Name: 人类颗粒酶在哺乳动物细胞中高产量和经济高效表达系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 了解在HEK293T细胞中高产量表达人类颗粒酶的经济高效方法。本方案利用瞬时转染和亲和层析技术，可获得完全糖基化且具有酶活性的蛋白酶，为免疫学研究提供可靠的实验基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作获得了诺华医学-生物学研究基金会和弗里堡大学研究基金（授予 MW）的资助。我们感谢李钊、詹旭和索朗日·哈鲁比·赫斯提供的技术支持，感谢拉杜·阿里切斯库和伊冯·琼斯（英国牛津大学）提供 pHLsec 质粒，以及托马斯·许尔普夫（哈佛医学院）给予的有益讨论。

1. 表达质粒 pHLsec-Gzm 的制备
<ol>
	<li>使用合适的RNA提取方法从人NK细胞（按照参考文献26制备的原代细胞，或表达全部五种人源Gzm的NK-92细胞系）中提取总RNA，并根据制造商的说明，使用第一链cDNA合成试剂盒进行逆转录。利用PCR扩增Gzm cDNA，并如参考文献23所述（由英国牛津大学Radu Aricescu和Yvonne Jones惠赠）通过AgeI和KpnI酶切位点将其克隆至pHLsec载体中（图1）。 
	注意：使用表1中列出的以下引物。</li>
	<li>通过测序确认插入片段正确无误。在DH5α细胞中扩增表达质粒，并使用无内毒素质粒提取试剂盒按照制造商说明书进行纯化。</li>
	<li>将纯化的质粒溶解于无内毒素、无菌的水中，浓度为2 mg/ml，保存于-20 °C备用。</li>
</ol>
2. 在 HEK293T 细胞中表达颗粒酶
<ol>
	<li>试剂准备
	<ol>
		<li>制备标准培养基。向含有高糖（25 mM）、GlutaMax（4 mM）和丙酮酸钠（1 mM）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入10%标准胎牛血清（FCS）、青霉素（100 units/ml）和链霉素（100 μg/ml）。</li>
		<li>制备转染培养基。在不含青霉素-链霉素的培养基中加入25 μg/ml氯喹（在转染当天新鲜加入，使用PBS配制的1,000倍储存液，-20 °C保存）。</li>
		<li>制备无血清培养基：向HEK293细胞专用的无血清培养基中加入谷氨酰胺（4 mM）、青霉素（100 units/ml）、链霉素（100 μg/ml）和2.5 mg/L两性霉素B。</li>
		<li>配制表2中所述溶液，并在使用前用0.45 μm滤器过滤：</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增HEK293T细胞
	<ol>
		<li>使用150 × 25 mm组织培养皿，加入20 ml培养基培养HEK293T细胞。</li>
		<li>当细胞融合度达到80%时进行传代（传代比例为1:4，通常每3天一次）。细胞贴壁较松散，可通过剧烈吹打实现机械解离，无需胰酶消化。</li>
		<li>在转染前一天晚上接种细胞，使转染当天细胞融合度达到60–70%（接种密度约为2 × 105 cells/ml）。常规制备规模为20至25个培养皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磷酸钙转染法
	<ol>
		<li>转染前1小时，将标准培养基更换为20 ml转染培养基。在此1小时孵育即将结束时，于50 ml离心管中（每5个培养皿使用1管）混合400 μg质粒DNA、10.95 ml ddH2O和1.55 ml 2 M CaCl2。</li>
		<li>在转染前1至2分钟，向12.5 ml DNA-钙溶液中加入12.5 ml 2× HBS，通过倒置混匀，室温孵育30秒。</li>
		<li>将步骤2.3.2中制备的混合液直接滴加至细胞中（每皿5 ml），逐滴加入培养基中，均匀分散，使培养基变为微橙色。</li>
		<li>将培养皿置于组织培养孵箱中孵育7至11小时（37°C，含5% CO2的湿润空气）。孵育后可见细小沉淀。吸除转染培养基，用预热的PBS小心冲洗，然后加入20 ml步骤2.1.3中制备的无血清培养基。继续在组织培养孵箱中孵育72小时。</li>
		<li>取细胞上清液样品（约20 μl）进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，观察颗粒酶条带，以分析转染效率和表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过镍离子亲和层析（Nickel-IMAC）从培养上清中纯化Gzms
	<ol>
		<li>孵育结束后，将细胞培养上清液倾入250 ml离心管中，离心澄清。首先进行一次离心（400 × g，10分钟，4 °C），以去除脱落的细胞。将上清转移至新的250 ml离心管中，再以4,000 × g、4 °C离心30分钟，以去除残留的细胞碎片。</li>
		<li>每250 ml澄清上清中加入5 ml 5 M NaCl、6.25 ml 2 M Tris-Base（pH 8）和1 ml 0.25 M NiSO4。使用500 ml真空滤器装置（0.45 mm）过滤上清液。</li>
		<li>使用合适的FPLC系统，用His结合缓冲液A对镍离子亲和层析柱进行平衡（10个柱体积，CV）。</li>
		<li>在4 °C条件下，以0.5 ml/min的流速将澄清后的上清液上样至已平衡的层析柱。</li>
		<li>上样完成后，用His结合缓冲液A洗涤层析柱，直至紫外吸收基线稳定（通常为10 CV）。</li>
		<li>以0.5 ml/min流速，使用线性梯度（20 ml，0至250 mM咪唑）洗脱Gzms，同时收集2 ml级分。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析洗脱级分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肠激酶（EK）处理及阳离子交换层析最终纯化
	<ol>
		<li>将含有Gzm的级分收集至截留分子量≤10,000的透析袋中。保留少量样品于-20 °C保存，作为EK处理前对照。</li>
		<li>直接向透析袋中的合并级分中加入EK（每50 ml初始上清液加0.02单位），在EK缓冲液（4 L，中途更换一次缓冲液）中室温透析过夜（至少16小时）。</li>
		<li>次日，通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，比较EK处理后的Gzms与EK处理前对照样品。</li>
		<li>当N端加工完成后，将透析缓冲液更换为S缓冲液A（4 L），室温继续透析4小时。透析液经0.45 μm滤器过滤。</li>
		<li>用S缓冲液A平衡S柱。在4 °C条件下，以0.5 ml/min流速将样品上样至层析柱。</li>
		<li>上样后，用S缓冲液A洗涤层析柱，直至紫外吸收基线稳定（约10 CV）。使用30 ml线性梯度（150至1,000 mM NaCl）洗脱Gzms。GzmA在约650 mM NaCl时洗脱，GzmB在约700 mM NaCl时洗脱，GzmM在约750 mM NaCl时洗脱。</li>
		<li>通过SDS-PAGE和比色法检测（见下文）分析洗脱级分。合并含Gzms的级分，使用离心过滤器（15 ml，10,000截留分子量）浓缩约30倍，至浓度约100 μM。分装浓缩后的Gzm样品，于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 检测颗粒酶活性
<ol>
	<li>试剂的准备
	<ol>
		<li>制备比色法检测缓冲液：50 mM Tris-Base，pH 7。
		<ol>
			<li>检测GzmA时，在检测缓冲液中加入N-α-CBZ-L-赖氨酸硫代苄酯（S-Bzl）（BLT），终浓度为0.2 mM，以及5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB），浓度为0.22 mM。检测GzmB时，加入0.2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl（AAD）和0.22 mM DTNB。检测GzmM时，加入0.2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-对硝基苯胺（pNA）（AAPL）。合成肽类需从适当浓度的储备液（溶于DMSO，-20 °C保存）中新鲜加入缓冲液中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备切割检测缓冲液：100 mM NaCl，50 mM Tris-Base，pH 7.5</li>
	</ol>
	</li>
	<li>比色法检测
	<ol>
		<li>将洗脱组分或浓缩储备液中的少量Gzm样品（&#60;5 μl）加入96孔平底板中。设置阳性对照（已知Gzm样品或粗制NK细胞裂解液）和阴性对照（仅缓冲液）。</li>
		<li>每孔加入100 μl检测缓冲液（使用多通道移液器）。37 °C孵育10分钟。使用酶标仪在405 nm处测定吸光度（OD）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切割检测
	<ol>
		<li>使用纯化底物进行切割检测时，将蛋白底物（天然或重组蛋白，100–400 nM；本节结果部分及末尾注释中列出了若干高效的Gzm底物示例）与系列稀释的Gzm（起始浓度为400 nM）在检测缓冲液中共同孵育不同时间。通过SDS-PAGE结合考马斯亮蓝或银染，或通过特异性抗体进行的Western印迹分析结果。</li>
