Name: 隔离和中性粒细胞的表征与抗肿瘤性质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学习利用密度梯度离心法分离中性粒细胞，并通过荧光素酶标记的肿瘤细胞共培养实验评估其抗肿瘤细胞毒性。该方法可避免非特异性激活，为癌症免疫学研究提供可靠的技术手段。

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ZG 获得了以色列科学基金会 I-CORE 项目（资助号：41/11）、Abisch-Frenkel 基金会、Rosetrees 信托基金、以色列癌症研究基金会（ICRF - 研究职业发展奖）以及 CONCERN 基金会的资助。ZGF 获得了以色列癌症研究基金会（ICRF - 研究职业发展奖）、以色列卫生部首席科学家办公室以及以色列肺脏协会的资助。

<ol><li>Tangye, S. G., Brink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helping+hand+from+neutrophils+in+T+cell-independent+antibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses.</a> Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).</li>
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<li>Tecchio, C., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cytokines+involved+in+physiological+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Immunol+Allergy%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis.</a> Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).</li>
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<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).</li>
<li>Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+suppression+by+neutrophils+and+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).</li>
<li>Lopez-Lago, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemokines+secreted+by+tumor+cells+mount+a+lung+antimetastatic+response+during+renal+cell+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression.</a> Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).</li>
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<li>Sagiv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Diversity+and+Plasticity+in+Circulating+Neutrophil+Subpopulations+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer.</a> Cell Reports. , (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

中性粒细胞是所有白细胞中数量最多的一类，在感染和炎症发生时是首批响应的细胞。因此，它们对外界刺激极为敏感，易于被激活。此外，中性粒细胞的半衰期极短，更新速度很快。这些特性共同导致中性粒细胞的操作存在诸多困难，需要采用独特的实验策略。例如，目前已有多种中性粒细胞纯化方法，每种方法各有优缺点。
中性粒细胞研究中的一个关键步骤是从全血中纯化中性粒细胞。可采用密度梯度法或基于抗体的策略（阳性或阴性筛选）高效地纯化中性粒细胞。我们首选的方法是使用密度梯度法，因为该方法可以获得大量高纯度的中性粒细胞，且非特异性激活程度最低。然而，正如我们最近一项研究21所示，随着肿瘤进展，大量中性粒细胞会积聚在单个核低密度组分中。在此情况下，密度梯度法仅能获得高纯度的高密度中性粒细胞组分，但不能代表全部循环中性粒细胞群体，同时低密度中性粒细胞组分则被其他单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）严重污染。在这种情况下，首选方法应为基于抗体的纯化，尤其是阴性筛选。使用抗体纯化中性粒细胞可获得高纯度细胞，并能更好地代表全部循环中性粒细胞群体。然而，我们注意到，中性粒细胞与抗体孵育的时间越长，发生非特异...

