Name: 对磷酸增强富集制备高度多孔配位聚合物涂层的孔聚合物石柱的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学习制备多孔聚合物毛细管整体柱并逐层生长金属有机框架涂层，用于磷酸肽选择性提取的高效分离介质。该方法结合大孔聚合物与金属有机框架的优势，显著提升磷酸肽富集效率。

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本工作在劳伦斯伯克利国家实验室分子铸造厂完成，并得到美国能源部科学办公室基础能源科学局科学用户设施部门的支持，合同号为 DE-AC02–05CH11231。特此感谢美国教育部富布莱特奖学金对 F.M. 的资助，以及巴基斯坦高等教育委员会对 A.S. 的资助。

注意：实验开始前，请查阅所有相关材料的安全数据表（MSDS）。合成与应用步骤中使用的多种化学品具有毒性。请遵循所有适当的安全操作规程，并使用充足的个人防护装备（实验服、长裤、封闭式鞋头的鞋子、护目镜、手套）。在进行氮气吸附测量操作液氮时，请务必使用所有必要的低温个人防护装备（隔热手套、面罩）。
1. 整体式多孔聚合物柱在块状材料和毛细管柱中的制备
<ol>
	<li>用于表征的整体聚合物整体材料
	<ol>
		<li>通过碱性氧化铝柱纯化苯乙烯、二乙烯基苯和甲基丙烯酸，以去除聚合抑制剂。将10 g碱性氧化铝装入一支25 ml的一次性塑料注射器中，并在注射器尖端填充玻璃棉作为塞子。使约10 ml单体溶液通过该柱体进行过滤。</li>
		<li>将单体（50 mg苯乙烯、100 mg二乙烯基苯和50 mg甲基丙烯酸）以及致孔剂（300 mg甲苯和300 mg异辛烷）加入一个1 ml玻璃小瓶中。加入聚合引发剂，即4 mg的2,2’-偶氮二异丁腈（AIBN，占单体总质量的1%）。</li>
		<li>超声处理10分钟以实现均质化。通入氮气鼓泡10分钟以除去溶解氧。用石蜡膜密封瓶盖，并将小瓶置于60 °C水浴中反应6小时，使混合物完成聚合。</li>
		<li>冷却至室温后小心敲碎玻璃瓶。将聚合物整体材料转移至纤维素提取套管中。将提取套管放入索氏提取装置的提取室中，并连接至含有甲醇的圆底烧瓶，甲醇体积至少为提取室体积的三倍。在提取室上端连接冷凝管。加热回流甲醇16小时，确保完全去除未反应的单体和致孔剂。</li>
		<li>在60 °C真空烘箱中干燥过夜。通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）确认羧基官能团的存在，以便后续连接PCP。采用氮气吸附孔径分析法测定比表面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于制备整体柱的硅胶毛细管功能化
	<ol>
		<li>截取一段2 m长、内径为100 µm、外涂聚酰亚胺的熔融石英毛细管。将其连接至0.25–0.50 ml玻璃注射器，并用丙酮冲洗毛细管。随后用水冲洗以去除残留丙酮。</li>
		<li>为活化毛细管内壁的二氧化硅表面，使用注射泵以0.25 µl/min流速泵入0.2 M的水相NaOH溶液，持续30分钟。再用水冲洗至流出液呈中性。</li>
		<li>使用pH试纸检测流出液pH值。为使硅醇基质子化，以0.25 µl/min流速泵入0.2 M的水相HCl溶液，持续30分钟。用水冲洗至流出液呈中性，再用乙醇冲洗一次。</li>
		<li>以0.25 µl/min流速泵入20%（w/w）的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯乙醇溶液（用乙酸调节pH至5），持续1小时。此步骤使硅胶毛细管内表面引入乙烯基官能团，以便后续将聚合物整体材料键合至毛细管内壁。</li>
		<li>用丙酮冲洗，氮气流干燥，并在室温下静置过夜后备用。将毛细管切割成每段20 cm的短管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>整体式毛细管柱的制备
	<ol>
		<li>在带有橡胶隔垫的1 ml玻璃小瓶中，配制与整体聚合物材料相同组成的聚合混合液（参见第1.1节）。按单体总质量的1%加入AIBN作为引发剂。超声处理10分钟以实现均质化。</li>
		<li>通过连接一段未功能化的石英毛细管至氮气源，对聚合混合液进行氮气除氧。
		<ol>
			<li>将通氮气的毛细管穿过小瓶的橡胶隔垫并浸入聚合混合液中，使氮气在液体中鼓泡。瓶盖应略微松开，以防压力过高。持续通氮10分钟。</li>