		<li>使用细胞裂解液进行切割检测时，将106个HeLa细胞（或任何可用的肿瘤细胞系）悬浮于1 ml检测缓冲液中，通过在乙醇/干冰浴中冷冻并在37 °C解冻三次的方式进行裂解。离心去除细胞碎片（4 °C，15,000 × g离心10分钟）。</li>
		<li>将澄清的裂解液与不同浓度的Gzm在不同时间点共同孵育，如上所述。通过使用适当抗体的免疫印迹检测切割情况。 
		&#8203;注：以下是一些具有商用抗体的可靠底物示例：GzmB切割的Bid（BH3相互作用结构域死亡激动剂）和caspase 327,28；GzmA切割的多种异质性核糖核蛋白（hnRNPA1、A2和U）29；GzmM切割的巨细胞病毒磷酸蛋白7130。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chowdhury, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+by+a+thousand+cuts%3A+granzyme+pathways+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death.</a> Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).</li>
<li>Thiery, J., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin%3A+a+key+pore-forming+protein+for+immune+control+of+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer.</a> Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).</li>
<li>Krensky, A. M., Clayberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+clinical+relevance+of+granulysin%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Biology and clinical relevance of granulysin.</a> Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).</li>
<li>Bovenschen, N., Kummer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+granzymes+find+a+home%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Orphan granzymes find a home.</a> Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).</li>
<li>Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+A+activates+another+way+to+die%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Granzyme A activates another way to die.</a> Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).</li>
<li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quarter+century+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">A quarter century of granzymes.</a> Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).</li>
<li>Hiebert, P. R., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+in+injury%2C+inflammation%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Granzyme B in injury, inflammation, and repair.</a> Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).</li>
<li>Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+and+non-cytotoxic+roles+of+the+CTL%2FNK+protease+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme.</a> B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).</li>
<li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157, 1309-1323 (2014).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+act+as+an+extravascular+cytotoxic+barrier+for+joint-invading+Lyme+Borrelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li>
<li>Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimalarial+activity+of+granzyme+B+and+its+targeted+delivery+by+a+granzyme+B-scFv+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2014).</li>
<li>Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cytotoxic+T+cell+and+NK+granules+and+purification+of+their+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).</li>
<li>Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+use+of+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and use of granzyme B.</a> Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).</li>
<li>Masson, D., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+serine+esterases+in+lytic+granules+of+cytolytic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes.</a> Cell. 49, 679-685 (1987).</li>
<li>Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+refolding%2C+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B.</a> Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B+from+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris.</a> Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+enzymatically+active+recombinant+granzyme+B+in+a+baculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system.</a> Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).</li>
<li>Stahnke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-H22%28scFv%29%2C+a+human+immunotoxin+targeting+CD64+in+acute+myeloid+leukemia+of+monocytic+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes.</a> Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).</li>
<li>Gehrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+expression+and+purification+system+for+the+production+of+enzymatic+and+biologically+active+human+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme.</a> B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).</li>
