Name: 数字核酸定量实验分析的简单堆积读数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 了解如何使用标准qPCR仪简化数字液滴检测的读数过程，通过测量整体荧光实现核酸定量。该方法利用荧光显微镜验证结果，无需专用设备即可进行可靠的数字核酸分析。

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作者感谢李毅·徐提供了 MDA 试剂和实验方案。我们还感谢大卫·费尔德曼和纳夫普里特·拉努对本研究相关问题的讨论。本研究部分得到了科学界面伯勒斯威康职业奖对 PCB 的资助。

注意：本实验无需制备微流控装置，因为本方案中的液滴可使用现有的商用液滴生成仪制备23,29。
1. 制备液滴生成微流控装置
<ol>
	<li>按照先前所述的 SU-8 母模制备方案31，但采用液滴发生器掩模图案32，制备通道的主母模。</li>
	<li>采用软光刻技术在 PDMS 中制备器件32,33。</li>
</ol>
2. 准备用于大规模液滴检测的反应混合物
 
注意：该方案可用于通过多种扩增反应来定量核酸。例如，此处提供了对若干浓度的 Lambda DNA 进行 MDA 所需的试剂。试剂详细信息见“特异性试剂表”。模板在液滴中的分布取决于样品是否充分混匀。
<ol>
	<li>获取或纯化Phi29 DNA聚合酶。
	<ol>
		<li>按照先前所述方法纯化Phi297，或从供应商处购买。本实验所用Phi29为纯化产物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制10 ml&#160;变性缓冲液，包含65 mM KOH、1.65 mM EDTA和14 mM DTT。</li>
	<li>配制10 ml&#160;中和缓冲液，包含65 mM HCl、0.21 M Tris-Cl pH 7.0和9 mM Tris-Cl pH 8.0。</li>
	<li>准备两个标准品：一个无模板对照（NTC），如无核酸酶水；另一个为高模板浓度样本（约4 pg/µl&#160;Lambda DNA）。在qPCR管中，将每种标准品各3.3 µl&#160;与3.3 µl&#160;变性缓冲液混合。室温孵育3分钟。每管用3.3 µL中和缓冲液终止反应。</li>
	<li>在qPCR管中，将3.3 µl&#160;目标模板与3.3 µl&#160;变性缓冲液混合。室温孵育3分钟。加入3.3 µl&#160;中和缓冲液终止反应。</li>
	<li>在冰上为每个样本配制11 µl&#160;主混合液。2倍MDA反应主混合液包含2x双链DNA（dsDNA）结合染料、2x qPCR参比染料、50 µM随机引物、2 mg/ml&#160;BSA、2x Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、4.8 mM dNTPs、无核酸酶水和40 µg/ml&#160;Phi29 DNA聚合酶。最后加入Phi29 DNA聚合酶，以确保其不会暴露于远偏离pH 7.5的环境。充分混匀。</li>
	<li>可选：为减少假阳性，在生成液滴前用紫外线照射主混合液34。
	<ol>
		<li>在冰上，于0.5 ml&#160;或1.5 ml&#160;透明离心管中，为每个样本配制10 µl&#160;预混液。预混液包含55 µM随机引物、2.2 mg/ml&#160;BSA、1.1x Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、5.3 mM dNTPs和无核酸酶水。</li>
		<li>将离心管置于冰上水浴中，按文献描述34用UV光（254 nm）照射，累积剂量达5.7 J/cm2。</li>
		<li>在预混液中加入dsDNA结合染料至终浓度1x，参比染料至1x，Phi29至40 µg/ml&#160;。充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将10 µl&#160;变性后的模板或标准品与10 µl&#160;主混合液混合。充分混匀。</li>
</ol>
3. 液滴形成
注意：液滴对静电和剪切应力非常敏感。操作前应脱掉可能产生静电的衣物，并进行接地。取用乳液管时应从管子的顶部握持，尽量远离乳液部分。移液时应极慢操作，最好使用宽口移液吸头。从移液吸头 dispensing 时，应观察乳液在吸头侧面的流动情况，以判断移液速度。
<ol>
	<li>生成液滴。对于所示实验，微流控装置具有一个油相入口和两个水相入口，并通过流动聚焦结点生成液滴。使用两台注射泵分别控制含表面活性剂的油相（55 µl&#160;）和反应混合物（20 µl&#160;）流经微流控芯片，以生成 20,000 个体积为 1 nl 的液滴。</li>
	<li>注意：可使用多种含表面活性剂的油相生成液滴，但其组成会显著影响液滴在高温或长时间条件下的稳定性。一种可行的组合是氟化油 HFE 7500 与阴离子表面活性剂19,35。</li>
	<li>可通过任意方法以任意尺寸生成液滴13,36，但液滴群体的尺寸变异性会影响整体荧光信号，从而影响检测的准确性。对于所示实验，所用液滴为单分散性，体积为 1 nl。</li>
	<li>将所有液滴和油相收集至 PCR 管中。对每个样品，向带有光学盖的洁净 PCR 管中加入 30 µl&#160;油相，随后加入 20 µl&#160;液滴覆盖于油相上方。保持一致的体积可确保检测尽可能准确。</li>
