Name: 一个具体的感觉细胞的共聚焦相关和3D电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学习共聚焦相关和3D电子显微镜技术，用于研究肠道感觉细胞的超微结构。该方法结合共聚焦显微镜和连续块面扫描电镜，揭示细胞间隐藏的物理化学关系。

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我们向以下人员表示诚挚的感谢：杜克大学光学显微镜核心设施的 Sam Johnson 博士和 Benjamin Carlson 博士，感谢他们在数据可视化软件方面的协助；北卡罗来纳州立大学电子显微镜中心的 Valerie Lapham 女士和 John M. Mackenzie, Jr. 博士，感谢他们在电子显微镜技术方面的建议。我们感谢 Elaine B. Bohórquez 博士在编辑方面提供的帮助。作者贡献如下：DVB、SM 和 RAL 设计实验并分析数据；DVB 开展实验，FH 进行数据的手动渲染；SM 是 Renovo Neural 的负责人，SBEM 数据在此机构获得；DVB 撰写初稿，所有作者共同审阅并修改了最终稿件。本研究得到了美国国立卫生研究院资助 R01DK091946 和退伍军人事务部资助 I01BX002230（授予 RAL），以及 F32DK094704（授予 DVB）的支持。

所有动物护理和实验均按照杜克大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
Cocem3D 源于先前发表的多种实验方案10,11 的结合，并在此研究中应用于利用 PyyGFP 报告小鼠12 分析特定的肠内分泌细胞。该方法可便捷地推广至其他感兴趣细胞的研究，只需使用 commercially available 转基因报告小鼠即可。本方法分为三个部分进行描述：共聚焦显微镜相关分析、连续块面扫描电子显微镜（SBEM）以及三维数据重建。
相关共聚焦显微镜技术
本部分的目的是从远端结肠获取一段组织样本，其尺寸需满足进行共聚焦显微镜与扫描块面电子显微镜（SBEM）关联成像的要求。具体方案如下：
1. 组织的采集
<ol>
	<li>在 PBS 中配制 10 ml&#160;50 µg/ml 的肝素溶液。</li>
	<li>通过混合 10 ml 氯胺酮（100 mg/ml）和 1 ml 赛拉嗪（20 mg/ml）配制赛拉嗪/氯胺酮麻醉剂原液。
	<ol>
		<li>用 0.1 M PBS 将赛拉嗪/氯胺酮原液稀释 1:4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 PBS 中配制 100 ml 固定液，其中含 4% 多聚甲醛和 0.1% 戊二醛。</li>
	<li>对一只 6 至 10 周龄的 PyyGFP 小鼠，使用致死剂量的赛拉嗪/氯胺酮麻醉剂进行麻醉。按每 20 g 体重注射 0.15 ml 的剂量，行腹腔注射。</li>
	<li>通过夹捏小鼠尾巴或脚趾确认麻醉效果，并在眼睛上涂抹眼膏以防止干燥。</li>
	<li>使用可调流速的蠕动泵进行心脏灌注固定10。用手术剪刀（13 cm 长）切开腹腔，暴露肠、心脏和肺。用窄齿弯镊（12 cm 长）夹住心脏，将蠕动泵连接的蝴蝶针头（19 G）插入左心室。立即用弹簧直剪刀（刀头长 4 mm）剪开右心房。首先以 2 ml/min 的速度灌注肝素溶液 1 分钟，随后灌注冰冻固定液 15 分钟，直至小鼠尾巴完全僵硬。 
	注意：必须缓慢灌注，以防止肠黏膜中的小血管破裂。血管破裂会破坏组织的超微结构。若灌注充分，肝脏应在 3–5 分钟内变为苍白。</li>
	<li>用小剪刀切开腹腔，从盲肠连接处至远端直肠完整切除整个结肠。将组织置于冰冻 PBS 中。在 PBS 浸泡状态下，沿肠系膜用小弹簧剪刀将结肠纵向剪开。</li>
</ol>
2. 解剖并固定组织片段
<ol>
	<li>使用手术刀，在牙科蜡片上将远端结肠切成约6个微小组织片段（2 mm2），操作过程中滴加少量PBS保持浸润。</li>
	<li>将组织片段置于固定液中，在4 °C下后固定3小时。</li>
</ol>
3. 微解剖组织块
<ol>
