培养板中，并进行离心，可成功从悬浮细胞中诱导生成iPSCs。该技术为PBMCs和CBMCs等细胞提供了一种简单且高效的重编程方法。...

使用仙台病毒和离心法从血细胞生成诱导性多能干细胞

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34+造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。...

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。...

无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

本方案通过强制表达转录因子GATA2、GFI1B和FOS，诱导人皮肤成纤维细胞启动造血程序，从而生成造血干细胞和祖细胞。...

通过强制表达转录因子实现人成纤维细胞的造血重编程

本文介绍了一种在约1周内将人多能干细胞定向分化为生血性内皮细胞的简单方案。...

人多能干细胞向造血内皮细胞的定向分化

本方案描述了从人类多能干细胞和诱导性多能干细胞生成自组织血管的方法。这些血管网络表现出广泛且相互连接的内皮细胞网络，周围分布着周细胞、平滑肌肌动蛋白以及连续的基底膜。...

从多能干细胞生成人血管类器官

本文介绍了一种从人类多能干细胞分化获得内皮细胞的简单工作流程，随后详细描述了对其进行机械刺激的实验方案。该方法可用于研究内皮细胞发育过程中的力学生物学特性。此方法适用于对机械刺激后从培养芯片中收集的活细胞进行后续分析检测。...

体外胎儿人源血管芯片模型用于研究发育性机械生物学

了解利用转录因子强制表达从人多能干细胞高效诱导生血内皮和多能造血祖细胞的方法。该技术可在体外观察内皮向造血转化过程，为研究造血发育和转录调控提供可靠模型。

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

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