相关共聚焦显微镜与特定感觉细胞的三维电子显微镜观察

本实验的总体目标是记录天然肠组织中散在于其他上皮细胞之间的特定肠道感觉细胞的完整超微结构。首先从肠道获取一个 300 × 50 微米的组织片段，随后利用共聚焦显微镜获取该组织片段的光学 Z 轴层扫图像。

然后，共聚焦数据可作为指导，利用连续块面扫描电镜技术（SBEM）对组织进行处理和成像。最后，对SBEM数据进行分割，以三维形式重建特定肠道感受细胞的超微结构。最终实现共聚焦显微镜与连续块面扫描电镜的关联成像。

电子显微镜可用于展示特定细胞在其原生组织中的位置，并揭示其三维超微结构。该方法有助于回答细胞生物学领域的一些关键问题，例如在光学显微镜水平下无法观察到的特定细胞间相互作用。通过使用该方法，我们此前报道了感觉性肠内分泌细胞与肠胶质细胞之间一种隐蔽的物理化学关系。

根据文本方案分离小鼠结肠后，将其置于冰冷的PBS中，在浸没状态下沿肠系膜将组织切开，然后将组织转移至牙科蜡片上的数滴PBS中，使用解剖刀从远端结肠切取约六个小组织片段。制备5%低熔点琼脂糖PBS溶液后，用其将组织片段包埋于小型塑料容器中（例如标准尺寸的Tissue-Tek冷冻模具），将包埋好的组织块安装到振动切片机上，并用冰冻PBS填充缓冲槽。随后以0.8振幅和0.04毫米/秒的速度切出300微米厚的组织条带。

将300微米的组织条带置于琼脂糖中，垂直于刀片方向安装在切片机上。然后按照文本方案中的详细说明，将组织条带切成50微米厚度，之后将组织块保存在4°C的PBS中。根据文本方案使用共聚焦显微镜对组织块进行成像，随后将组织切片浸入树脂中进行包埋。

将组织从 PBS 中取出，用 0.1 摩尔的 co coate 缓冲液冲洗三次，每次五分钟。待树脂制备完成且组织按照文本方案完成透射电镜染色后，将包埋好的组织块夹在涂有液体脱模剂的玻片之间，在 60 摄氏度下再平置固化 48 小时。然后在解剖镜下将玻片分开，释放组织块，并将树脂包埋的组织块方向与共聚焦显微图像中的组织方向对齐。

为便于识别含有目标细胞的区域，将组织块平放在含有导电环氧树脂的针头上并干燥30分钟。随后将组织块平放于平面上，次日在60摄氏度下干燥过夜。用胶态银液体对组织块进行镀膜。

保持组织切片平整，以确保以正确角度对包埋块进行切片，从而便于连续块面与共聚焦显微图像的对应。按照文本方案完成扫描电镜观察后，在Fiji中使用0.8高斯模糊滤波器将SPEM图像从原始DM3格式转换为8位TIFF图像。对TIFF图像进行滤波处理。

将数据集缩小至原始大小的25%，并将其保存为TIFF图像栈，以尽量减少使用Fiji插件“线性图像栈配准（sift）”在平移模式下处理数据集时所需的RAM内存。对SPEM图像栈进行配准，并使用3D裁剪插件对其进行裁剪。为实现数据可视化，使用“表面工具”在绘制模式下勾画轮廓，设置绘制模式下的轮廓间隔为50毫秒，手动分割并进行三维体绘制目标细胞。

为获得更平滑的渲染效果，需在每个细胞切片上描记轮廓；若需更快的渲染速度，可每隔五个切片描记一次。使用快照工具，通过 P-Y-Y-G-F-P 鼠标以 300 DPI 或更高分辨率导出最终图像。小肠远端的所有肠内分泌细胞均已识别，并按此处所示方法进行SBEM处理。

通过共聚焦显微镜对选定的组织片段进行成像，以获取Zack图像，这些图像在光学上以一微米的间距分隔。优化组织块的尺寸对于共聚焦与SBEM数据之间的拓扑关联至关重要。该体积渲染图像显示了小鼠回肠中一个肠内分泌细胞，其下方可见一个显著的神经足样突起，延伸至上皮细胞下方约60微米处。

通过将共聚焦Z轴层扫图像与整个块面的SBEM图像进行关联，可在来自A-P-Y-Y-G-F-P小鼠远端结肠的组织块中识别出目标细胞。保持组织块尽可能平整的取向，对于与SBEM图像中的光学切片准确匹配至关重要。一旦识别出目标细胞，即以足够高的分辨率进行SBEM成像，以辨识分泌囊泡及其他细胞器。

本视频包含肠内分泌细胞的三维渲染图像。该数据集包含643张图像，覆盖组织深度达45微米。该细胞含有一个充满分泌囊泡的神经足结构以及微绒毛。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用荧光标记作为引导，识别天然肠组织中散在于其他上皮细胞之间的特定肠道感觉细胞，并对组织进行连续块面扫描电子显微镜处理，从而完整记录该感觉细胞的超微结构。