	<li>配制5%低熔点琼脂糖PBS溶液，并置于45 °C水浴中保温。</li>
	<li>使用小型塑料容器（如标准尺寸的Tissue-Tek Cryomold）将组织片段包埋于5%低熔点琼脂糖中。</li>
	<li>将包埋好的组织块固定在振动切片机上，并在缓冲槽中加入冰冻PBS。</li>
	<li>以0.8振幅和0.04 mm/sec速度切取300 µm厚的组织条。注意：此时组织条会从琼脂糖中脱落。</li>
	<li>将300 µm厚的组织条重新包埋于琼脂糖中，并垂直于振动切片机刀片方向固定在切片机上。</li>
	<li>使用振动切片机将组织条切成50 µm厚的切片。注意：最终的组织块尺寸应约为300 µm宽 × 50 µm厚。该尺寸基于预实验共聚焦显微成像结果优化确定，结果显示肠内分泌细胞厚度为15–20 µm，神经足突长度为30–70 nm。因此，若细胞方向与组织块表面平行，则整个细胞可被包含在300 µm宽、50 µm厚的组织块内。可根据具体研究的组织和细胞类型调整上述尺寸。</li>
	<li>将组织块置于4 °C PBS中保存。</li>
</ol>
4. 共聚焦成像
<ol>
	<li>通过将 DAPI 按 1:4,000 的比例稀释于 PBS 中，配制细胞核染色液。</li>
	<li>将组织块置于 DAPI 细胞核染色液中孵育 5 分钟。注意：DAPI 染色可通过细胞核区分单个细胞，有助于共聚焦图像与扫描块面电子显微镜（SBEM）图像的对应。</li>
	<li>将组织块置于带电荷的玻片上，滴加数滴 PBS，并加盖盖玻片。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜识别具有完整绒毛及目标 PyyGFP 细胞的组织块，并对其进行成像以获取 z 轴堆叠的光学切片。
	<ol>
		<li>使用 20X/0.8 Zeiss Plan Apochromat 物镜获取 1 µm 光学切片的 z 轴堆叠图像。</li>
		<li>对于 z 轴堆叠图像，使用 405 nm（DAPI）通道确定与其他细胞的关系，488 nm 自发荧光 GFP 通道定位目标细胞，以及微分干涉差（DIC）通道确定细胞相对于管腔的位置。</li>
		<li>使用 1,024 像素或更高的图像分辨率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5.&#160; 在琼脂糖中包埋组织块
<ol>
	<li>配制10 ml固定液，其中含4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的PBS溶液。</li>
	<li>通过在盖玻片边缘小心加入PBS，使盖玻片从载玻片滑脱，从而取出组织块，注意避免损伤组织块。然后使用精细的美术画笔将组织块从载玻片转移至含有4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定液的1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下对组织块进行过夜后固定（O/N）。</li>
	<li>将组织块转移至PBS中，然后将其夹在两片载玻片之间，平埋于5%低熔点琼脂糖中。 
	注意：将组织块包埋于薄层琼脂糖中可便于后续染色过程中的操作。</li>
	<li>将琼脂糖切成方形，并在上方一侧切出一个缺口。注意：此步骤对于维持后续操作中的组织方向至关重要。</li>
	<li>将组织块置于含PBS的1.5 ml微量离心管中，于4 °C保存，待后续处理。</li>
</ol>
连续块面扫描电子显微镜技术（SBEM）
本节中，先对组织块进行制备，并以低倍率进行扫描电镜-块面成像（SBEM）。随后将组织块表面的概览图像与共聚焦数据进行关联，以确定含有目标细胞的区域。一旦确定该区域，即以7 nm/像素的分辨率和70 nm的切片厚度对组织进行成像。该分辨率足以分辨并区分致密核心分泌囊泡与其他细胞器。在肠内分泌细胞中，此类囊泡的直径介于100至150 nm之间13。具体步骤如下：
6. 组织切片染色
<ol>