			<li>将通氮毛细管从聚合混合液中提起至小瓶顶部气相空间，并拧紧瓶盖。再将一段已功能化的毛细管穿过隔垫插入聚合混合液中。由于氮气进入顶部空间产生压力，推动聚合混合液进入功能化毛细管中。</li>
			<li>从毛细管出口收集数滴液体，确认毛细管已完全填充后，用橡胶隔垫封住出口。极其小心地将毛细管从小瓶中取出，并用橡胶隔垫封闭其入口端。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将装有混合液的毛细管置于60 °C水浴中聚合6小时。冷却至室温后，切去毛细管两端各数毫米。使用HPLC泵以3 µl/min流速用乙腈冲洗色谱柱30分钟，以去除未反应的单体和致孔剂。检测毛细管柱的背压。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 铁-苯三甲酸盐（FeBTC）多孔配位聚合物的生长
<ol>
	<li>用于表征的块体聚合物整体柱上 FeBTC MOPH 的生长
	<ol>
		<li>使用研钵和研杵研磨先前干燥的整体柱。</li>
		<li>将 100 mg 整体柱粉末浸入 5 ml 含 2 mM FeCl3·6H2O 的乙醇溶液中，持续 15 分钟。使用尼龙滤膜（0.22 µm）进行真空抽滤，并用乙醇洗涤粉末。将整体柱粉末浸入 5 ml 含 2 mM 1,3,5-苯三甲酸（BTC）的乙醇溶液中，持续 15 分钟。使用尼龙滤膜（0.22 µm）进行真空抽滤，并用乙醇洗涤粉末。</li>
		<li>根据需要重复第 2 步。最终金属有机涂层的生长程度由所进行的循环次数决定。通常进行 10 至 30 个循环。通过氮气吸附孔径分析法确认新孔隙的存在。通过热重分析（TGA）测定新增金属位点的数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>毛细管整体柱上 FeBTC MOPH 的生长用于磷酸化肽的富集
	<ol>
		<li>使用注射泵。以 2 µl/min 的流速用含 2 mM FeCl3·6H2O 的乙醇溶液冲洗毛细管整体柱 15 分钟。以 2 µl/min 的流速用乙醇洗涤 15 分钟。以 2 µl/min 的流速用含 2 mM BTC 的乙醇溶液冲洗毛细管整体柱 15 分钟。以 2 µl/min 的流速用乙醇洗涤 15 分钟。</li>
		<li>根据需要重复第 1 步。最终金属有机涂层的生长程度由所进行的循环次数决定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 蛋白质消化与磷酸化肽段的富集
<ol>
	<li>蛋白质消化
	<ol>
		<li>将0.5 ml脱脂牛奶溶于1 ml水中，并分装为每份200 µl。</li>
		<li>进行蛋白质消化时，向每份样品中加入160 µl 1 M碳酸氢铵和50 µl 45 mM二硫苏糖醇，以断裂二硫键。在50 °C下于恒温混匀仪中孵育15分钟。</li>
		<li>待溶液冷却至室温后，缓慢加入50 µl 100 mM碘乙酰胺水溶液。碘乙酰胺可防止新的二硫键形成。</li>
		<li>避光孵育15分钟，室温条件下进行。加入1 ml去离子水。加入2 µg胰蛋白酶，在37 °C下于恒温混匀仪中消化蛋白质14小时。</li>
		<li>加入10 µl 1%三氟乙酸酸化以终止消化反应，并在室温下于恒温混匀仪中继续孵育5分钟。将消化后的蛋白质产物储存于–20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用毛细管MOPH柱富集磷酸化肽段
	<ol>
		<li>以流速1 µl/min，用100 µl含0.1%三氟乙酸的乙腈-水4:1混合液冲洗柱子10分钟。随后以2 µl/min的流速将蛋白质消化液泵入柱中，持续30分钟。</li>
		<li>再次以流速1 µl/min，用含0.1%三氟乙酸的乙腈-水4:1混合液冲洗10分钟，以去除未磷酸化的肽段。再以1 µl/min流速用水冲洗10分钟。</li>
		<li>使用250 mM、pH 7的磷酸盐缓冲液以1 µl/min流速泵入15分钟，洗脱磷酸化肽段。收集洗脱液至样品瓶中，并依据标准方案19进行脱盐处理。配制2 mg/ml的2,5-二羟基苯甲酸溶液，作为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）的基质。吸取2 µl 2,5-二羟基苯甲酸至移液枪尖端，用于洗脱磷酸化肽段，并直接点样至MALDI靶板上。</li>
		<li>通过MALDI-TOF-MS分析样品点，随后用大量水冲洗柱子，再用甲醇冲洗，以再生柱子。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