	<li>紧密封闭管盖，松动的管盖会导致油相蒸发。</li>
</ol>
4. 等温扩增
<ol>
	<li>使用PCR扩增仪、定量PCR扩增仪或加热板，将样品在30 °C下孵育7小时，然后在75 °C下灭活1分钟。此时，含有液滴的试管可用铝箔包裹后置于冰箱中数小时。</li>
</ol>
5. 数据采集与分析
<ol>
	<li>反应失活后立即使用qPCR热循环仪测量所有样品的染料荧光水平。最佳滤光片设置取决于染料的激发和发射光谱。本示例中，对dsDNA结合染料使用492 nm-516 nm滤光片组，对参考染料使用585 nm-610 nm滤光片组。也可采用其他荧光检测技术来定量荧光信号。</li>
	<li>对每个样品，将dsDNA结合染料的荧光强度除以参考染料的荧光强度。从所有样品中减去背景荧光，或减去无模板对照（NTC）的归一化荧光值。</li>
	<li>利用标准品校正后的荧光测量值绘制线性标准曲线。其中NTC标准品代表0%荧光液滴（“全阴性”）的荧光水平，高模板浓度的荧光测量值代表100%荧光液滴（“全阳性”）样品的预期荧光水平。根据对应的标准曲线，可推算出中间样品中阳性与阴性液滴的比例。</li>
</ol>
6. 原理验证测量用液滴的制备
<ol>
	<li>制备荧光（阳性）液滴：配制PCR反应体系，包含0.1 ng λ DNA、1×双链DNA结合染料、1×参考染料、1.5单位Taq DNA聚合酶、10 mM Tris-HCl、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP和0.5 µM引物。将反应体系进行30个循环的热循环（95 °C变性20秒，55 °C退火20秒，72 °C延伸1分钟），然后按上述方法生成液滴。</li>
	<li>制备非荧光（阴性）液滴：配制PCR反应体系，包含1×双链DNA结合染料、1×参考染料、1.5单位Taq DNA聚合酶、10 mM Tris-HCl、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP和0.5 µM引物。将反应体系进行30个循环的热循环（95 °C变性20秒，55 °C退火20秒，72 °C延伸1分钟），然后生成液滴。</li>
	<li>制备预混合液滴比例
	<ol>
		<li>将20 µl&#160;氟化油加入qPCR管中，并用光学封膜盖紧以防止蒸发。</li>
		<li>用移液器轻轻将10 µl&#160;充分混合的液滴（按所需阳性:阴性比例）加至油层上方。在展示的结果中，阳性:阴性液滴比例分别为1（全阳性）、0.8、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001、0.0001和0（全阴性）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用qPCR仪检测所有样品的染料荧光水平。本实验方案中，双链DNA结合染料使用492 nm–516 nm滤光片组，参考染料使用585 nm–610 nm滤光片组。
	<ol>
		<li>利用参考染料的荧光信号对双链DNA结合染料的荧光信号进行归一化处理，再以“全阳性”样品的荧光值进行进一步归一化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用“全阳性”和“全阴性”样品的归一化荧光值建立线性标准曲线，并根据对应的标准曲线预测中间比例下阳性与阴性液滴的比例。</li>
	<li>对每个比例重复实验三次（n = 3），每次重复均独立进行液滴生成与混合操作。</li>
</ol>
7. 原理验证性 MDA 实验
<ol>
	<li>使用分光光度计测定Lambda DNA储备溶液的浓度。
	<ol>
		<li>计算每液滴平均含有10个模板分子所需的模板浓度。在本方案中，假设液滴体积为1 nl&#160;，且1 ng Lambda DNA约含有1.9 × 107个拷贝。因此，每液滴10个模板即为每nl 10个拷贝，或每µl含526 fg Lambda DNA。液滴形成时模板将被稀释约6倍，因此初始最高模板浓度为3.2 pg/µl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用变性缓冲液和等体积的中和缓冲液将Lambda DNA连续稀释至3.2 pg/µl&#160;。对于0.1的稀释倍数，将10 µl&#160;样品与45 µl&#160;变性缓冲液混合，并在室温下孵育3分钟。加入45 µl中和缓冲液以终止反应。</li>
	<li>按照步骤7.2所述进一步稀释样品，以制备实验所需的其余样品。所示反应中的初始模板浓度分别为每微升3.2 pg、320 fg、160 fg、32 fg、16 fg、3.2 fg和1.6 fg。 
	注：加入主混合液后的最终模板浓度分别为每微升526 fg、52.6 fg、26.3 fg、5.26 fg、2.63 fg、526 ag和263 ag。每液滴预期的Lambda DNA拷贝数分别为10、1、0.5、0.1、0.05、0.01和0.005。</li>
	<li>按照步骤2.5–5.3所述，对每个样品生成并分析液滴。</li>
	<li>使用安装在倒置荧光显微镜上的数码相机，在室温下以10倍物镜采集所示荧光图像（图2,3）。每个样品采集十二个视野。使用荧光载玻片获取的背景图像对荧光图像进行校正。</li>
	<li>成像时使用密闭腔室37，因为乳化油会迅速蒸发。</li>