	<li>将组织从 PBS 中取出，在 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液中清洗三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在含有 0.1% 鞣酸的 0.1 M 卡可基酸缓冲液中染色 1 小时，以增强细胞膜的对比度14.</li>
	<li>根据已发表的方案对组织进行后续染色和脱水11. 按照Deerinck等人的方案，配制以下溶液：1) 1% (w/v) 硫代碳酰肼（THC）；2) 铅天冬氨酸盐溶液；3) 1% 醋酸铀酰；4) 四氧化锇/亚铁氰化钾（OsO₄/K₄Fe(CN)₆）4/K 铁氰化钾）。混合 4% OsO4 以及2倍K铁氰化物储存液［10 ml H₂O中含0.3 g K₃Fe(CN)₆和0.86 g Na Cacodylate］2O] 按1:1比例混合以制备OsO4/K 铁氰化钾。注意：将组织包埋在琼脂糖中有利于染色过程中的操作。后续进行树脂渗透前，需小心去除琼脂糖。</li>
	<li>用 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液冲洗样品三次，每次 5 分钟，然后在 4 °C 下用 OsO₄/K 亚铁氰化物溶液染色 2 小时。</li>
	<li>用超纯水冲洗三次，每次5分钟，然后在60 °C下用TCH染色30分钟。</li>
	<li>用超纯水冲洗三次，每次5分钟，然后用2% OsO₄染色4 （不含 K₄[Fe(CN)₆]）室温孵育 60 分钟。再用超纯水洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用1%醋酸铀在4 °C下染色过夜，然后用超纯水冲洗三次，每次5分钟。</li>
	<li>用铅天冬氨酸在60 °C下染色30分钟。用超纯水冲洗三次，每次5分钟。</li>
	<li>通过用浓度递增的乙醇溶液冲洗组织进行脱水。分别用50%、75%、85%、95%和纯100%乙醇各冲洗2次，每次5分钟。最后用丙烯酸甲酯冲洗切片2次，每次10分钟。</li>
</ol>
7. 组织切片的浸润与树脂包埋
<ol>
	<li>使用市售试剂盒用树脂浸透组织块。使用环氧树脂包埋试剂盒将组织包埋于树脂中。配制由48%环氧树脂、20% ml DDSA、30% ml NMA和2% DMP30组成的树脂混合液。剧烈震荡混合液5分钟，然后将混合液置于真空环境中30分钟，使气泡上升至表面。</li>
	<li>将树脂与丙烯氧化物按1:1比例混合并剧烈振荡。去除组织的最终脱水液，加入与丙烯氧化物混合的树脂。将装有样品的瓶子置于旋转仪中过夜，并保持瓶口敞开。次日，加入新配制的环氧树脂，在旋转仪中混合90分钟。</li>
	<li>通过将组织块夹在已涂覆液体脱模剂的载玻片之间，尽可能平整地将其包埋于树脂中，以防止载玻片相互粘连15。</li>
	<li>当组织块被平整包埋后，在60 °C下额外固化48小时。</li>
	<li>将载玻片分开以释放组织块。</li>
</ol>
8. 成像用组织块的包埋与修块
<ol>
	<li>在解剖镜下，将树脂包埋的组织块方向与共聚焦显微图像的方向对齐，以便在修块前识别含有目标细胞的区域。</li>
	<li>手动修块，将树脂包埋的组织块修整至约 500 × 500 µm 的切面。</li>
	<li>将组织块平整地固定在含有导电环氧树脂的样品钉上，干燥 30 分钟。然后将组织块平放于表面，在 60 °C 下过夜干燥&#160;。</li>
	<li>用胶体银溶液包被组织块表面。保持组织切面平整，以确保切片时切割面与块面垂直，便于连续块面图像与共聚焦显微图像的关联比对。</li>
</ol>
9. 扫描电镜块面成像（SBEM）
<ol>
	<li>使用配备 SBEM 系统的扫描电子显微镜对样品块进行成像（例如， 3View</li>
	<li>以约 2 µm 的厚度为初始切片区间进行切片，直至组织表面从包埋块中露出。</li>
	<li>获取整个块面的扫描图像。</li>
	<li>使用 Fiji 软件对连续块面成像和共聚焦显微图像进行测量，以获得共同的参照基准，并校正样品在固定和染色过程中可能产生的形变16.</li>
	<li>通过将共聚焦图像中坐标的分母乘以相应倍数，在包埋块表面定位目标区域。同时利用其他结构特征，如微绒毛、杯状细胞或固有层的位置，作为参考。</li>
