一个具体的感觉细胞的共聚焦相关和3D电子显微镜

该程序的总体目标是记录散布在天然肠道组织中其他上皮细胞中的特定肠道感觉细胞的完整超微结构。这是通过首先从肠道获得 300 x 50 微米的组织片段来实现的。接下来获得段使用共聚焦显微镜的光学 Z 堆栈。

然后，共聚焦数据用作使用连续块面扫描电子显微镜或 SBEM 处理和成像组织的指南。最后，对 SBEM 数据进行分割，以 3D 形式呈现特定肠道传感器细胞的超结构。最终相关共聚焦显微镜和连续块面部扫描。

电子显微镜用于显示其天然组织中的特定细胞，并以 3D 形式揭示其超微结构。这种方法可以帮助回答细胞生物学领域的关键问题，例如在光学显微镜水平上无法可视化的特定细胞间相互作用。通过使用这种方法，我们之前报道了感觉进入内分泌细胞和进入 ggl 之间隐藏的物理化学关系。

分离小鼠结肠后，根据文本方案，将其放入冷的 PBS 中，同时浸入水中，沿中间膜切开组织，将组织转移到一张牙蜡上的几滴 PBS 中，并使用手术刀从远端结肠切割大约六个小组织段。在 PBS 中制备 5% 低熔点 aros 后，用它将组织片段嵌入一个小塑料容器（例如标准尺寸的 Tissue Tech 冷冻模具）中，将包埋的切片安装在振动刀片切片机上，并使用冰冷的 PBS 填充缓冲托盘。然后以 0.8 振幅和 0.04 毫米/秒的速度切割 300 微米的组织条。

将 300 微米的组织条卷成 aros，并将它们安装在垂直于刀片的微音上。然后，参考文本协议切下 50 微米厚度的组织条带，了解详细信息，然后将块储存在 4 摄氏度的 PBS 中。根据文本方案使用共聚焦显微镜对组织块进行成像后，将组织切片浸润并嵌入树脂中。

从 PBS 中取出组织，使用 0.1 摩尔椰油缓冲液冲洗 3 次，每次 5 分钟。一旦树脂准备好并且组织已经为电子显微镜染色，根据文本方案，用它将其夹在用液体脱模剂固化的载玻片之间组织块包埋组织块后，在 48 摄氏度下平放固化块再 60 小时。然后将载玻片拉开，在解剖镜下释放块，将嵌入树脂中的组织块的方向与共聚焦显微照片的方向匹配。

为了便于识别包含目标细胞的区域，请将模块平放在含有导电环氧树脂的针脚上并干燥 30 分钟。然后将块平放在表面上，第二天在 60 摄氏度下干燥过夜。用胶体银液体涂覆块。

保持组织切片平整，以确保以正确的角度切片块，以便于关联连续块面和共聚焦显微照片。根据文本协议进行扫描电子显微镜后，在斐济使用 0.8 高斯模糊过滤器将 SPEM 图像从原始 DM 3 格式转换为 8 位 TIFF 图像。过滤 TIFF 图像。

将数据集缩小到原始大小的 25% 并将其保存为 TIFF 堆栈，以最大限度地减少使用 Fiji 插件线性堆栈对齐和转换模式下的 sift 处理数据集所需的 RAM 内存量。对齐 SPEM 图像堆栈并使用 Crop 3D 插件对其进行裁剪。要渲染数据，请在绘制模式下使用 surfaces 工具，在 50 毫秒的绘制模式下使用 contour 选项，以手动分割和体积渲染感兴趣的单元格。

在单元格的每个切片上跟踪轮廓以实现更平滑的渲染，或每五个切片跟踪轮廓以加快渲染速度。使用快照工具，通过 P-Y-Y-G-F-P 鼠标以 300 DPI 或更高的分辨率导出最终图像。小肠远端部分的所有肠内分泌细胞都被识别和处理为 SBEM，如图所示。

通过共聚焦显微镜对选定的组织片段进行成像，以获得 Zack 图像，这些图像在光学上相距 1 微米。优化组织块的尺寸对于共聚焦和 SBEM 数据之间的形貌相关性至关重要。小鼠回肠中肠内分泌细胞的体积渲染视图显示，在上皮细胞下方延伸约 60 微米的突出神经豆荚。

通过将共聚焦 Z 堆栈与整个块面的 SBEM 图像相关联，在 A-P-Y-Y-G-F-P 小鼠远端结肠的块中识别出感兴趣的细胞。重要的是要保持块的方向尽可能平坦，以匹配 SBEM 图像中的光学切片。一旦确定了细胞，SBEM 成像就以足够高的分辨率进行，以识别分泌型 sles 和其他细胞器。

该视频包含肠内分泌细胞的 3D 渲染图。该数据集包含 643 张图像，跨越 45 微米的组织深度。该细胞包含一个充满分泌 les 和微绒毛的神经豆荚。

看完这个视频后，你应该对如何记录特定肠道的完整超结构有一个很好的了解，通过使用荧光作为指导来识别感兴趣的细胞或细胞，并处理组织进行连续的阻断相位扫描电子显微镜检查，从而分散在天然肠道组织中的其他上皮细胞中。