通过RAFT控制聚合轻便和高效制备三组分荧光Glycopolymers

该程序的总体目标是使用可逆加成碎裂、链转移或筏聚合对荧光统计线性糖聚合物进行良好控制的合成。这是通过首先合成糖单体两种乳酸生物乙基甲基丙烯酰胺或 L-A-E-M-A 来实现的。第二步是采用L-A-E-M-A-N二氨基乙基甲基丙烯酰胺，或A EMA和N二羟乙基丙烯酰胺或A-GAA的筏聚合，合成相应的低分散性糖聚合物。

接下来，通过与羧基荧光素 xito 中间酯反应，将糖聚合物在其伯胺之一上改性，以产生荧光素化的糖聚合物。最后一步是将荧光素天然糖聚合物与具有已知碳水化合物结合特异性的凝集素包被的 Arose 珠子结合。最后，使用荧光显微镜分析糖聚合物与糖珠的结合，确认糖聚合物具有感兴趣的碳水化合物并用荧光标签标记。

与采用传统自由基聚合的现有方法相比，RAF 聚合的优势在于 wrath 工艺是一种控制聚合技术，可最大限度地减少引发剂衍生链的数量。这导致聚合物具有预定分子量和非常窄的多聚分散架。聚合可应用于确定的单体混合物，以制备特定的荧光糖聚合物。

这些糖聚合物具有明确的结合能力，可以通过使用凝集素包被的微珠来验证。荧光糖聚合物的高效制备应证明对未来的糖生物学研究具有重要价值。首先，将 2 克乳酸溶解在 3 毫升无水甲醇中。

接下来，慢慢滴加无水乙醇到溶液中，直到它变成浑浊。使用旋转蒸发器去除所有溶剂。重复此过程 3 次，以 98% 的产量生产 1.94 克乳生物 1 5 内酯。

将 1 克乳酸生物内酯溶于 3 毫升甲醇的溶液中加入到 A EMA 和 MEHQ 溶于 2 毫升甲醇的溶液中。接下来，加入 1 毫升三乙胺并在室温下搅拌混合物。48 小时后，向混合物中加入 20 毫升去离子水，并将其转移到旋转蒸发器中。

蒸发至完全干燥。将残留物溶解在 20 mL 去离子水中，然后将溶液涂在 10 x 20 mm 阴离子交换柱的顶部。将含有 1 毫克 MEHQ 的烧杯放在出口下方，然后将色谱柱洗脱到烧杯中。

在旋转蒸发器中抽取溶液后，将残留物溶解在 20 毫升去离子水中，并加入 1 毫克等分试样的离子交换树脂。在消火栓测试呈阴性之前，在消火栓测试中，去除 1 微升溶液并将其涂抹在薄层色谱板上进行。用 2%anhy 的乙醇溶液喷洒板，并在热板上以 90 摄氏度加热 1 分钟。

当没有形成蓝色时，已到达终点。接下来，通过烧结玻璃漏斗将溶液过滤到试管中。将溶液在零下 80 摄氏度冷冻，然后将其转移到冻干机中进行冷冻干燥。

将残留物溶于最少量的甲醇中，并加入零下 20 摄氏度和无水丙酮使产物沉淀。通过烧结玻璃漏斗过滤收集沉淀的 L-A-E-M-A。将漏斗和沉淀物转移到真空干燥液中，首先在 2 毫升试管中将 0.5 克约 150 目氧化铝纳米颗粒干燥到 1 毫升商业级 HEAA 中。

将试管以 300 倍 G 离心 30 秒，并使用顶层作为不含抑制剂的 HEAA，小心溶解 32.8 毫克 L-A-E-M-A、1.7 毫克 EMA 和 27.5 微升不含抑制剂的 HEAA 和 0.4 毫升去离子水，并将溶液转移到干净净的 1 毫升侧面管中。接下来，向试管中加入 50 微升筏试剂和 50 微升引发试剂，并在阀门关闭的情况下轻轻敲击试管的侧面进行混合。将试管连接到真空管路，并使用干冰乙醇浴冷冻内容物。