	<li>在高真空模式下，以2.25 kV电压和7 nm/像素（或15,147倍放大倍数）采集感兴趣区域图像。切片增量应设置为70 nm或更小。</li>
	<li>以原始16位.dm3格式采集SBEM数据。</li>
</ol>
10. 优化SBEM图像以进行表面分割
<ol>
	<li>将SBEM图像从原始的.dm3格式转换为8位.tiff格式。</li>
	<li>在Fiji中使用0.8高斯模糊滤波器对.tiff图像进行滤波。</li>
	<li>将数据集缩小至原始尺寸的25%，并将其保存为.tiff图像栈，以最小化处理该数据集所需的RAM内存。</li>
	<li>使用Fiji插件“基于SIFT的线性图像栈对齐”在平移模式下对SBEM图像栈进行对齐，并使用“3D裁剪”插件进行裁剪。注意：裁剪有助于进一步减少分割和体渲染所需的RAM内存。</li>
</ol>
三维数据渲染
11. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>使用“surfaces”工具的自动超越模式重建z轴图像堆栈。图1D展示了启用平滑选项、表面区域细节设为0.126 µm、阈值化采用绝对强度时各通道的重建结果。</li>
</ol>
12. 连续块面扫描电镜
注意：手动数据分割是一项非常耗时的流程，根据需要呈现的特征不同，该过程可能需要数周时间。本文中所示视频和图像的分割工作由 Bohórquez 完成 等 20148 手动完成，耗时约500小时。建议在开始分割之前，优先确定需要渲染的关键特征。操作步骤如下：
<ol>
	<li>在绘制模式下使用“surfaces”工具，并在绘制模式中选择50毫秒的“contour”选项，对手动分割的目标细胞进行体积渲染。</li>
	<li>对细胞的每一层切片进行轮廓描记以获得更平滑的渲染效果，或每隔5层切片描记一次以加快渲染速度。</li>
	<li>使用“snapshot”工具以300 dpi或更高分辨率导出最终图像。</li>
</ol>

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</ol>

Satish Medicetty 博士是 Renovo Neural 公司的雇员，并从该公司获得100%的薪酬；但此情况并不影响作者遵守 JoVE 关于数据和材料共享的政策。其余作者声明无利益冲突。

胃肠道化学感应正成为生物医学研究中一个令人振奋的新领域。这在很大程度上得益于在肠内分泌细胞中发现了功能性味觉受体18。后续研究表明，肠内分泌细胞表达针对营养物质的特异性受体，包括碳水化合物、脂质和氨基酸5,6,19,20。推动这些发现的关键是报告基因小鼠模型的开发，其中肠内分泌细胞被荧光标记20。我们开发了其中一种小鼠模型——PyyGFP 小鼠，用于研究远端小肠和结肠的肠内分泌细胞17,21。这些细胞备受关注，因为它们分泌PYY和胰高血糖素样肽1，二者均为饱腹感的诱导因子22,23。当时，这些细胞完整的超微结构描述尚属空白，而我们认为这对于理解其信号传导机制至关重要。
本文介绍了一种直观的可视化方法，用于将共聚焦显微镜与扫描块面电子显微镜（SBEM）相结合。该方法被称为 Cocem3D，使我们能够完整记录肠内分泌细胞的超微结构。我们已报道，这些细胞具有一个神经足样突起（neuropod），其中包含了四分之三以上的全部分泌囊泡8。在神经足样突起内部存在神经丝结构，并且与神经元轴突类似，神经足样突起由肠胶质细胞提供营养支持8。更重要的是，肠内分泌细胞正是通过这些神经足样突起，与支配肠道和结肠的神经元建立直接的物理连接9。
cocem3D 的优势之一在于其简便性。将组织样本简化为可由共聚焦显微镜和扫描块面电子显微镜（SBEM）成像的组织块，有助于在组织中识别特定细胞。在 7 nm/像素的分辨率下，可轻松识别分泌囊泡及其他细胞器。由于 SBEM 中的切片会被丢弃，因此目前无法对组织进行进一步处理以鉴定特定蛋白质。然而，随着 ATUM24 等技术的发展，组织块的切片得以保存，未来有望实现对细胞内特定蛋白质的鉴定。确定肠内分泌细胞上化学感受受体的具体位置，对于开发治疗肥胖的药物疗法至关重要，因为肠内分泌细胞是肠道内食物信号与大脑饱腹感之间的感觉界面。