中性粒细胞最初被定义为先天免疫细胞，是抵御入侵微生物的第一道防线。如今已知，中性粒细胞具有更广泛的功能，可参与针对外来抗原的适应性免疫应答1,2，调控造血3、血管生成4以及伤口愈合5。此外，中性粒细胞可通过其促肿瘤和抗肿瘤活性影响肿瘤生长及转移进展6,7。中性粒细胞的特征是具有多叶分叶核（因此被称为多形核（PMN）白细胞），并含有至少三种不同类型的颗粒以及分泌小泡8（图1A-C）。
中性粒细胞具有强大的吞噬能力以及高水平的NADPH氧化酶活性，这对于清除微生物至关重要，同时还能分泌多种趋化因子，有助于募集更多中性粒细胞及其他免疫细胞至炎症部位8,9。中性粒细胞的特征是表达大量表面受体，包括Toll样受体（TLRs）、C型凝集素受体（CLRs）、补体受体3（CD11b/CD18）以及其他黏附分子（例如，L-选择素、LFA-1、VLA-4和癌胚抗原相关细胞黏附分子3（CEACAM3/CD66b））、趋化因子受体（例如，CXCR1、CXCR2、CCR1、CCR2）、趋化物受体（例如，PAFR、LTB4R和C5aR）、细胞因子受体（例如，G-CSFR、IL-1R、IL-4R、IL-12R、IL-18R、TNFR）、甲酰肽受体（例如，FPR1-3）以及Fc受体（例如，CD16（FcγRIII）、CD32（FcγRII）和CD64（FcγRI））10。在小鼠中，中性粒细胞通常被鉴定为CD11b+Ly6G+表型，而人类中性粒细胞则通过CD11b、CD15、CD16和CD66b等白细胞标志物进行鉴定。此外，通常也可通过染色颗粒蛋白髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）来检测组织中的中性粒细胞。
中性粒细胞的多种功能是由同一类细胞介导，还是由不同的细胞亚群介导，目前尚不明确。越来越多的研究数据表明，中性粒细胞群体具有异质性，其表现出高度的可塑性，受促炎刺激因素和微环境的影响11,12。Fridlender et al.13 将肿瘤中的中性粒细胞大致分为两个主要亚群：具有抗肿瘤特性的 N1 型和具有促肿瘤特性的 N2 型。在癌症以及慢性炎症中，还存在另一类亚群，即粒细胞系髓源性抑制细胞（G-MDSCs），这类细胞能够抑制 T 细胞反应14。G-MDSCs 被认为是未成熟的髓系细胞，在小鼠中表现为 CD11b+Ly6ClowLy6Ghi 表型15，而在人类中则具有 CD15+/CD16low 表型16。与正常循环中的中性粒细胞相比，G-MDSCs 表达更高水平的精氨酸酶和髓过氧化物酶，但表达较低水平的细胞因子和趋化因子。它们的吞噬和迁移能力较弱，但活性氧（ROS）的产生水平更高15,17,18。本文将介绍一些用于分离和鉴定具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的基本方法。
中性粒细胞占人体循环中所有白细胞的大部分（45 - 70%；1,800 - 6,000/μl），而在小鼠中，正常情况下其数量相对稀少（10 - 15%；300 - 500/μl）。在炎症发生时，中性粒细胞数量持续增加，有时在癌症中也会升高，而癌症是一种慢性炎症状态7。中性粒细胞由骨髓中的多能共同髓系前体（CMP）细胞发育而来，经过髓母细胞（MB）、早幼粒细胞（PM）、中幼粒细胞（MC）、晚幼粒细胞（MM）和杆状核细胞（BC）等阶段的分化过程8。成熟的终末分化中性粒细胞可在骨髓中停留4 - 7天，然后释放入血液循环8。中性粒细胞在血液中的更新通常很快，平均半衰期为6 - 12小时，在炎症条件下该时间可能延长。未受刺激的中性粒细胞抗肿瘤活性有限，但可通过将幼稚中性粒细胞暴露于趋化因子IL-8（CXCL2）、CCL2、CCL5和CXCL56,19而获得此功能，或通过人工方式暴露于佛波酯12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）来诱导6。
血液中性粒细胞的半衰期较短，且中性粒细胞数量较少（约 3 - 5 x 105) 来自未处理的6-8周龄小鼠1 ml血液，使得探索循环小鼠中性粒细胞的功能变得困难 体外为克服这一困难，研究人员已采用其他来源。例如，可从骨髓中获取大量中性粒细胞20 或在诱导无菌性炎症后腹膜的例如，经腹腔注射巯基乙酸盐肉汤或Zymosan A后）。需要注意的是，从腹腔获得的中性粒细胞不具有任何抗肿瘤活性（未发表观察结果）。
Granot 等6 观察到，将小鼠 4T1 乳腺癌细胞系原位接种于 BALB/c 小鼠后，小鼠会出现中性粒细胞增多症，且随着肿瘤进展而加重6（图 2A），因此在接种肿瘤后 3 至 4 周，可从 1 ml 血液中轻松分离出 2000 至 4000 万个血液中性粒细胞。这些中性粒细胞获得了抗肿瘤活性，因此被命名为肿瘤驯化中性粒细胞（TEN），以区别于幼稚中性粒细胞6（图 2B）。高密度中性粒细胞（HDN，图 1A）具有强效抗肿瘤作用，而在癌症背景下产生的低密度中性粒细胞（LDN，图 1B）则不具备此功能21。此外，荷瘤小鼠骨髓和脾脏中的高密度中性粒细胞也具有抗肿瘤活性（未发表数据）。需要注意的是，随着肿瘤进展，脾脏逐渐增大（脾肿大），其中中性粒细胞的数量也不断增加。
需要注意的是，在其他癌症模型中也会产生肿瘤诱导的中性粒细胞（TEN），包括自发性肿瘤模型（如 MMTV-PyMT 和 MMTV-Wnt1 乳腺肿瘤、k-Ras 驱动的肺癌）和接种性肿瘤模型（如 AT-3（MMTV-PyMT）和 E0771 乳腺癌细胞、LLC Lewis 肺癌细胞以及 B16-F10 黑色素瘤细胞）。然而，这些肿瘤模型中中性粒细胞的动员程度远低于接种 4T1 细胞的小鼠，接种后 3 周每毫升血液中仅达到 5–10 × 106 个中性粒细胞。