原始的聚合物整体材料含有能够与金属结合的羧基官能团。通过在原始材料上配位初始金属位点，我们能够生长一层PCP涂层（图1A），引入大量额外的金属位点，形成微孔网络结构。这使得所报道的MOPH材料在涉及金属物种的富集或纯化过程中具有吸引力，例如固定化金属离子亲和色谱（IMAC）技术。使用毛细管柱富集磷酸化肽的一般操作流程如图1B所示。
块体粉末整体材料的制备使得能够对原始整体材料及其改性后的对应物进行表征。我们在77 K下测定了N2吸附等温线（图2A），结果显示，经过30次PCP循环后，低P/Po下的N2吸附量显著增加，表明材料中形成了新的微孔。原始整体材料的比表面积增加了近四倍，从106 m2/g增至389 m2/g。仅进行少量循环（10次PCP循环），材料的孔隙率即提升至比表面积156 m2/g。采用该详细方法制备多孔材料不仅限于基于Fe的PCP。将F...

多孔配位聚合物（PCPs）是一类基于金属中心与有机配体通过重复的配位单元连接而成的配位化合物，其结构可在一维、二维或三维方向上延伸，且可以是无定形或结晶态1-3。近年来，这类多孔材料因其高孔隙率、广泛的化学可调性以及良好的稳定性而受到广泛关注。PCPs已被探索用于气体储存、气体分离和催化等多种应用3-6，而最近，PCPs的首批分析应用也已被报道7。
由于具有增强的化学功能性和高孔隙率，多孔配位聚合物（PCPs）在提升纯化工艺和色谱分离方面的巨大潜力已受到广泛关注，关于这一主题的多项研究已有报道7-13。然而，目前PCPs的性能尚无法与现有的色谱材料相媲美，这可能是由于这些固体材料的颗粒或晶体通常具有不规则的形貌，导致在填充柱中颗粒间存在较大的空隙，从而引起快速扩散。这种不均匀的填充状态会导致分离性能低于预期，并产生较高的柱背压以及不理想的峰形特征14,15。
为了解决分析应用中多孔配位聚合物（PCPs）因颗粒间孔隙导致的快速扩散问题，同时提升其性能，开发一种基于大孔聚合物整体柱16的杂化材料将具有重要意义，该材料可使PCP分布在大孔表面。聚合物整体柱是一种自支撑的单块材料，其孔道允许对流流动，因而成为颗粒填充材料最高效的替代方案之一，并已被多家公司成功实现商业化17,18。&#160;多孔聚合物整体柱通常通过单体与交联剂在致孔剂存在下聚合制备，致孔剂一般为有机溶剂的二元混合物。所得整体材料具有微球状结构，兼具高孔隙率和高流动渗透性。
一种将这些材料统一并制备含有多孔配位聚合物（PCP）的整体柱的简单方法，是将合成后的PCP直接加入整体柱的聚合混合物中。然而，该方法导致PCP大多被包埋在聚合物支架内部，无法在最终材料的后续应用中发挥活性14,15。显然需要采用不同的合成策略，例如，以制备均匀的PCP薄膜或结晶型金属有机框架（MOFs），使得晶体内部大多数孔道能够与整体柱的宏观孔隙相通。
本文报道了一种基于大孔聚合物载体的金属-有机聚合物杂化材料（MOPH）的简单制备方案，该载体具有适合固定多孔配位聚合物（PCPs）的官能团，可方便地以整体式单片聚合物柱的形式用于流通型应用，并具备理想的性能。在完成聚合物合成后，采用一种简单的室温溶液法&#160;在整体柱孔道内表面生长PCP涂层19-20。作为首个示例，我们描述了在大孔聚（苯乙烯-二乙烯基苯-甲基丙烯酸）整体柱内制备铁(III)苯三甲酸盐（FeBTC）配位聚合物薄膜的方法。该方法不仅适用于体相粉末材料的制备，也可用于毛细管柱的构建，且所述方案可便捷地推广至其他PCPs的制备。为展示MOPH作为流通型功能材料的应用潜力，我们将所制备的含有高密度Fe(III)中心的FeBTC MOPH用于从酶解蛋白质混合物中富集磷酸化肽段，利用磷酸化肽段与Fe(III)之间的特异性结合亲和力实现分离富集。本研究建立的方案21主要包括三个部分：大孔有机聚合物整体柱载体的制备；在整体柱孔道表面生长PCP涂层；应用于磷酸化肽段的富集。

<table><tbody><tr><td>聚酰亚胺涂层毛细管</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>100 &amp;mu;m 内径</td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯，98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td></td></tr><tr><td>苯乙烯，99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W323306</td><td>工业级</td></tr><tr><td>二乙烯基苯，80%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>414565</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酸，98%</td><td>Mallinckrodt</td><td>MK150659</td><td></td></tr><tr><td>甲苯，&amp;ge;99.5%</td><td>EMD