细胞内的生命活动在时间和空间中进行。随时间发生的变化通常通过延时显微镜结合荧光成像技术（如超分辨率显微镜）进行研究。而空间信息，特别是细胞内细胞器的排列方式或细胞间的相互作用，只能通过全面解析细胞的精细结构来获得。当基因组信息可获取时，对细胞精细结构的系统性描述还有助于阐明基因组功能，例如在 秀丽隐杆线虫 线虫1 或扁平的丝盘虫（Tricoplax adherens）2连续切片电子显微镜技术如今已成为一种可重复、高效且成本较低的研究方法，这得益于自动化的三维电子显微镜技术的发展，例如连续块面扫描电子显微镜（serial block-face scanning electron microscopy）。3 （SBEM）。
在某些细胞类型中，功能依赖于细胞间的物理相互作用（例如神经元、胶质细胞或感觉上皮细胞），因此获取结构信息以阐明其功能显得尤为重要。我们尤其关注肠道腔内营养物质产生的感觉信号如何被转导为电信号，进而调控摄食相关行为的机制。该神经回路较为复杂，起始于肠壁，在此处营养物质与感觉上皮细胞（称为肠内分泌细胞）接触。与其他类型的感觉上皮细胞（如味觉细胞）不同，肠内分泌细胞以大约一千个上皮细胞中有一个的比例弥散分布于整个肠道上皮中4-7。因此，长期以来这些细胞难以被识别和研究，仅被视为肠道激素的来源。然而，随着细胞特异性荧光报告小鼠模型的发展，这些细胞复杂的感觉功能逐渐被揭示。利用其中一种报告小鼠——肽酪氨酸-绿色荧光蛋白（Pyy-GFP, PyyGFP）小鼠，我们发现肠内分泌细胞具有一条显著的细胞质突起，将其命名为“神经足”（neuropod）。神经足的形态提示其可能在细胞间通讯中具有保守的功能。因此，我们推断，通过记录肠内分泌细胞的超微结构，可进一步推导出神经足的功能。
为了理解难以识别的分散细胞中附属结构的形态，有必要开发一种将共聚焦显微镜与扫描块面电子显微镜（SBEM）相结合的方法。通过使用PyyGFP肠内分泌细胞特异性报告小鼠，我们鉴定了目标细胞。该方法使我们能够完整记录肠内分泌细胞及其神经足的全部超微结构。在神经足内部，我们发现了类似神经元轴突的结构特征；而在神经足外部，则观察到其与肠胶质细胞之间存在物理联系8。事实上，神经足包含了约70%的全部分泌囊泡，提示其在这些细胞的分泌功能中具有关键作用。基于这些结构数据，我们近期进一步发现，肠内分泌细胞通过神经足与支配肠道的神经元形成了一种神经上皮回路，类似于舌部味觉细胞所构成的回路8,9。
揭示胃肠化学感受机制的这些特征源于使用该相关显微技术所获得的结构数据。我们认为，该方法在细胞生物学的其他领域也可能具有应用价值，特别是在细胞在组织中以极低比例分散的情况下。我们将该方法称为三维共聚焦与连续块面扫描电镜相关显微技术（Cocem3D）。该方法主要包括以下步骤：组织解剖、共聚焦显微镜观察、SBEM成像、SBEM与共聚焦图像关联以及人工分割。与其他相关显微方法相比，该方法的概念较为简单，因为其关联方式是基于物理位置而非化学标记。

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4%，新鲜配制于PBS中，终pH值为7.4</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>牙科蜡</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Life technologies</td><td>16520-100</td><td>5%，新鲜配制于PBS中</td></tr><tr><td>标准Tissue-Tek冷冻模具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62534-25</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp; 核染色剂</td><td>Life technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>带正电荷的玻片和盖玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细画笔#1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡考基酸缓冲液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>11650</td><td></td></tr><tr><td>单宁酸</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>EMbed 812试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>液体脱模剂&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70880</td><td></td></tr><tr><td>液体银胶体&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>CircuitWorks导电环氧树脂&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ITW Chemtronics</td><td>CW2400</td><td></td></tr><tr><td>可调流速蠕动泵</td><td>VWR</td><td>70730-064</td><td></td></tr><tr><td>VT1200S振动切片机</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔡司780i共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma VP扫描电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3view系统</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Renovo Neural Inc（俄亥俄州克利夫兰）</td><td></td><td>http://www.renovoneural.com</td><td>Renovo提供三维电镜服务</td></tr><tr><td>Fiji软件</td><td>开源软件</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备16 GB或更高内存的计算机工作站</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据可视化软件Imaris 7.5&amp;nbsp;</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

明确细胞的超微结构对于理解其功能至关重要。对于分散在由多种细胞类型构成的组织中的稀有细胞类型（例如肠上皮中的肠内分泌细胞），这一研究项目可能极具挑战性。这些感知胃肠道内食物和细菌的细胞难以研究，因其以1:1,000的比例弥散分布于其他上皮细胞之间。近年来，已开发出转基因报告小鼠，可通过荧光标记识别肠内分泌细胞，其中一种为肽YY-GFP小鼠。利用该小鼠模型，我们建立了一种关联共聚焦显微镜与连续块面扫描电镜成像的方法，命名为cocem3D，并将其应用于在组织中识别特定的肠内分泌细胞，进而以三维形式揭示其超微结构。cocem3D的分辨率足以识别小至分泌囊泡的细胞器，并可区分细胞膜以实现三维体积重建。该方法可轻松拓展，用于研究其他特定细胞类型在其原生组织中的三维超微结构。

本文所述方法用于研究上皮层中特定细胞的超微结构。此处关注的细胞为难以识别的肠内分泌细胞。其鉴定 原位 只有在最近几年，随着细胞特异性荧光报告小鼠的发展，这一目标才得以实现。2011年，我们开发了一种小鼠模型，其中激素PYY的启动子驱动绿色荧光蛋白的表达17在该PyyGFP小鼠中，小肠远端和结肠的肠内分泌细胞在紫外光下易于辨识。该小鼠模型为识别包含肠内分泌细胞的组织块并将其用于扫描块面电子显微镜（SBEM）处理提供了基础。此处所述的相关方法称为cocem3D，是在先前已发表的方案基础上建立的。10,11.