<li>Metkar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cell+granule-mediated+apoptosis%3A+perforin+delivers+granzyme+B-serglycin+complexes+into+target+cells+without+plasma+membrane+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation.</a> Immunity. 16, 417-428 (2002).</li>
<li>Motyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannose+6-phosphate%2Finsulin-like+growth+factor+II+receptor+is+a+death+receptor+for+granzyme+B+during+cytotoxic+T+cell-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis.</a> Cell. 103, 491-500 (2000).</li>
<li>Pinkoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+and+trafficking+of+granzyme+B+in+target+cells+during+granzyme+B-perforin-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis.</a> Blood. 92, 1044-1054 (1998).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Fukuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+assays+of+nine+heterogeneous+promoters+in+neural+and+other+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).</li>
<li>Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptidyl+peptidase+I%3A+importance+of+progranzyme+activation+sequences%2C+other+dipeptide+sequences%2C+and+the+N-terminal+amino+group+of+synthetic+substrates+for+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity.</a> Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Barry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+short-circuits+the+need+for+caspase+8+activity+during+granule-mediated+cytotoxic+T-lymphocyte+killing+by+directly+cleaving+Bid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid.</a> Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).</li>
<li>Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+apoptotic+protease+CPP32+by+cytotoxic+T-cell-derived+granzyme+B.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. </a> Nature. 377, 446-448 (1995).</li>
<li>Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+RNA+processing+during+immune-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).</li>
<li>Domselaar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncytotoxic+inhibition+of+cytomegalovirus+replication+through+NK+cell+protease+granzyme+M-mediated+cleavage+of+viral+phosphoprotein+71%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71.</a> J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+activates+clathrin-+and+dynamin-dependent+endocytosis%2C+which+is+required+for+plasma+membrane+repair+and+delivery+of+granzyme+B+for+granzyme-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis.</a> Blood. 115, 1582-1593 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+pores+in+the+endosomal+membrane+trigger+the+release+of+endocytosed+granzyme+B+into+the+cytosol+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells.</a> Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).</li>
<li>Thomas, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+protease+binding+to+nucleic+acids+promotes+nuclear+localization+and+cleavage+of+nucleic+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins.</a> J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).</li>
<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li>
<li>Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li>
<li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity%3A+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).</li>
<li>Huang, M. T., Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervening+sequences+increase+efficiency+of+RNA+3%27+processing+and+accumulation+of+cytoplasmic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA.</a> Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).</li>
<li>Luthman, H., Magnusson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+polyoma+DNA+transfection+of+chloroquine+treated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).</li>
<li>Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+one-stage+method+for+assay+of+enterokinase+activity+by+release+of+radiolabelled+activation+peptides+from+alpha-N-%5B3H%5Dacetyl-trypsinogen+and+the+effect+of+calcium+ions+on+the+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity.</a> Biochem J. 197, 239-244 (1981).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