<table><tbody><tr><td>细胞系</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠 4T1 乳腺癌细胞</td><td>ADCC</td><td>CRL-2539</td><td>培养基：DMEM + 10% 热灭活 FBS</td></tr><tr><td>塑料器皿与设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 孔组织培养板&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>无菌</td></tr><tr><td>100 mm 组织培养板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>无菌</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养瓶</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td>无菌</td></tr><tr><td>90 mm 细菌级培养皿&amp;nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>20090-01-017</td><td>无菌</td></tr><tr><td>15 ml 无菌锥形离心管&amp;nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>835015-40-111</td><td>无菌</td></tr><tr><td>50 ml 无菌锥形离心管&amp;nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>835050-21-111</td><td>无菌</td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm 圆底聚苯乙烯管&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>无菌</td></tr><tr><td>Millicell 24 孔迁移板，孔径 5&amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>PSMT010R1</td><td>无菌</td></tr><tr><td>白色 96 孔平底板&amp;nbsp;</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>无菌</td></tr><tr><td>细胞滤器（40 mm）&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>无菌</td></tr><tr><td>20G x 1.5&quot; 针头</td><td>BD Microlance 3&amp;nbsp;</td><td>301300</td><td>无菌</td></tr><tr><td>23G x 1&quot; 针头&amp;nbsp;</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td>无菌</td></tr><tr><td>25G x 5/8&quot; 针头&amp;nbsp;</td><td>BD Microlance 5</td><td>300600</td><td>无菌</td></tr><tr><td>0.3 ml 带 30G x 8mm 针头的注射器</td><td>BD Micro-Fine Plus Demi</td><td>320829</td><td>无菌</td></tr><tr><td>9 mm 夹子&amp;nbsp;</td><td>BD, AutoClip&amp;nbsp;</td><td>427631</td><td>无菌</td></tr><tr><td>EasySep 磁力架&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS 分离柱&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>无菌</td></tr><tr><td>MidiMACS 分离器磁铁</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS 多功能支架</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片&amp;nbsp;</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser Superfrost&amp;nbsp; Plus Thermo</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床&amp;nbsp;</td><td>Sky line, ELMI</td><td>S-3.02.10L</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪&amp;nbsp;</td><td>TECAN</td><td>InfiniteF200Pro</td><td></td></tr><tr><td>粉末</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），V 级</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>溴脱氧尿苷（BrdU）&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td>无菌</td></tr><tr><td>CFSE（5-(和 6-)-羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯）</td><td>Molecular Probes</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖 T500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>来自猪肠黏膜的肝素钠盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠（NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>高毒性，操作需谨慎</td></tr><tr><td>硫代甘油酸盐粉末&amp;nbsp;</td><td>Difco</td><td>225650</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>培养基与补充剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>无菌</td></tr><tr><td>Opti-MEM&amp;reg; I 减血清培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td>无菌</td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）-1640 培养基</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>无菌</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），热灭活</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>无菌</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-020-1A</td><td>无菌</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-042-1B</td><td>无菌</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 x 1000 溶液</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-031-5</td><td>无菌</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），不含 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-023-1</td><td>无菌</td></tr><tr><td>PBS x 10，不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-023-5A</td><td>无菌</td></tr><tr><td>高效液相色谱级水&amp;nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4218-03</td><td>高压灭菌</td></tr><tr><td>溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK &amp;ndash; 氯化铵-氯化钾</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>溴脱氧尿苷（BrdU）溶液（10 mg/ml）溶于 PBS</td><td></td><td></td><td>将 10 mg BrdU 溶于 1 ml PBS 中，过滤除菌。</td></tr><tr><td>CFSE，5 mM 溶于 DMSO</td><td></td><td></td><td>将 2.8 mg CFSE 溶于 1 ml DMSO 中。分装为每管 10 ml 的等分试样于无菌 200 ml 管中，避光保存于 -20&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C。</td></tr><tr><td>伊红 Y 溶液</td><td>Sigma</td><td>HT110-2-32</td><td></td></tr><tr><td>Hanks 平衡盐溶液</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-016-1A</td><td>无菌</td></tr><tr><td>肝素，20 mg/ml 溶于 PBS</td><td></td><td></td><td>将 100 mg 肝素溶于 5 ml 无菌 PBS 中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque-1119&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。