	<li>使用ImageJ宏（补充代码文件）分析各个液滴的荧光强度。
	<ol>
		<li>选择一个最佳的荧光强度阈值，以将阴性对照（NTC）图像中的非荧光液滴与高模板浓度图像中的荧光液滴有效区分开。对于每个未知样品，计算荧光强度高于该阈值的液滴所占比例。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. PCR 和 MDA 大规模反应
<ol>
	<li>准备PCR反应。
	<ol>
		<li>用0.1的稀释因子对模板DNA进行连续稀释。每次稀释时，将10 µl&#160;模板与45 µl&#160;变性缓冲液混合，并在室温下孵育3分钟。再将该稀释液与45 µl&#160;中和缓冲液混合。</li>
		<li>每份样品准备20 µl&#160;PCR主混合液。1.1x PCR反应主混合液包含60单位/µl Taq DNA聚合酶、11 mM Tris-HCl、55 mM KCl、1.65 mM MgCl2、0.22 mM dNTP、1.1x双链DNA结合染料、1.1x参比染料以及每种引物550 nM。</li>
		<li>将2 µl&#160;稀释后的模板与20 µl&#160;主混合液混合。 
		注：所示PCR反应中最终模板浓度分别为每微升50 pg、5 pg、500 fg、50 fg、5 fg、500 ag和0 g Lambda DNA，每个样本均设三个重复。</li>
		<li>在qPCR仪中按照以下程序进行热循环：先进行40个循环，每个循环包括95 °C 30秒、57 °C 20秒、72 °C 30秒，然后在72 °C保持2分钟，最后在4 °C保存。</li>
		<li>在进一步分析前，使用参比染料荧光对双链DNA结合染料荧光进行归一化处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备MDA反应。
	<ol>
		<li>按照步骤8.1.1所述方法稀释样品。</li>
		<li>在冰上为每份样品准备11 µl&#160;主混合液。2x MDA反应主混合液包含2x双链DNA结合染料、2x参比染料、50 µM随机寡核苷酸、2 mg/ml&#160;BSA、2x phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、4.8 mM dNTPs、无核酸酶水以及40 µg/ml&#160;Phi29 DNA聚合酶。</li>
		<li>最后加入Phi29 DNA聚合酶至终浓度40 µg/ml&#160;，以确保聚合酶不会暴露于远偏离pH 7.5的环境。充分混匀。</li>
		<li>在qPCR管中，用3.3 µl&#160;变性缓冲液对3.3 µL稀释模板进行变性处理，在室温下孵育3分钟，然后加入3.3 µl&#160;中和缓冲液。</li>
		<li>将10 µL变性后的模板与10 µl&#160;主混合液混合，充分混匀。</li>
		<li>在qPCR仪中运行MDA反应，程序如下。</li>
		<li>在30 °C保持4小时，每7.5分钟测量一次荧光。</li>
		<li>在75 °C灭活1分钟。</li>
		<li>使用参比染料荧光对双链DNA结合染料荧光进行归一化处理，并进一步根据每个样品的最大荧光值进行归一化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li>
<li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A.%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+strategies+in+the+development+and+analysis+of+molecular+biomarkers+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine.</a> Methods. 59 (1), 101-107 (2013).</li>
<li>Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RefSeq+microbial+genomes+database%3A+new+representation+and+annotation+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).</li>
<li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+is+now%3A+single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).</li>
<li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e19(2011).</li>
<li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+genomic+diversity%2C+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissecting genomic diversity, one cell at a time.</a> Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).</li>