颗粒酶A（GzmA）和颗粒酶B（GzmB）的经典且被广泛研究的功能是在穿孔素（PFN）介导其进入细胞质后，诱导哺乳动物细胞发生凋亡1。最近，颗粒酶（Gzms）的细胞毒性作用范围已显著扩展，不仅限于哺乳动物细胞，还包括细菌9,10以及某些寄生虫11。此外，GzmA和GzmB的非经典细胞外功能，以及各种孤儿颗粒酶（orphan Gzms）的生物学意义，目前仍不清楚。因此，本方案所提供的高效、省时且经济的颗粒酶表达与纯化系统，将对未来相关研究提供极大帮助。
该方法的优势主要基于本系统中使用的表达载体pHLsec23。该质粒在大肠杆菌（E. coli）中具有高拷贝数，因而能够实现高效的DNA生产。其增强子/启动子元件在多种细胞系中表现出最强的活性24。该质粒的转录单元内含有一个内含子，而研究表明内含子可使哺乳动物细胞中的基因表达水平提高达100倍37。此外，该质粒还包含Kozak共有序列、优化的分泌信号、Lys-6xHis标签以及poly-A...

颗粒酶（Gzms）是一类高度同源的丝氨酸蛋白酶，定位于细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK细胞）的特化溶酶体中1。这些杀伤细胞的细胞毒颗粒中还含有膜破坏蛋白PFN和GNLY，在识别到需要清除的靶细胞时，这些蛋白会与Gzms同时释放2,3。人类中有五种颗粒酶（GzmA、B、H、K和M），小鼠中有十种（GzmA–G、K、M和N）。在人类和小鼠中，GzmA和GzmB含量最丰富，也是研究最为深入的两种颗粒酶1。然而，近年来越来越多的研究开始关注其他被称为“孤儿”颗粒酶在健康与疾病状态下介导的细胞死亡通路及其他生物学效应4。
颗粒酶（Gzms）最广为人知的功能是当其通过穿孔素（PFN）递送至靶细胞内时，可诱导哺乳动物细胞发生程序性细胞死亡，尤其是颗粒酶A（GzmA）和颗粒酶B（GzmB）在这方面的作用5,6。然而，近期研究还发现，颗粒酶在细胞外也具有显著影响免疫调节和炎症反应的作用，且该作用不依赖于穿孔素介导的胞质递送7,8。此外，最近研究还发现颗粒酶进入胞质后能有效杀伤的细胞谱系已从哺乳动物细胞扩展至细菌9,10甚至某些寄生虫11。这些新发现为颗粒酶研究开辟了全新的研究领域。因此，一种成本低廉且产量高的哺乳动物表达系统将极大促进未来相关研究的开展。
已成功从细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞系的颗粒组分中纯化出天然的人、小鼠和大鼠颗粒酶（Gzms）12-14。然而，据我们观察，此类纯化技术的产量通常低于每升细胞培养物0.1 mg（未发表观察结果及12）。此外，通过层析方法将单一Gzm与其他共存于颗粒中的Gzms或蛋白质分离，以获得无污染的纯品，仍具有挑战性（未发表数据及12,14）。重组Gzms已在细菌15、酵母16、昆虫细胞17以及哺乳动物细胞（如HEK 293细胞）18,19中表达。其中，只有哺乳动物表达系统具备产生具有与天然细胞毒性蛋白完全相同的翻译后修饰的重组酶的潜力。已有研究表明，翻译后修饰与蛋白通过内吞作用的特异性摄取及其在靶细胞内的亚细胞定位密切相关20-22。因此，我们采用pHLsec23（由英国牛津大学Radu Aricescu和Yvonne Jones惠赠）作为Gzm表达的质粒骨架，建立了一种在HEK293T细胞中高效、省时且成本低廉的高产量蛋白表达系统。pHLsec质粒结合了CMV增强子和鸡β-肌动蛋白（Β-actin）启动子，这两种元件在多种细胞系中均表现出最强的启动子活性24。此外，该质粒还包含兔β-珠蛋白（Β-globin）内含子、优化的Kozak序列和分泌信号、Lys-6xHis标签以及poly-A信号。外源基因片段可便捷地克隆于分泌信号与Lys-6xHis标签之间（图1），从而确保缺乏合适N端结构域的蛋白获得最佳的表达与分泌效率。在表达Gzms时，我们用载体提供的分泌信号序列替换其内源性分泌信号，并在其后引入肠激酶（EK）识别位点（DDDDK），以便经EK处理后激活所分泌的Gzms（活性Gzms的N端氨基酸序列为IIGG25）。此外，该方法具有明显优势：HEK293T细胞可在价格低廉的培养基（如Dulbecco改良Eagle培养基，DMEM）中快速生长，且非常适合采用成本较低的磷酸钙转染法进行转染。