chemicals</td><td>MTX0735-6</td><td></td></tr><tr><td>异辛烷，&amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650439</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-偶氮二异丁腈，98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441090</td><td></td></tr><tr><td>氧化铝（碱性氧化铝）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>三氯化铁六水合物，97%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5-苯三甲酸，95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>482749</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，&amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360457</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵，&amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸，&amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，&amp;ge;99.8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺，&amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇，&amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠二水合物，&amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠二水合物，&amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>磷酸，&amp;ge;85%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>438081</td><td></td></tr><tr><td>2,5-二羟基苯甲酸，&amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85707</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>牛胰腺来源</td></tr><tr><td>&amp;beta;-酪蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td>牛乳来源</td></tr><tr><td>ZipTip 吸头</td><td>Merck Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>C18 树脂</td></tr></tbody></table>

在大孔聚合物整体柱上制备高孔隙配位聚合物涂层以增强磷酸化肽的富集

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

我们描述了一种在大孔聚合物整体材料内表面制备基于高度多孔配位聚合物涂层的杂化材料的方案。该方法基于制备含有羧酸官能团的大孔聚合物，并在此基础上通过溶液法逐步可控地在聚合物整体材料的孔表面生长一层多孔配位聚合物。所制备的金属-有机聚合物杂化材料具有较高的微孔比表面积。通过在功能聚合物载体的孔表面进行金属-有机配位，可增强三价铁位点的数量。金属位点的增加与涂层过程的循环次数相关。
所开发的制备方案可轻松适配于毛细管柱形式。功能化多孔聚合物在毛细管内被制备为一个独立的单块式多孔整体柱，从而形成一种具有优异流动通透性和适中反压的流通式分离装置。该金属-有机聚合物杂化柱在从消化后的蛋白质中富集磷酸化肽段，并继而通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱进行检测方面表现出优异性能。本研究所提供的实验方案具有高度的通用性，可轻松应用于多种有机聚合物载体和涂层，并可与大量多孔配位聚合物及金属-有机框架材料结合，用于多种纯化和/或分离应用。