<li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Something+from+%28almost%29+nothing%3A+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+the+Year+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11 (1), 1(2014).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+digital+PCR+enables+multigene+analysis+of+individual+environmental+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria.</a> Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).</li>
<li>OpenArray Technology Overview. , Life Technologies. <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html</a> (2014).</li>
<li>Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+on+a+SlipChip.%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital PCR on a SlipChip.</a> Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).</li>
<li>Heyries, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megapixel+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Megapixel digital PCR.</a> Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).</li>
<li>Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+single+DNA+molecules+into+fluorescent+magnetic+particles+for+detection+and+enumeration+of+genetic+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).</li>
<li>Kiss, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+polymerase+chain+reaction+in+picoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets.</a> Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+hits+its+stride%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital PCR hits its stride.</a> Nat. Methods. 9 (6), 3(2012).</li>
<li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+picoliter+rt-PCR+assays+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics.</a> Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+reinjection+and+coalescence+of+droplets+in+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics.</a> Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).</li>
<li>Rhee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+stabilizer+for+reproducible+picoinjection+in+droplet+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems.</a> Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).</li>
<li>Hatch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Million+droplet+array+with+wide-field+fluorescence+imaging+for+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR.</a> Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).</li>
<li>Illumina. , Technology. <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/technology.html">http://www.illumina.com/technology.html</a> (2014).</li>
<li>Droplet digital PCR applications guide. , Bio-Rad. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr">http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr</a> (2014).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics+for+high-throughput+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics for high-throughput biological assays.</a> Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).</li>
<li>Lage, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+analysis+of+genetic+alterations+in+small+DNA+samples+using+hyperbranched+strand+displacement+amplification+and+array-CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH.</a> Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).</li>
<li>Dean, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).</li>
<li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+detection+of+single-nucleotide+and+copy-number+variations+of+a+single+human+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li>
<li>Mitos Dropix Systems. , Dolomite. <a target="_blank" href="http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system">http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system</a> (2014).</li>
<li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe-vacuum+microfluidics%3A+A+portable+technique+to+create+monodisperse+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions.</a> Biomicrofluidics. 5, 14107(2011).</li>
<li>Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chip+for+the+versatile+chemical+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (80), e50618(2013).</li>
<li>Fainman, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFainman%2C+Y+%22Optofluidics+%3A+fundamentals%2C+devices%2C+and+applications%22">Optofluidics : fundamentals, devices, and applications</a>. , McGraw-Hill. (2010).</li>
<li>Xia, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G.M.+Softlithographie%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">G.M. Softlithographie.</a> Angew Chem. 110 (5), 26(1998).</li>