<table><tbody><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>总 RNA 提取试剂盒</td></tr><tr><td>SuperScript II 逆转录酶</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 293 无血清培养基（用于 HEK 293 细胞）</td><td>Sigma</td><td>14571C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充物，丙酮酸</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin 透析管，10K 分子量截留值（MWCO）</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>牛肠来源肠激酶</td><td>Sigma</td><td>E4906</td><td>重组型，&amp;ge;20&amp;nbsp;单位/毫克蛋白</td></tr><tr><td>HisTrap Excel 5 ml 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-3712-06&amp;nbsp;</td><td>镍离子亲和层析柱（IMAC）</td></tr><tr><td>HiTrap SP HP 5 ml 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1152-01&amp;nbsp;</td><td>S 阳离子交换柱</td></tr><tr><td>N-&amp;alpha;-Cbz-L-赖氨酸硫代苄酯（BLT）</td><td>Sigma</td><td>C3647</td><td>GzmA 底物</td></tr><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl（AAD）</td><td>MP Biomedicals</td><td>2193608 _10mg</td><td>GzmB 底物</td></tr><tr><td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-硝基苯胺（AAPL）</td><td>Bachem</td><td></td><td>GzmM 底物</td></tr><tr><td>5,5&amp;prime;-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td>Ellman 试剂</td></tr></tbody></table>