</td></tr><tr><td>Histopaque-1077&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。</td></tr><tr><td>荧光素酶细胞裂解缓冲液 x5</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>使用前用无菌水稀释至 1:5。</td></tr><tr><td>荧光素酶检测试剂</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>包含荧光素酶检测试剂粉末（E151A）和荧光素酶检测缓冲液（E152A）</td></tr><tr><td>Mayer 苏木精溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>MHS-32</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 0.5% BSA</td><td></td><td></td><td>将 2.5 g BSA 溶于 500 ml PBS 中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。</td></tr><tr><td>PBS + 1% BSA</td><td></td><td></td><td>将 1 g BSA 溶于 100 ml PBS 中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。</td></tr><tr><td>5x PBS 含 2.5% BSA</td><td></td><td></td><td>将 12.5 g BSA 溶于 250 ml 无菌 HPLC 级水和 250 ml PBSx10 的混合液中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。</td></tr><tr><td>含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS</td><td></td><td></td><td>将 250 mg BSA 溶于 50 ml 无菌 PBS 中，加入 200 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0），通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。</td></tr><tr><td>FACS 缓冲液（含 0.5% BSA、2 mM EDTA 和 0.02% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 的 PBS）</td><td></td><td></td><td>将 250 mg BSA 溶于 50 ml 无菌 PBS&amp;nbsp; 中，加入 200 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）和 500 ml 2% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。</td></tr><tr><td>生理盐水（0.9% NaCl）</td><td></td><td></td><td>将 9 g NaCl 溶于 1,000 ml ddw 中，高压灭菌</td></tr><tr><td>0.2% NaCl 溶液</td><td></td><td></td><td>将 2 g NaCl 溶于 1,000 ml ddw 中，高压灭菌</td></tr><tr><td>1.6% NaCl 溶液</td><td></td><td></td><td>将 16 g NaCl 溶于 1,000 ml ddw 中，高压灭菌</td></tr><tr><td>2% 叠氮化钠</td><td></td><td></td><td>将 1 g 叠氮化钠溶于 50 ml 无菌 ddw 中，4&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存。高毒性。</td></tr><tr><td>3% 硫代甘油酸盐溶液</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 将 3 g 硫代甘油酸盐粉末溶于 100 ml ddw 中。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 煮沸至溶液变黄，然后高压灭菌。</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4%）</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>用 PBS 稀释 1:10，得到 0.04% 溶液。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶溶液 B&amp;nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-046-1</td><td>无菌</td></tr><tr><td>1 mg/ml Zymosan A</td><td></td><td></td><td>将 1 mg Zymosan A 溶于 1 ml 无菌 PBS 中，置于 Eppendorf 管内。剧烈涡旋，并在 37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 孵育 30 分钟。勿高压灭菌。使用前新鲜配制。</td></tr><tr><td>试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep PE 选择试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18557</td><td></td></tr><tr><td>EasySep PE 选择混合液&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 磁性纳米颗粒&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G 小鼠 MicroBead 试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-332</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人中性粒细胞富集试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>FITC BrdU 流式试剂盒</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>559619</td><td></td></tr><tr><td>MACS 中性粒细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-658</td><td></td></tr><tr><td>吞噬作用检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemical Company&amp;nbsp;</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR 封闭抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>纯化的大鼠抗-Ly6G 抗体&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>551459</td><td>克隆号 1A8</td></tr><tr><td>PE 标记的大鼠抗小鼠 Ly6G 抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>127608</td><td>克隆号 1A8</td></tr><tr><td>FITC 标记的大鼠抗小鼠 Ly6G</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>551460</td><td>克隆号 1A8</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 标记的大鼠抗小鼠 Ly6G&amp;nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>65-1276</td><td>克隆号 1A8</td></tr><tr><td>violetFluor 450 标记的大鼠抗小鼠 Ly6G&amp;nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>75-1276</td><td>克隆号 1A8</td></tr><tr><td>FITC 标记的大鼠抗小鼠 CD11b</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>553310</td><td>克隆号 M1/70</td></tr><tr><td>FITC 标记的大鼠抗小鼠 Ly-6G 和 Ly-6C（GR-1）</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>553127</td><td>克隆号 RB6-8C5</td></tr><tr><td>PE 标记的大鼠抗小鼠 CD45</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>553081</td><td>克隆号 30-F11</td></tr><tr><td>FITC 标记的大鼠抗小鼠 F4/80&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab60343</td><td>克隆号 BM8</td></tr><tr><td>FITC 标记的小鼠抗人 CD66b&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td>克隆号 G10F5</td></tr><tr><td>纯化的大鼠同型对照抗体（IgG&lt;sub&gt;2a&lt;/sub&gt;, k）&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>553927</td><td>克隆号 R35-95</td></tr><tr><td>LEAF 纯化型 Armenian 仓鼠抗小鼠 CD3e 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>克隆号 145-2C11</td></tr></tbody></table>

