一种高效且低成本的人类颗粒酶在哺乳动物细胞中的表达系统

本实验的总体目标是在人胚胎肾 293T 细胞中高效表达具有糖基化修饰且酶活性良好的颗粒酶。首先在适当的组织培养皿中扩增 HEC 293T 细胞，扩增后的常规制备规模为 20 至 25 个培养皿。

第二步是利用高效的磷酸钙法，将扩增的细胞瞬时转染颗粒酶表达质粒。接着，收集细胞上清液，并通过固定化金属亲和层析纯化分泌的颗粒酶。最后步骤是通过肠激酶处理激活颗粒酶，并通过阳离子交换层析进一步纯化蛋白酶。

最终，通过一种快速且可靠的胆固醇测定法来检测酶活性，因为足量活性蛋白酶的可获得性是颗粒酶研究中的一个限制因素。该方法有助于回答该领域的一些关键问题，例如在不同生物体中表征新的细胞死亡通路，或在全蛋白质组方法中鉴定新的蛋白酶底物。为了表达颗粒酶，首先在150 mm × 25 mm的组织培养皿中，使用20毫升培养基培养HEK 293T细胞，在细胞融合度达到80%时进行传代。此时细胞贴壁较松，可通过剧烈吹打实现机械性脱离，无需使用胰酶处理。

转染前一天晚上接种细胞，使转染当天细胞融合度达到60%至70%。通常准备20至25个培养皿。转染前1小时，将标准培养基更换为20毫升转染培养基。在1小时孵育步骤即将结束前1至2分钟，于50毫升离心管中将400微克质粒DNA与10.95毫升双蒸水和1.55毫升2摩尔氯化钙混合。

将12.5毫升的2× HEPES缓冲盐溶液加入12.5毫升DNA-氯化钙溶液中，通过翻转试管充分混匀，室温孵育30秒。随后，将此混合液逐滴直接加入细胞中，每皿5毫升，均匀滴加至整个培养皿表面，使培养基变为微橙色。将培养皿置于组织培养孵箱中孵育7至11小时。

孵育后可见细小沉淀。移除转染培养基，用预热的 PBS 轻柔冲洗，然后加入 20 毫升无血清培养基，在组织培养孵箱中继续孵育 72 小时。取细胞上清液样本进行 SDS-PAGE 电泳，用考马斯亮蓝染色，以分析转染效率和表达水平。

亮蓝色。用于可视化颗粒酶条带。孵育后，将细胞培养上清液倾入250毫升试管中，并通过离心澄清。

进行第一次离心，以去除悬浮细胞的培养基。将上清液转移至新的250毫升离心管中，在4,000 ×g、4°C条件下离心30分钟，以去除残留的细胞碎片。接着，加入5毫升氯化钠、6.25毫升Tris碱、1毫升硫酸镍以及250毫升澄清后的上清液。

使用500毫升真空过滤装置过滤上清液。用His结合缓冲液平衡镍离子固定化金属亲和层析柱。使用合适的FPLC系统进行操作。

然后在4°C条件下，以0.5毫升/分钟的流速将澄清的上清液上样至已平衡的层析柱中。上样完成后，用组氨酸结合缓冲液洗涤层析柱，直至紫外（UV）吸收基线稳定。随后以0.5毫升/分钟的流速，采用20毫升的ILE线性梯度洗脱颗粒酶，同时收集每管2毫升的组分。

通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析洗脱组分。将含有目的酶的组分收集到离心管中。取少量样品于-20 °C保存，作为肠激酶处理前的对照。

将肠激酶以每 50 毫升初始上清液 0.02 单位的量直接加入透析袋中的合并组分中，并在肠激酶缓冲液中于室温下透析过夜。次日，通过 SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色分析经肠激酶处理的样品与肠激酶处理前对照样品。当末端加工完成后。

将透析缓冲液更换为S缓冲液A，在室温下继续透析四小时，然后对透析后的样品进行过滤。接着，用S缓冲液A平衡S柱。在4°C条件下，以每分钟0.5毫升的流速将样品上样至层析柱。

用 S 缓冲液 A 洗脱层析柱，直至紫外吸收基线稳定。使用 30 毫升线性氯化钠梯度洗脱颗粒酶，颗粒酶 A 在约 650 毫摩尔/升氯化钠处洗脱，颗粒酶 B 在约 700 毫摩尔/升氯化钠处洗脱，颗粒酶 M 在约 750 毫摩尔/升氯化钠处洗脱。收集含有颗粒酶的组分，并使用离心滤膜浓缩至约 100 微摩尔/升，分装浓缩后的颗粒酶制品，于 -80 摄氏度保存。

接下来，通过SDS-PAGE和显色分析对洗脱组分进行分析。进行显色分析时，将洗脱组分或浓缩储备液中的少量颗粒酶样品加入96孔平底板中，并设置阳性对照和阴性对照。每孔加入100 µL分析缓冲液。

将培养板在37摄氏度下孵育10分钟。最后，在酶标仪中于405纳米处测定吸光度。该方案可高效获得高纯度的颗粒酶，如本代表性考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶所示，其中S柱洗脱获得了颗粒酶BE。

重组颗粒酶表现出与天然蛋白酶制剂相似的活性，如本比色法检测中对重组与天然颗粒酶B活性的比较所示。重要的是，内切糖苷酶H（endo H）处理表明，在HEK 293T细胞中产生的颗粒酶具有完全的糖基化修饰。重组颗粒酶能够切割大分子蛋白底物，如本代表性颗粒酶A切割实验所示，该实验使用了细菌蛋白底物UOCD。

此处，代表被切割的 N-O-U-C-D 的条带随着颗粒酶浓度的增加而逐渐消失。观看本视频后，您应能充分了解如何在 HEK293T 细胞中高效表达完全糖基化且具有前体活性的颗粒酶。