数字核酸定量检测的简易批量读取方法

本实验的总体目标是利用常规的实时荧光定量 PCR 仪，通过检测反应体系的整体荧光信号，简化数字液滴检测的读数过程。该方法首先对感兴趣的样本和两个标准品进行扩增反应制备，并生成液滴，将每个反应体系分割成数千个纳升级别的独立反应单元。第二步是孵育这些液滴，以扩增其中所含的核酸分子。

接下来，使用标准的QPC或热循环仪测量每个样品或标准品的总体荧光信号。最后一步是利用标准品生成的标准曲线，预测目标样品中荧光液滴的比例。为验证该方法的性能，可采用荧光显微镜独立评估总体荧光检测的定量效果。

与现有的微滴计数等方法相比，该技术的主要优势在于无需使用专用仪器。在开始本检测修复之前，需要准备方案文本中所述的所有必要试剂以及两个标准品：一个为无模板对照（如无核酸酶水），另一个为高模板浓度样本（如λ DNA）。在A-Q-P-C-R管中，将每种标准品各3.3微升与3.3微升变性缓冲液混合并进行变性处理。

在室温下孵育三分钟。每份加入3.3 µL中和缓冲液终止反应。同样，将3.3 µL目标模板与3.3 µL变性缓冲液混合，在室温下孵育三分钟以进行变性。

加入3.3 µL中和缓冲液终止反应。为减少或避免假阳性结果，每份样本准备11 µL主混合液。在生成液滴前，将主混合液暴露于紫外光下。

首先，在冰上使用0.5毫升或1.5毫升透明离心管，为每个样本配制10微升预混液。预混液包含随机引物、B-S-A-D-N-A聚合酶反应缓冲液、dn、NTPs以及无核酸酶水。将离心管置于冰上的水中，在紫外线照射后进行UV处理。

将A-D-S-D-N-A结合染料和参考饮食加入预混混合物中。最后加入PHI 29 DNA聚合酶，以确保该聚合酶不会接触远高于或低于7.5的pH环境。充分混匀，取10微升变性模板或标准品与10微升主混合液混合，充分混匀。

由于液滴对静电和剪切应力非常敏感，实验人员在生成液滴前应脱掉可能产生静电的衣物，并在原地进行接地。本次演示所用的微流控装置为实验室自制，包含一个油相入口和两个水相入口，并设有用于生成液滴的流动聚焦结。使用两台注射泵分别控制含表面活性剂的油相（55 µL）和反应混合物（20 µL）通过微流控芯片的流速。

为了生成20,001纳升的液滴，其中最困难的步骤之一是在不破坏乳液的情况下收集液滴。移液时必须缓慢操作，最好使用宽口吸头。

将每个样本的所有液滴收集到PCR管中。使用宽孔吸头并缓慢移液，将30微升油分装至带有光学平盖的新的PCR管中。将20微升液滴转移至油层上方。

保持一致的体积可确保检测尽可能准确。应紧密关闭管盖，因为松动的管盖会导致油相蒸发。操作乳液管时，应从管的顶部抓握，尽量远离乳液部分。等温扩增可使用PCR扩增仪、A-Q-P-C-R扩增仪或加热板进行。

本实验演示中使用 A-Q-P-C-R 梯度 PCR 仪。将样品在 30 摄氏度下孵育 7 小时，然后在 75 摄氏度下灭活 1 分钟。反应完成后立即进行激活步骤。

使用QPCR热循环仪测量所有样品的二荧光水平。对于每个样品，将双链DNA结合染料的荧光强度除以参考染料的荧光强度。

从所有样本中减去空白荧光或无模板对照的归一化荧光值。使用标准品的校正后荧光测量值绘制线性标准曲线。无模板对照标准代表荧光液滴比例为0%的样本以及高模板浓度的荧光值。

荧光测量值是指使用相应标准曲线时，含有100%荧光液滴的样本所预期得到的荧光值。根据总体荧光强度预测阳性液滴与阴性液滴的中间比例。该方法采用常规实时PCR仪器对基于液滴的数字检测中的总体荧光进行测量。

将荧光和非荧光液滴以不同比例预先混合，并比较整体荧光信号与阳性液滴所占比例。结果显示，整体荧光信号和阳性液滴计数均与输入的荧光液滴比例呈线性关系。基于标准品预测的比例与预期的荧光输入比例进行了比较。

该直线表示在线性关系下的预期值。结果表明，在跨越两个数量级的动态范围内，液滴比例定量表现良好。为在真实的定量全基因组扩增实验中验证该方法，检测了数字液滴的荧光水平及阳性液滴所占比例。

使用不同浓度的模板Lambda DNA进行了MDA检测。曲线表示利用泊松分布对实验数据建模所预期的荧光比例。代表性荧光图像显示，数字MDA样品中液滴的整体荧光信号和阳性液滴比例均随每个液滴的平均模板量呈预期变化，表明整体检测信号能够真实反映数字检测的结果。

该方法可通过加速并行化和简化检测读出，使数字PCR等其他数字检测技术受益。