有机聚合物整体柱孔表面PCP生长的示意图如下所示 图1在此图中，我们展示了初始的 Fe(III) 原子通过与原始聚合物整体柱孔表面的羧基官能团配位而固定在孔道表面。根据本文所述方案，向表面进一步引入有机配体和 Fe(III) 离子，从而在聚合物整体柱内部构建出多孔配位网络。 图1 还示意性地展示了所制备的毛细管MOPH柱作为流通式载体用于富集磷酸化肽段的应用。对所制备材料采集了比表面积和孔径分布数据、扫描电子显微镜图像（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）以及热重分析（TGA）结果。图2）。这些表征实验为FeBTC PCP生长后新孔隙的形成情况提供了有价值的信息图2A）。经FeBTC PCP改性后材料的形貌如图所示 图2B根据晶体学模拟，每个MOF层的厚度估计为3和5 Å，具体取决于晶体的生长取向。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）证实了所合成的聚合物整体柱及其经不同循环次数FeBTC修饰后的对应材料中存在官能团。图2C）。热重分析...

介绍了一种制备多孔杂化分离介质的方法，该介质由大孔聚合物整体柱构成，其内部涂覆有高比表面积的微孔配位聚合物。

我们描述了一种基于高度多孔配位聚合物涂层在大孔材料内表面制备杂化材料的实验方案……

以下实验的总体目标是制备一种新型载体材料，以提高其在选择性提取磷酸化肽方面的性能。该目标通过合理制备具有合适功能基团的多孔聚合物毛细管整体柱来实现。首先，将金属物种固定在聚合物整体柱的功能基团上，从而使该载体对磷酸化肽的提取具有选择性。随后通过逐步生长多层金属有机框架，以增加金属位点的数量，从而提高对磷酸化肽段的选择性。实验结果表明，基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析，该方法在从蛋白质酶解产物中提取磷酸化肽段时具有更高的选择性。O-肽段的富集通常采用金属离子亲和色谱法，该方法可在传统的硅胶颗粒或聚合物颗粒上进行，这些颗粒被填充于色谱柱中。我们的材料结合了大孔聚合物整体柱的优势，该材料具有良好的传质性能，同时兼具金属有机框架的高结合容量。我们通过在整体柱表面依次生长金属有机框架来实现这一目标，最终形成多层可与分析物相互作用的金属位点。聚合物整体柱的制备以及金属有机框架的生长过程均需要直观演示，因为这些操作极难通过文字描述掌握。为获得具有优良表面特性和孔隙率的整体柱，多个关键步骤必须严格把控。首先，截取两米长的聚酰胺涂层熔融石英毛细管（内径为100微米），该毛细管连接至一个25毫升玻璃注射器，用丙酮清洗毛细管。然后用去离子水冲洗毛细管以去除丙酮。接下来，将装有0.2摩尔水溶液氢氧化钠的250微升玻璃注射器置于注射泵上，以每分钟0.25微升的流速将溶液通过毛细管冲洗30分钟，以活化毛细管内部的二氧化硅涂层。30分钟后，用水冲洗毛细管，直至流出液呈中性。使用pH试纸检测，确认流出液的pH为中性。接着，将0.2摩尔的盐酸水溶液装入注射器，在25微升/分钟的流速下将溶液泵入毛细管，持续流动30分钟，以质子化硅醇基团。之后，再次用水冲洗毛细管，直至流出液呈中性。当 pH 值达到中性后，使用装有 100% 乙醇的 250 微升注射器冲洗毛细管。然后在每分钟 25 微升的流速下，泵入乙醇中含 20% 三甲基丙基甲基丙烯酸酯的溶液，持续一小时，以在表面引入乙烯基官能团。