<li>Woyke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+MDA+reagents+for+single+cell+whole+genome+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification.</a> PLoS One. 6 (10), e26161(2011).</li>
<li>System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).</li>
<li>Utada, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961(2013).</li>
<li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876(2008).</li>
<li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li>
<li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503(2004).</li>
<li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li>
<li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li>
</ol>

布罗德研究所可能会就本工作的某些方面申请专利。

数字检测是一种强大的方法，能够检测稀有细胞并计数单个核酸分子。然而，由于商业化的数字检测方法通常需要专用设备，成本较高，因此该技术尚未在分析实验室中常规应用。本文介绍一种基于标准实时定量 PCR 仪的终点数字检测法，用于核酸定量，其读出信号采用简化的模拟信号形式。该方法建立迅速，且读出过程比液滴计数法简便得多。
我们的检测方法为了简化操作流程，放弃了单个液滴的单分子（单液滴）检测灵敏度 大规模 使用标准仪器进行终点测量。在我们的数字MDA实验中，尽管荧光显微镜确认阳性液滴的实际比例符合预期，但仍无法将每200个阴性液滴中少于1个阳性液滴的信号与背景噪声区分开来。图4）。在整体荧光测量中，灵敏度和背景信号限制了对低阳性液滴比例样本的整体测量方法的检测灵敏度。若需要更高的灵敏度，建议采用数字式读数。油相体积或整体液滴体积的差异会显著影响样品的荧光数据。即使使用参考染料进行归一化，也无法完全补偿油相体积差异对荧光读数造成的影响。优化检测体系的反应体积、仪器采集参数、微孔几何结构或光学滤光片，可能有助于提升检测性能。
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用于核酸定量（数字PCR）1-4和碱基序列测定（测序）的数字检测技术正在深刻影响生命科学与医学领域。数字检测可在绝对尺度上对分子数量进行定量（而非相对于对照），具有高灵敏度，便于跨实验的简便比较，并且至关重要的是，能够构建包含可比数据的大型数据库5（表1）。
在过去的15年中，全基因组扩增（WGA）与PCR技术一同发展成为核酸扩增的通用工具。与PCR类似，WGA可通过扩增极微量的样本组分，使其达到易于检测或用于后续分析（如碱基测序）的水平，因此在分析性和制备性应用中均具有重要价值。与PCR不同的是，WGA不针对特定的DNA位点，而是能够扩增样本中的所有序列，包括未知序列。这一PCR与WGA之间的根本差异使两种方法互为补充，同时也导致它们在应用中面临不同的挑战。
全基因组扩增（WGA）反应的高产率使得从单个分子6、单细胞7以及其他低生物量样本8中常规扩增基因组DNA成为可能，可用于定量或进一步分析9。WGA化学方法面临的主要挑战是其对污染物具有极高的敏感性，以及在不同模板分子间的扩增不均一性6。然而，随着单细胞测序成为WGA技术的“关键应用”，WGA正日益受到关注10，并且通过WGA进行模板定量在&#160;众多应用领域中具有重要意义7。
用于数字核酸定量的仪器此前已在多种带阀和无阀的微流控格式中有所描述11-14，包括基于液滴的检测方法15,16（表2）。然而，商业化的微流控数字分析系统需要专用设备来进行反应设置和产物检测17。定制的带阀微流控系统具有灵活性，但需要精密微加工和气动控制系统18。尽管制备用于乳液型数字检测的单分散微滴相对简单19,20，但数字读出在技术上较为繁琐，需要大规模宽场成像（类似于主流的下一代测序技术）21,22或高速基于流动的液滴检测23-25。理想的数字检测应从设置到读出过程均简便易行，减少对复杂仪器的依赖，并实现大量样本的快速读取。本文中，我们描述了一种简化的数字液滴检测读出方法，该方法利用常规的实时PCR仪器来测量基于液滴的数字检测的整体荧光信号。
尽管这种新方法可应用于数字PCR检测，但对于数字全基因组扩增（WGA）检测尤其具有优势，因为在模拟实时扩增检测中，适用于PCR并能获得良好结果的方法在WGA中却存在问题。WGA通常用于序列、长度和碱基组成均具有异质性的模板分子样本。这些不同的模板分子扩增速率各不相同6，因此需要使用具有匹配特性的参考（“标准”）样本。然而，通常并不存在此类标准样本，或输入样本的特性未知。输入材料的异质性以及WGA化学体系对长度依赖的特性26也使得结果解释变得复杂，导致难以明确所测定的对象究竟是输入质量、输入分子数量、两者的组合，还是均不对应。最后，由于扩增不依赖于特定序列，定量多重置换扩增（MDA）比定量PCR更容易受到污染的影响，因为任何序列的污染分子都可能造成干扰。微流控数字检测通过将模板分子分隔开来并减少反应体积，从而降低污染物的采样概率，有效应对污染问题。