优化组织块的尺寸对于相关性研究至关重要。在初步实验中确定，当组织块尺寸为长 300 µm × 厚 50 µm 时，可在覆盖目标细胞完整胞体的同时，将SBEM图像数量降至最低。图1A展示了使用振动刀切片机进行解剖以获得合适尺寸组织块的概览图。在筛选出含有完整目标细胞的组织块之前，至少需获取100个组织块。选出的组织块通过共聚焦显微镜成像，图像z轴堆栈的光学间距为每1 µm一个切片（图1B和图1C）。图1D显示了小鼠回肠中一个肠内分泌细胞的三维重建视图。其显著的神经足突在上皮细胞下方延伸约60 µm。
通过将共聚焦z轴层扫图像与整个块面的SBEM图像进行关联，可定位目标细胞。此处以PyyGFP小鼠远端结肠组织块为例进行说明。在获取共聚焦z轴层扫图像（图2A）后，将组织块包埋于一层薄的低熔点琼脂糖中（图2B），以便后续操作。为使光学切片与SBEM切片准确对应，需尽可能保持组织块方向平整。图2C展示了该组织块整个表面的代表性图像，该图部分内容此前已发表于Bohorquez 等，20148。随后，通过参考组织解剖标志和尺寸，将该图像与共聚焦图像进行关联配准。图2D显示了共聚焦图像与SBEM图像的叠加结果，清晰揭示了目标细胞的精确位置。
确定细胞后，需以足够高的分辨率进行SBEM成像，以便识别分泌囊泡及其他细胞器。本研究所呈现的数据集在每像素7 nm的分辨率下成像，每切削70 nm采集一次块面图像。该数据集共包含643幅图像，覆盖组织深度达45 µm。在低倍率下对整个块面进行初始成像时，会削去数微米的表面层。原始SBEM数据集以.dm3格式采集，随后转换为.tiff格式以便后续处理。使用Fiji软件的“crop (3D)”插件对SBEM图像堆栈进行裁剪，仅保留感兴趣区域，从而减少体积渲染所需的RAM内存。通过细胞位置及其分泌囊泡特征识别目标细胞，并使用Imaris软件进行分割。图3展示了肠内分泌细胞的三维重建图像。
<img alt="小鼠组织切片与分析；步骤包括切片、使用相关共聚焦显微镜成像。" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1">
图1：相关共聚焦显微镜成像。（A）将一段肠组织解剖成尺寸为300 × 50 µm厚的组织块的工作流程。（B）一个具有合适尺寸的代表性组织块。请注意，从小鼠小肠获取的该尺寸组织块大约跨越3个绒毛，而在结肠中则约包含8个隐窝。（C）小肠中的一个绒毛，其中包含一个目标细胞。（D）使用Imaris软件将共聚焦z轴层扫数据重建为三维图像，显示了一个具有显著神经足突（neuropod）的肠内分泌细胞，该突起位于肠上皮下方。蓝色 = DAPI染色的细胞核。标尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="连续块面扫描电子显微镜；用于分析的组织示意图和显微图像。" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：连续块面扫描电子显微镜。（A）结肠中含PyyGFP肠内分泌细胞（绿色）的目标组织块的共聚焦图像。（B）组织块经共聚焦显微镜成像后，使用载玻片将其平埋于低熔点琼脂糖中。将组织块包埋于琼脂糖中有利于后续操作，左侧角落的切口有助于将组织块以正确方向安装至SBEM中。（C）组织块表面的SBEM图像。（D）共聚焦数据与SBEM图像的关联，用于识别目标细胞（白色箭头）。本图中c和d的图像经修改自Bohorquez et al., 20148。蓝色 = DAPI细胞核染色。标尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于细胞结构研究的生物电子显微镜图像中神经足突和微绒毛的三维渲染。" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：三维数据渲染。（A）使用Imaris软件对肠内分泌细胞进行的体渲染。该细胞包含一个富含分泌囊泡的神经足突。有关肠内分泌细胞超微结构的完整描述，请参见Bohórquez et al., 20148。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种名为cocem3D的方法，该方法通过整合共聚焦显微镜与连续块面扫描电子显微镜技术，揭示特定细胞在其原生组织中的超微结构。

阐明细胞的超微结构对于理解其功能至关重要。这对于分布稀疏的稀有细胞类型而言可能是一项艰巨的任务……

