人类颗粒酶在哺乳动物细胞中高产量和经济高效表达系统
June 10th, 2015
我们在这里描述了一种使用 HEK293T 细胞的经济高效的颗粒酶表达系统，该系统可产生高产量的纯、完全糖基化和酶活性蛋白酶。
该程序的总体目标是在人胚胎肾 2 93 T 细胞中产生高产量的叶酸糖基化和酶活性颗粒酶。这是通过首先在适当的组织培养皿中扩增 HEC 2 93 T 细胞来实现的。扩增后通常的制备规格包括 20 至 25 个培养皿。
第二步是使用高效的磷酸钙方法，用颗粒酶表达质粒瞬时转染扩增的细胞。接下来，收获细胞上浆，并通过固定化金属亲和色谱纯化分泌的大酶。最后的步骤是通过进入激酶处理来激活大酶，并通过阳离子交换层析进一步纯化蛋白酶。
最终，使用快速可靠的胆汁测定法测试酶活性，因为足量活性蛋白酶的可用性是颗粒酶研究的限制因素。该方法可以帮助回答该领域的关键问题，例如表征不同生物体中的新细胞死亡途径，或在全蛋白质组方法中鉴定新的蛋白酶底物表达大酶。首先在 20 毫升培养基中培养 HEC 2 93 T 细胞，使用 150 x 25 毫米的组织培养皿，以 80%Co 流畅度松散地分离细胞，但可以通过严格上下移液板来机械分离不含胰蛋白酶。
转染前一晚的细胞在转染当天的 co flulysis 为 60% 至 70%。通常的制备规格包括 20 到 25 个培养皿。转染前 1 小时将标准培养基更换为 20 mL 转染培养基，在 1 小时孵育步骤接近尾声时，在转染前 1 至 2 分钟将 400 μg 血浆 DNA 与 10.95 mL 双蒸水和 1.55 mL 2 mol 氯化钙混合在 50 mL 试管中。
在 12.5 毫升的两堆缓冲盐水中，将盐水缓冲到 12.5 毫升 DNA 钙溶液中，通过倒置试管混合，然后孵育 30 秒。在室温下，以每培养皿 5 mL 的浓度直接滴加到细胞中，均匀撒在整个区域，使培养基呈略带橙色。将培养皿在组织培养箱中孵育 7 至 11 小时。
孵育后，可以看到细小的沉淀物。去除转染培养基。用预热的 PBS 仔细冲洗并加入 20 毫升无血清培养基，然后在组织培养箱中孵育 72 小时，通过在 SDS 页面上运行细胞上清液样品并用 kumasi 染色来分析转染和表达效率。
亮蓝色。可视化颗粒酶条带。孵育后，将细胞培养上清液倒入 250 mL 试管中，并通过离心澄清。
进行第一次旋转，从分离的细胞中清除培养基。将上清液转移到新鲜的 250 毫升试管中，在 4 摄氏度下以 4， 000 Gs 离心 30 分钟，以去除任何残留的细胞碎片。接下来，加入 5 毫升氯化钠、6.25 毫升 tris 碱和 1 毫升硫酸镍以及 250 毫升澄清的上清液。
使用 500 毫升真空过滤装置过滤上清液。用 His 结合缓冲液平衡镍固定化金属离子亲和色谱柱。A 使用合适的 FPLC 系统。
然后在 4 摄氏度下以每分钟 0.5 毫升的流速将澄清的上清液涂在平衡柱上。上清液后，用其结合缓冲液洗涤色谱柱，直至达到紫外线或紫外线吸收基线。用 20 mL线性 ILE 梯度以 0.5 mL/min 的流速洗脱颗粒酶，同时收集 2 mL馏分。
通过 SDS 页面和 kumasi 染色分析 elucian 组分。将含有级分的大酶拉入令人眩晕的管中。将少量样品储存在零下 20 摄氏度作为肠前激酶对照。
将每 50 毫升初始上清液 0.02 单位的肠激酶直接加入透析管中的混合组分中，并在室温下在肠激酶缓冲液中透析过夜。第二天，通过 SDS 页面和 kumasi 蓝染色分析激酶处理的激酶与进入前激酶对照的比较。当终端处理完成时。
将透析缓冲液更换为 S 缓冲液 A，在室温下再透析 4 小时，然后过滤 DIALATE 8。接下来，用 S 缓冲液平衡 S 柱。A.上样后，在 4 摄氏度下以每分钟 0.5 毫升/分钟的流速将样品上样到色谱柱上。
用 S 缓冲液 A 洗涤色谱柱，直至达到 UV 吸收基线。用 30 mL 线性氯化钠梯度洗脱颗粒酶，颗粒酶 A 以约 650 毫摩尔的氯化钠洗脱，颗粒酶 B 以约 700 毫摩尔的氯化钠洗脱，颗粒酶 M 以约 750 毫摩尔的氯化钠洗脱。汇集含有颗粒酶的级分，并在离心过滤器中浓缩至约 100 微摩尔，分装浓缩的颗粒酶制剂并储存在零下 80 摄氏度。
接下来，通过 SDS 页面和胆汁测定分析 elucian 馏分，以进行 chole metric 测定，将来自 ellucian 馏分的小颗粒酶样品或浓缩原液分配到 96 中。平底板包括阳性对照和阴性对照。向每个中加入 100 微升测定缓冲液。
将板在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。最后，在酶标仪中测量 405 纳米处的光密度。该方案将产生高产量的纯颗粒酶，如该代表性的 kumasi 染色 SDS 页面凝胶所示，显示来自 S 柱的颗粒酶 BE。
重组颗粒酶显示出与天然蛋白酶制剂相似的活性，如该颜色测定中所示，比较了重组和天然颗粒酶 B 活性。重要的是，endo H 处理表明 HEC 2 93 T 细胞中产生的颗粒酶完全糖基化。重组大酶能够裂解大分子蛋白底物，如这种代表性的颗粒酶所示，这是一种使用细菌蛋白底物和 UOCD 的切割测定。
在这里，代表裂解的 N-O-U-C-D 的条带随着颗粒酶浓度的增加而缓慢消失。观看此视频后，您应该对如何在 HK 2 93 T 细胞中以高产量生产完全糖基化和促活性的大酶有很好的了解。
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概述
本文描述了一种利用HEK293T细胞的高效、低成本的粒酶表达系统。该方法能产生大量纯净、完全糖基化和具有酶活性的蛋白酶。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 蛋白质表达
- 酶的纯化
背景
- 粒酶是重要的丝氨酸蛋白酶，对免疫反应至关重要。
- HEK293T细胞常用于蛋白质生产。
- 高效的表达系统对研究和治疗应用至关重要。
- 以前的方法可能成本高昂或产生的活性酶量低。
研究目的
- 开发一种高效、低成本的粒酶生产方法。
- 确保酶完全糖基化且活性。
- 优化HEK293T细胞中粒酶生产的产量。
使用的方法
- 在组织培养皿中扩展HEK293T细胞。
- 使用磷酸钙进行粒酶表达质粒的瞬时转染。
- 收集细胞上清液以纯化粒酶。
- 通过固定金属亲和层析和阳离子交换层析进行纯化。
主要结果
- 从HEK293T细胞中获得了高产量的粒酶。
- 纯化后的酶被发现完全糖基化。
- 纯化后的酶活性得到确认。
- 该方法被证明比传统方法更具成本效益。
结论
- 开发的表达系统对粒酶生产有效。
- 该方法可以促进对粒酶的进一步研究。