然后用泵将管压力降低到 50 毫托并关闭阀门。取出干冰浴，让内容物解冻。更小心地重复冷冻、真空和解冻循环两次。

检查试管以确保内容物完全溶解，并在需要时轻轻涡旋。就座前，从真空管路中取出封闭的管子，放入透明塑料真空袋中。用塑料手动泵排空袋子中的空气。

然后将袋子放入 70 摄氏度的有盖水浴中 24 小时。接下来，从袋子中取出试管，将其内容物转移到截留分子量为 3， 500 道尔顿的透析袋中。将透析袋放入烧杯中，用 2 升去离子水透析 24 小时。

将透析袋内容物转移到试管中，并将其放入零下 80 摄氏度的冰箱中。冷冻后，转移到冻干机中并冷冻干燥。要首先获得蓬松的白色糖基聚合物 PMA LA EMA，请在 0.9 毫升 PBS 中制备 5 毫克 PMA LA EMA 的溶液。

接下来，在快速搅拌的溶液中缓慢加入 0.6 毫克羧基荧光素 cin，在 100 中加入 100 微升二甲基甲酰胺，将微量试管和箔纸加入，在室温下缓慢搅拌 16 小时，将溶液转移到截留分子量为 3， 500 道尔顿的透析袋中。将袋子放入烧杯中，用 2 升去离子水透析 16 小时，同时保持避光。将透析袋内容物转移到试管中。

溶液在零下 80 摄氏度冷冻后，冷冻干燥。为了获得蓬松的黄色荧光标记的 P-M-A-L-A-E-M-A，糖聚合物，使用 HPLC 系统测定糖聚合物的数量平均分子量、重量、平均分子量和分散性。首先在 1.5 毫升 PBS 中加入 50 微升 ery Krista galley 凝集素包被的 aro 珠子悬浮液，放入离心管中。

然后将试管以 300 倍 G 离心 1 分钟。接下来，弃去上清液并再重复洗涤两次，最后加入 0.5 毫升 PBS。将 3 微克荧光素标记的 PMA LA EMA 在 6 微升 PBS 中的溶液加入到含有凝集素包被珠子的试管中。

使用荧光素标记的 P-M-A-G-A-E-M-A 作为阴性对照。接下来，用箔纸包裹试管并在室温下孵育 1 小时。将试管离心 1 分钟，弃去上清液。

然后重新研磨，将珠子悬浮在 1.5 毫升新鲜 PBS 中，并重复洗涤 3 次。最后，reus 将珠子悬浮在 0.2 ml PBS 中 将 4 μL 悬浮珠子转移到免疫荧光显微镜的孔中。用玻璃盖玻片记录滑动并盖上盖子。

使用装有 10 x 物镜 FITC 滤光片和相机的荧光显微镜拍摄载玻片的图像。通过凝胶渗透色谱分析糖聚合物。不使用筏合成的聚合物比使用筏合成的聚合物具有更高的分散性。

当用荧光素标记时，糖聚合物的物理外观在紫外光下从白色变为强烈的黄色。未标记聚合物的溶液保持深色，而荧光素标记的聚合物发出亮绿色光，确认存在标记物特异性结合与凝集素包被的珠子，仅发生在携带吊坠糖残基的聚合物上 珠子在结合时发出绿色光，而当用缺乏吊坠糖残基的聚合物处理时，它们保持深色。这种基于筏式聚合技术在可合成的糖聚合物类型方面具有极大的灵活性。

聚合物的后续标记也可以使用多种荧光试剂实现，这些试剂能够在水性环境中与主要手段反应。糖生物学领域的研究人员可以使用这种技术轻松获得高度通用和明确的糖聚合物。这些糖聚合物可用作探索碳水化合物结合特异性的工具，例如在囊性纤维化患者的呼吸轨迹中观察到的那些或与许多类型的人类癌症有关的那些。