接着，用丙酮冲洗毛细管，再用氮气流吹干。将样品在室温下静置过夜，然后将其切成20厘米长的片段。按照随附的文字实验方案，在带有橡胶隔垫的1毫升玻璃小瓶中配制聚合反应混合物。加入占单体质量1%的A IBN作为引发剂，并对混合物进行超声处理10分钟。接下来，将一根未经功能化的石英毛细管连接到氮气流上，并通过橡胶隔垫插入聚合反应混合物中。稍微松开小瓶盖，缓慢向混合物中通入氮气10分钟。10分钟后，将氮气流毛细管从聚合反应混合物中提起至小瓶的顶空部位，并拧紧瓶盖。将一根经过功能化的毛细管穿过隔垫插入聚合反应混合物中。利用氮气产生的过量压力，将聚合反应混合物压入功能化毛细管内。让数滴聚合反应混合物流出毛细管出口，以确保毛细管完全充满，然后用橡胶隔垫将其封闭。非常小心地将毛细管从样品瓶中取出，并用橡胶隔垫封闭入口，将毛细管中的混合物置于60摄氏度的水浴中加热六小时以进行聚合。完成后，将毛细管冷却至室温，然后切去毛细管两端各几毫米。接下来，使用高效液相色谱泵以每分钟4 µL的速度用乙腈冲洗色谱柱30分钟。这将去除任何未反应的单体和成膜效果差的试剂。检查毛细管柱的背压。接下来，用此处所示的试剂以循环方式冲洗毛细管整体柱，以生长最终的金属有机涂层。涂层厚度由所进行的循环次数决定。使用100微升体积比为4:1的丙酮三醇与0.1%水溶液三氟乙酸混合液冲洗毛细管。然后以每分钟2微升的流速将蛋白质消化液泵入色谱柱中。用乙腈与0.1%水相三氟乙酸按4:1比例配制的溶液，以每分钟1微升的流速冲洗非磷酸化肽段30分钟，重复洗涤一次，每次10分钟。再以每分钟1微升的流速用水洗涤10分钟。使用pH为7的250微摩尔磷酸盐缓冲液，以每分钟1微升的流速泵过毛细管15分钟，洗脱磷酸化肽段，将洗脱液收集至样品瓶中，并采用标准方案对溶液进行脱盐处理。接下来，配制浓度为 2 毫克/毫升的 2,5-二羟基苯甲酸甲醇溶液，取 2 微升该溶液与 2 微升前述磷酸化肽溶液混合。用移液枪头将此混合液直接点样至基质辅助激光解吸电离靶板上，并让样点完全干燥。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析样点，最后用大量水冲洗色谱柱进行再生，随后用甲醇冲洗，毛细管经多层可用铁修饰。在固定化金属离子亲和层析中，理想的三组分如图所示，分别为富集前后消化蛋白质所得的质谱图，显示出对12种不同磷酸化肽段的高度选择性。代表性表征实验为新孔隙的形成提供了重要信息。下图是经过30次多孔配位聚合物（PCP）循环后块体粉末整体材料的扫描电子显微镜图像。经过30次PCP循环后，与本体聚合物相比，材料中孔径的尺寸被发现小于3纳米。该杂化材料具有大量带有微小孔隙的增量面积。这导致在一系列压力下通过傅里叶变换红外光谱检测到氮气吸收增加。最初引入的羧基官能团清晰可见，且在经过10、20和30次PCP循环后涂层的生长情况也可观察到。最后，采用热重分析法测定每轮循环中累积的额外金属位点数量。图中显示了在一系列温度下的热重分析结果，证实了随着循环次数的增加，金属位点的数量也随之增加。按照本方案，可针对有机配体中不同的金属中心开发类似的程序，以实现基于不同分析物对特定框架亲和性的高效分离。我认为，像我们所开发的这类将大孔聚合物与金属有机框架相结合的复合材料，在分离科学领域具有广阔的应用前景，因为它们能够显著提高选择性、结合容量以及分析级和制备级分离的整体效率。

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