此处我们采用一种常用的等温全基因组扩增（WGA）方法，即多重置换扩增（MDA）27。值得注意的是，其他几种WGA化学方法，包括PicoPlex和MALBAC28，也高度依赖初始的等温链置换步骤。等温步骤加剧了将模拟实时检测用于定量WGA时所面临的挑战。在建库过程中，WGA既无法完全被抑制，从而导致不希望出现的、变量性的预扩增，也无法像PCR11那样以离散化（“循环”）的方式进行，使不同分子的复制在进入下一循环前完成并终止（图1）。一种用于WGA的数字检测格式，由于在检测终点前将每个分子分隔开进行计数（因此预扩增不影响结果），能够兼容常规的&#160;反应建库流程&#160;；其原始读出&#160;意味着准确性在很大程度上独立于扩增效率的变异。
该检测依赖于在油相中生成体积均一的液滴，因为检测终点时每个液滴的信号强度取决于液滴体积，而我们不希望结果的一致性依赖于对不同大小液滴分布的平均。制备单分散液滴目前已成为标准操作（自2013年以来已发表约3,500篇相关论文），但需要使用微流控仪器25。事实上，已有六家以上的公司开发出基于此类液滴生成的独立商业化产品，液滴生成用微流控芯片也可商业购得23,29。在本研究中，我们使用了实验室自制的定制微流控装置（见实验方案）。用于驱动流体通过装置的注射泵也可商业化获得，但也可替代使用单个一次性注射器通过真空驱动流体以降低成本30。

<table><tbody><tr><td>Evagreen 染料</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA 聚合酶反应缓冲液</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B0269S</td><td>间歇涡旋振荡直至聚集体溶解</td></tr><tr><td>λ DNA</td><td>New England Biotechnologies</td><td>N3011S</td><td>稀释前加热至 50 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 并在冰上淬灭</td></tr><tr><td>随机 MDA 寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-NNNNN*N-3'</td></tr><tr><td>PCR 引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&amp;rsquo; 和 5&amp;rsquo;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>UltraPure 无核酸酶水</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>使用前在 Stratalinker 2400 中紫外处理 30 分钟（可选）</td></tr><tr><td>ROX 参比染料</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>PCR 光学八联管盖</td><td>Life Technologies</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>dNTP（各 25 微摩尔）</td><td>Agilent Technologies</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪 - Mx3000P qPCR 系统</td><td>Agilent Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯移液器吸头</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad Evagreen 专用油</td><td>Bio-rad</td><td>186-4005</td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr></tbody></table>

数字核酸定量检测的简易批量读取方法

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

数字检测是强大的方法，能够检测稀有细胞并计数单个核酸分子。然而，由于商业可用方法相关的成本和特定设备要求，数字检测尚未实现常规应用。本文介绍一种简化的方法，使用常规的实时PCR仪器读取基于液滴的数字检测的总体荧光信号，从而实现对液滴式数字检测的读出。
我们使用合成液滴混合物和液滴数字多重置换扩增（MDA）检测来表征整体读出检测的性能。定量MDA尤其受益于数字反应格式，但我们的新方法&#160;适用于任何数字检测。对于诸如数字PCR等已建立的数字检测方案，该方法可用于加快并简化检测读出过程。
我们的整体检测方法在无需专用检测仪器的情况下，实现了分区检测的优势。整体检测方法的主要局限性在于其动态范围较微滴计数平台有所降低，且需要一个标准样品，尽管该标准样品的要求比传统实时实验的要求更低。定量全基因组扩增（WGA）可用于检测WGA反应中的污染物，是检测未知序列DNA片段存在的最灵敏方法，因此在制药质量控制和天体生物学等多个应用领域具有广阔前景。