一种高效且低成本的人类颗粒酶在哺乳动物细胞中的表达系统

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

当细胞毒性T淋巴细胞（CTL）或自然杀伤（NK）细胞识别到肿瘤细胞或被胞内病原体感染的细胞时，会释放其细胞毒性颗粒内容物，以清除靶细胞及胞内病原体。宿主细胞的死亡以及胞内病原体的清除是由颗粒丝氨酸蛋白酶——颗粒酶（Gzms）所触发的。这些颗粒酶通过成孔蛋白穿孔素（PFN）递送至宿主细胞的细胞质中，或通过原核生物膜破坏蛋白颗粒溶素（GNLY）递送至细菌病原体中。为了在实验性的体外（in-vitro）条件下研究Gzms介导的靶细胞死亡的分子机制，需要能够高效表达并纯化大量活性酶的蛋白质表达与纯化系统。哺乳动物分泌型蛋白表达系统具有潜力，可产生正确折叠、功能完整且带有翻译后修饰（如糖基化）的蛋白质。因此，我们采用了一种成本低廉的钙沉淀法，将克隆至表达质粒pHLsec中的人源Gzms瞬时转染至HEK293T细胞中。通过该载体提供的C端多聚组氨酸标签，利用固定化镍亲和层析从细胞培养上清中实现了Gzm的纯化。在蛋白N端插入肠激酶切割位点，可生成具有活性的蛋白酶，最终通过阳离子交换层析进一步纯化。该系统已成功用于高效表达人源细胞毒性颗粒酶A、B和M，理论上也可用于高效表达人体内的几乎所有酶类。

在下文中，我们将完整展示颗粒酶A（GzmA）制备的详细流程，以阐明该方法。我们还成功纯化了颗粒酶B（GzmB）和颗粒酶M（GzmM），在纯化效率和活性方面获得了类似的结果。然而，对于后两者的制备，我们仅展示部分代表性数据。采用本方案从293T细胞中制备的GzmB已在多项已发表的研究中使用，证实其在多种生物学检测体系中具有活性9,29,31-34。
典型的GzmA纯化结果如图2A所示。转染72小时后，通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶可检测到明显的Gzm条带，表明转染和表达效率较高，且无需进一步浓缩培养上清液（还原条件下GzmB和GzmM的分子量约为37 kDa；非还原/还原条件下GzmA的分子量分别为约60/34 kDa）。经过IMAC纯化后，样品用肠激酶（EK）处理。与EK处理前的对照样品相比，EK处理后的样品（处理后）出现了明显的条带迁移。随后在S柱上的最终纯化获得了高纯度的Gzm蛋白制剂（GzmA见图2A；GzmB和GzmM见图2B），在考马斯亮蓝...