本实验的总体目标是记录天然肠组织中散在于其他上皮细胞之间的特定肠道感觉细胞的完整超微结构。首先从肠道获取一个300 × 50微米的组织片段，随后利用共聚焦显微镜获取该组织片段的光学Z轴层扫图像。然后，共聚焦数据可作为指导，用于通过连续块面扫描电镜（SBEM）对组织进行处理和成像。最后，对SBEM数据进行分割，以三维形式重建特定肠道感受细胞的超微结构。最终实现共聚焦显微镜与连续块面扫描电镜的关联成像。电子显微镜用于展示特定细胞在其原生组织中的位置，并揭示其三维超微结构。该方法有助于回答细胞生物学领域的一些关键问题，例如在光学显微镜水平下无法观察到的特定细胞间相互作用。通过使用该方法，我们此前报道了感觉性肠内分泌细胞与肠胶质细胞之间一种隐蔽的物理化学关系。根据文本方案分离小鼠结肠后，将其置于冰冷的 PBS 中，在浸没状态下沿肠系膜将组织纵向剖开，然后将组织转移至牙科蜡片上的数滴 PBS 中，使用解剖刀从远端结肠切取约六个小组织片段。制备 5% 低熔点琼脂糖 PBS 溶液后，用其将组织片段包埋于小型塑料容器中（例如标准尺寸的 Tissue-Tek 冷冻模具），将包埋好的组织块安装到振动切片机上，并用冰冻 PBS 填充缓冲槽。随后以 0.8 振幅和 0.04 毫米/秒的速度切出 300 微米厚的组织条。将300微米的组织条带置于琼脂糖中，垂直于刀片方向将其固定在切片机上。然后按照文本方案中的详细说明，将组织条带切成50微米厚度，再将组织块置于4摄氏度的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存。随后根据文本方案，使用共聚焦显微镜对组织块进行成像，以实现组织切片的树脂浸润与包埋。将组织从 PBS 中取出，用 0.1 mol 的 co coate 缓冲液冲洗三次，每次五分钟。待树脂准备好且组织按文本方案完成透射电镜染色后，将包埋好的组织块夹在经液体脱模剂处理的载玻片之间，于 60 摄氏度下再平放固化 48 小时。然后在解剖显微镜下将载玻片分开以释放组织块，比对树脂包埋组织块的方向与共聚焦显微图像中的方向。为了便于识别含有目标细胞的区域，将组织块平放在含有导电环氧树脂的针上，干燥30分钟。然后将组织块平放于平面上，于次日在60摄氏度下干燥过夜。用胶体银溶液对组织块进行镀膜。保持组织切片平整，以确保以正确角度对包埋块进行切片，从而便于关联连续块面与共聚焦显微图像。按照文本方案完成扫描电镜观察后，在Fiji中使用0.8高斯模糊滤镜将SPEM图像从原始DM3格式转换为8位TIFF图像。对TIFF图像进行滤波处理。将数据集缩小至原始大小的25%，并将其保存为TIFF图像栈，以尽量减少使用Fiji插件“线性图像栈配准（SIFT）”在平移模式下处理数据集所需的RAM内存。对SPEM图像栈进行配准，然后使用3D裁剪插件进行裁剪。为实现数据可视化，使用“表面工具”在绘制模式下操作，并设置50毫秒的等值面绘制模式，以手动分割并进行目标细胞的三维体绘制。为获得更平滑的渲染效果，需在每个细胞切片上描记轮廓；若需更快的渲染速度，可每五个切片描记一次。使用快照工具，通过 P-Y-Y-G-F-P 鼠标以 300 DPI 或更高分辨率导出最终图像。小肠远端的所有肠内分泌细胞均已识别，并按此处所示进行 SBEM 处理。通过共聚焦显微镜对选定的组织片段进行成像，以获取Zack图像，这些图像在光学上以一微米的间距分隔。优化组织块的尺寸对于共聚焦与SBEM数据之间的形貌学关联至关重要。该图像展示了小鼠回肠中一个肠内分泌细胞的三维重构视图，显示了一个显著的神经足样结构，其在上皮细胞下方延伸，长度约为60微米。通过将共聚焦显微镜的Z轴层扫图像与整个块面的SBEM图像进行关联，此处可在来自A-P-Y-Y-G-F-P小鼠远端结肠的组织块中识别出目标细胞。保持组织块尽可能平整的取向至关重要，以使其与SBEM图像中的光学切片相匹配。一旦确定了目标细胞，即以足够高的分辨率进行SBEM成像，以识别分泌小管及其他细胞器。本视频包含肠内分泌细胞的三维渲染图像。该数据集包含643张图像，覆盖组织深度达45微米。该细胞含有一个富含分泌颗粒的神经足结构以及微绒毛。观看本视频后，您应能充分理解如何利用荧光标记作为引导，识别天然肠道组织中散布于其他上皮细胞之间的特定肠道感觉细胞，并对组织进行连续块面扫描电子显微镜分析，从而完整记录该特定感觉细胞的超微结构。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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