尽管传统的整体/实时检测方法可用于定量PCR和定量全基因组扩增（WGA）分析（图1），但数字定量分析具有优势（表1）。在本文所述方法中，我们采用简单的整体终点检测方式对微滴式数字分析进行读数（图2）。尽管该方法具有广泛适用性，但我们重点关注定量WGA（MDA），因为该方法对传统的实时分析具有特殊挑战。
为了检测我们的实时PCR仪器是否能够检测分散在油相中不同比例的荧光微滴，我们测量了荧光微滴与非荧光微滴人工混合物的整体荧光信号（图2）。整体荧光信号和阳性微滴计数（通过荧光显微镜独立评估）均与输入的荧光微滴比例呈线性关系，符合预期（图3A）。该实验重复进行了三次，每次均独立进行微滴生成和混合。
为了评估“未知”样本的理论定量性能，我们使用完全阳性和完全阴性对照样本建立了线性标准曲线。利用这些特定于液滴批次的标准曲线，我们根据每个样本的整体荧光信号计算了合成阳性和...

我们描述了一种具有简化（模拟）读出方式的终点数字检测方法，用于定量核酸。我们使用标准的qPCR仪对基于液滴的数字检测进行整体荧光测量，并通过显微镜确认结果。

数字检测是一种强大的方法，可实现对稀有细胞的检测以及单个核酸分子的计数。然而，数字检测技术……

本实验的总体目标是利用常规的实时荧光定量 PCR 仪，通过检测反应体系的整体荧光信号，简化数字液滴检测的读数过程。该方法首先对感兴趣的样本和两个标准品进行扩增反应制备，并生成液滴，将每个反应体系分割成数千个纳升级别的独立反应单元。第二步是孵育这些液滴，以扩增其中所含的核酸分子。接下来，使用标准的QPC或热循环仪测量每个样品或标准品的总体荧光信号。最后一步是利用标准品生成的标准曲线，预测目标样品中荧光液滴的比例。为验证该方法的性能，可采用荧光显微镜独立评估总体荧光检测的定量效果。与现有的微滴计数等方法相比，该技术的主要优势在于无需使用专用仪器。在开始本检测修复之前，需要准备方案文本中所述的所有必要试剂以及两个标准品：一个为无模板对照（如无核酸酶水），另一个为高模板浓度样本（如λ DNA）。在A-Q-P-C-R管中，将每种标准品各3.3微升与3.3微升变性缓冲液混合并进行变性处理。在室温下孵育三分钟。每份加入3.3 µL中和缓冲液终止反应。同样，将3.3 µL目标模板与3.3 µL变性缓冲液混合，在室温下孵育三分钟以进行变性。加入3.3 µL中和缓冲液终止反应。为减少或避免假阳性结果，每份样本准备11 µL主混合液。在生成液滴前，将主混合液暴露于紫外光下。首先，在冰上使用0.5毫升或1.5毫升透明离心管，为每个样本配制10微升预混液。预混液包含随机引物、B-S-A-D-N-A聚合酶反应缓冲液、dn、NTPs以及无核酸酶水。将离心管置于冰上的水中，在紫外线照射后进行UV处理。将A-D-S-D-N-A结合染料和参考饮食加入预混混合物中。最后加入PHI 29 DNA聚合酶，以确保该聚合酶不会接触远高于或低于7.5的pH环境。充分混匀，取10微升变性模板或标准品与10微升主混合液混合，充分混匀。由于液滴对静电和剪切应力非常敏感，实验人员在生成液滴前应脱掉可能产生静电的衣物，并在原地进行接地。本次演示所用的微流控装置为实验室自制，包含一个油相入口和两个水相入口，并设有用于生成液滴的流动聚焦结。使用两台注射泵分别控制含表面活性剂的油相（55 µL）和反应混合物（20 µL）通过微流控芯片的流速。为了生成20,001纳升的液滴，其中最困难的步骤之一是在不破坏乳液的情况下收集液滴。移液时必须缓慢操作，最好使用宽口吸头。将每个样本的所有液滴收集到PCR管中。使用宽孔吸头并缓慢移液，将30微升油分装至带有光学平盖的新的PCR管中。将20微升液滴转移至油层上方。保持一致的体积可确保检测尽可能准确。应紧密关闭管盖，因为松动的管盖会导致油相蒸发。操作乳液管时，应从管的顶部抓握，尽量远离乳液部分。等温扩增可使用PCR扩增仪、A-Q-P-C-R扩增仪或加热板进行。本实验演示中使用 A-Q-P-C-R 梯度 PCR 仪。将样品在 30 摄氏度下孵育 7 小时，然后在 75 摄氏度下灭活 1 分钟。反应完成后立即进行激活步骤。使用QPCR热循环仪测量所有样品的二荧光水平。对于每个样品，将双链DNA结合染料的荧光强度除以参考染料的荧光强度。从所有样本中减去空白荧光或无模板对照的归一化荧光值。使用标准品的校正后荧光测量值绘制线性标准曲线。无模板对照标准代表荧光液滴比例为0%的样本以及高模板浓度的荧光值。荧光测量值是指使用相应标准曲线时，含有100%荧光液滴的样本所预期得到的荧光值。根据总体荧光强度预测阳性液滴与阴性液滴的中间比例。该方法采用常规实时PCR仪器对基于液滴的数字检测中的总体荧光进行测量。将荧光和非荧光液滴以不同比例预先混合，并比较整体荧光信号与阳性液滴所占比例。结果显示，整体荧光信号和阳性液滴计数均与输入的荧光液滴比例呈线性关系。基于标准品预测的比例与预期的荧光输入比例进行了比较。该直线表示在线性关系下的预期值。结果表明，在跨越两个数量级的动态范围内，液滴比例定量表现良好。为在真实的定量全基因组扩增实验中验证该方法，检测了数字液滴的荧光水平及阳性液滴所占比例。使用不同浓度的模板Lambda DNA进行了MDA检测。曲线表示利用泊松分布对实验数据建模所预期的荧光比例。代表性荧光图像显示，数字MDA样品中液滴的整体荧光信号和阳性液滴比例均随每个液滴的平均模板量呈预期变化，表明整体检测信号能够真实反映数字检测的结果。该方法可通过加速并行化和简化检测读出，使数字PCR等其他数字检测技术受益。

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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