本文介绍了一种使用HEK293T细胞的低成本颗粒酶表达系统，该系统可产生高产量、高纯度、完全糖基化且具有酶活性的蛋白酶。

当细胞毒性T淋巴细胞（CTL）或自然杀伤（NK）细胞识别到肿瘤细胞或被胞内病原体感染的细胞时，它们会释放其……

本实验的总体目标是在人胚胎肾293T细胞中高效表达具有叶酸糖基化修饰且酶学活性良好的颗粒酶。首先在适当的组织培养皿中扩增HEK 293T细胞，扩增后的常规制备规模为20至25个培养皿。第二步是利用高效的磷酸钙法，将扩增的细胞 transiently 转染颗粒酶表达质粒。接着，收集细胞上清液，并通过固定化金属亲和层析纯化分泌的颗粒酶。最后步骤是通过肠激酶处理激活颗粒酶，并通过阳离子交换层析进一步纯化蛋白酶。最终，使用一种快速且可靠的胆固醇测定法检测酶活性。由于在颗粒酶研究中，具有活性的蛋白酶难以大量获得，这成为研究的限制因素。该方法有助于回答该领域的一些关键问题，例如在不同生物体中表征新的细胞死亡通路，或在全蛋白质组方法中鉴定新的蛋白酶底物。为表达颗粒酶，首先在150 mm × 25 mm的组织培养皿中，用20毫升培养基培养HEK 293T细胞，在细胞融合度达到80%时进行传代。此时细胞贴壁较松，可通过剧烈吹打上下悬浮，无需胰酶即可机械脱落并接种到新培养皿中。转染前一晚接种细胞，使转染当天细胞融合度达到60%至70%。通常准备20至25个培养皿。转染前1小时，将标准培养基更换为20毫升转染培养基。在1小时孵育步骤即将结束前1至2分钟，于50毫升离心管中将400微克质粒DNA、10.95毫升双蒸水与1.55毫升2摩尔氯化钙混合。将12.5毫升的2×HEPES缓冲盐溶液加入12.5毫升DNA-氯化钙溶液中，通过反复倒置试管混匀，室温孵育30秒。随后，将此混合液逐滴直接加入细胞中，每皿5毫升，均匀滴加至整个培养皿表面，使培养基变为微橙色。将培养皿置于组织培养孵箱中孵育7至11小时。孵育后可见细小沉淀物。移除转染培养基，用预热的 PBS 轻柔冲洗，然后加入 20 毫升无血清培养基，在组织培养孵箱中继续孵育 72 小时。取细胞上清液进行 SDS-PAGE 电泳，用考马斯亮蓝染色，分析转染效率和表达水平。亮蓝色。用于可视化颗粒酶条带。孵育后，将细胞培养上清液倾入250毫升试管中，并通过离心澄清。进行第一次离心，以去除脱离的细胞中的培养基。将上清液转移至新的250毫升离心管中，在4,000 ×g、4°C条件下离心30分钟，以去除残留的细胞碎片。接着，加入5毫升氯化钠、6.25毫升Tris碱、1毫升硫酸镍以及250毫升澄清的上清液。使用500毫升真空过滤装置过滤上清液。用组氨酸结合缓冲液平衡镍固定化金属离子亲和层析柱。使用合适的FPLC系统。然后在4°C条件下，以0.5毫升/分钟的流速将澄清的上清液上样至已平衡的层析柱。上样完成后，用其结合缓冲液洗涤层析柱，直至紫外（UV）吸收基线稳定。随后以线性20毫升ILE梯度在0.5毫升/分钟的流速下洗脱颗粒酶，同时收集每管2毫升的洗脱组分。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析洗脱组分。将含有目标酶的组分收集到离心管中。取少量样品于

a-high-yield-cost-efficient-expression-system-human-granzymes

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人类颗粒酶在哺乳动物细胞中高产量和经济高效表达系统

在后人类基因组时代，天然构象重组蛋白的可获得性对于结构、功能及治疗相关的研究与开发至关重要。本文介绍了一种在人胚胎肾293T细胞中进行小规模及大规模蛋白表达的系统，可用于生产多种重组蛋白。...