- 它为生产活性蛋白酶提供了可扩展的解决方案。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-yield, cost-efficient production of fully glycosylated, enzymatically active human granzymes in mammalian cells addresses a critical bottleneck in immunology and protease research. This system enables robust supply of functional proteins for mechanistic studies, substrate identification, and pathway interrogation, supporting early discovery and target validation. Reliable access to active granzymes enhances predictive confidence and accelerates portfolio decisions in immune-oncology and infectious disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cytotoxic pathways and immune effector mechanisms using active, post-translationally modified granzymes.
- Supports identification of novel protease substrates in whole-proteome approaches for target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing sufficient enzyme for pathway clarification studies.
Screening & Assay Development
- Provides validated, active enzyme preparations for quantitative biochemical and cell-based assays.
- Ensures reproducibility and standardization in substrate cleavage and activity assays.
- Enables scalable production for high-throughput screening of protease modulators or inhibitors.
Translational & Preclinical Research
- Delivers functionally relevant enzymes for modeling immune cell-mediated cytotoxicity in disease-relevant systems.
- Supports translational biomarker discovery by enabling substrate profiling in human and pathogen proteomes.
- Bridges discovery and preclinical validation by supplying active proteins for in vitro and ex vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
This expression and purification system integrates at the interface of early discovery, assay development, and translational research, providing a reusable platform for functional protease supply.
- Discovery Biology: Supplies active granzymes for hypothesis testing and mechanistic studies of immune-mediated cell death.
- Screening: Delivers standardized enzyme preparations for reproducible, quantitative activity assays.
- Analytics: Enables robust measurement of protease activity and substrate cleavage for comparative analysis.
- Translational Research: Supports continuity from in vitro discovery to preclinical validation in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted for expression of diverse human enzymes, supporting multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune effector studies.
- Operational Value: Standardizes enzyme production, ensuring reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune-modulating therapeutics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture and protein purification workflows.
- Needs access to HEK293T cell lines, FPLC systems, and analytical instrumentation for activity assays.
- Demands cross-team standardization of transfection and purification protocols for reproducibility.
- Adaptable to other human enzymes with similar expression and purification requirements.
- Yield and activity may vary with enzyme type and post-translational modification needs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:40
Expression of Gzms in HEK293T Cells
3:52
Purification of Gzms from Culture Supernatant by Nickel-IMAC
5:25
Enterokinase (EK) Treatment and Final Clean-up by Cation Exchange Chromatography
7:46
Results: Analysis of Recombinant Granzymes by SDS-PAGE and Colorimetric Assays
8:47
Conclusion