一种用于从人类细胞生产分泌蛋白的便捷通用表达平台

利用哺乳动物系统表达重组蛋白正成为生产用于结构生物学研究的蛋白复合物的一种颇具吸引力的方法。本文介绍了一种简单且高效的表达系统，该系统利用悬浮培养的哺乳动物细胞来纯化用于结构研究的蛋白复合物。...

用于结构生物学研究的重组蛋白表达：在HEK 293F悬浮细胞中的一种新颖且易于实现的方法

我们介绍一种简单、定量的比色法，可特异性地测定人、小鼠或大鼠颗粒酶B（Granzyme B,...

一种特异性测定颗粒酶B蛋白水解活性的比色法：Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl的水解反应

本研究比较了不同生产平台中目标人源重组蛋白的表达。我们重点探讨了基于传统发酵罐的培养系统和植物系统，分别描述了每种系统的建立过程，并根据已报道的结果，阐明了各平台固有的局限性和优势。...

不同生物反应器中重组蛋白表达的比较分析：细菌、昆虫细胞与植物系统

在基于细胞的系统中表达疟疾蛋白仍然具有挑战性。我们展示了两种无细胞表达系统——两步法和一步法体外翻译（in vitro translation,...

基于 HeLa 细胞的无细胞表达系统用于表达Plasmodium 肾形体蛋白

这是一种快速且成本效益高的方案，用于表达分泌型糖基化哺乳动物蛋白，并通过单步纯化获得足量均一的蛋白，适用于X射线晶体学及其他生物物理研究。...

用于结晶的高效哺乳动物细胞表达及胞外糖蛋白单步纯化

利用适当的翻译后修饰在实验室规模生产真核蛋白仍面临重大障碍。本文提供了一种基于哺乳动物表达系统的蛋白质表达方案，具有建立迅速、周期短的优点。该系统支持氨基酸选择性标记、蛋白质选择性标记以及糖链组成的小分子调节剂。...

悬浮培养HEK293细胞瞬时转染实现人源重组蛋白的高效表达

离子通道的纯化通常具有挑战性，但一旦成功，就有可能使其得以 体外 对通道功能与结构的研究。在此，我们描述了表达与纯化哺乳动物 bestrophin 蛋白（一类 Ca²⁺ 激活的氯离子通道）的逐步操作步骤。2+-激活的 Cl-...

哺乳动物Bestrophin离子通道的表达与纯化

我们提供了可扩展的实验方案，涵盖在HEK293细胞中设计构建体、瞬时转染以及全长人源亨廷顿蛋白变体的表达与纯化。...

利用瞬时表达系统在哺乳动物细胞中高效且可扩展地生产全长人源亨廷顿蛋白变体

采用 His标签纯化、透析和活化方法，以提高在细菌中表达的可溶性、有活性的基质金属蛋白酶-3 催化结构域蛋白的产量。通过 SDS-PAGE...

利用亲和层析法进行人基质金属蛋白酶-3的细菌表达与纯化

对人源膜转运蛋白进行结构与生化研究需要获得毫克量级的稳定、完整且均一的蛋白质。本文介绍了利用密码子优化基因进行人源溶质载体转运蛋白的筛选、表达和纯化的可扩展方法。...

用于结构与生化研究的人类溶质载体的高通量表达与纯化

了解在HEK293T细胞中高产量表达人类颗粒酶的经济高效方法。本方案利用瞬时转染和亲和层析技术，可获得完全糖基化且具有酶活性的蛋白酶，为免疫学研究提供可靠的实验基础。

一种高效且低成本的人类颗粒酶在哺乳动物细胞中的表达系统

探索更多视频