具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离与表征

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

中性粒细胞是人体循环中数量最多的白细胞，在宿主抵御入侵微生物的过程中发挥重要作用。此外，中性粒细胞在对肿瘤细胞的免疫监视中也起核心作用。它们能够识别肿瘤细胞，并通过依赖细胞接触且涉及过氧化氢的机制，或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）诱导肿瘤细胞死亡。具有抗肿瘤活性的中性粒细胞可从癌症患者或荷瘤小鼠的外周血中分离获得。这类中性粒细胞被称为肿瘤驯化中性粒细胞（TEN），以区别于健康个体或未处理小鼠的中性粒细胞，后者无明显肿瘤细胞毒性活性。与其他白细胞相比，中性粒细胞具有不同的浮力特性，这使得获取一种 &#62; 经密度梯度离心后可获得纯度达98%的中性粒细胞群体。然而，在癌症患者、荷瘤小鼠以及慢性炎症状态下，除正常的高密度中性粒细胞（HDN）群体外，循环中还会出现明显的低密度中性粒细胞（LDN）群体。LDN与单个核细胞组分共同富集，可通过阳性或阴性筛选策略与单个核细胞分离。待通过流式细胞术确定分离所得中性粒细胞的纯度后，即可用于后续实验 体外 和 体内 功能检测。我们描述了监测中性粒细胞抗肿瘤活性、迁移能力、活性氧产生能力以及吞噬功能的技术。 离体我们进一步描述了标记中性粒细胞的技术 体内 追踪，并确定其抗转移能力 体内所有这些技术对于理解如何获取和表征具有抗肿瘤功能的中性粒细胞至关重要。

在最近的一项研究中，我们发现中性粒细胞具有抗转移功能6荷瘤小鼠的中性粒细胞获得细胞毒表型并具有杀伤肿瘤细胞的能力6这与来自未处理小鼠的中性粒细胞无显著抗肿瘤效应形成对比6方案部分所述的多种技术已用于研究抗肿瘤中性粒细胞功能 体外 和 体内6.
可从荷瘤小鼠中获取具有肿瘤细胞毒性的中性粒细胞6。为实现这一目的，将4T1细胞原位注射至小鼠左侧腹股沟乳腺脂肪垫（方案1）。接种肿瘤21天后，原发肿瘤体积达到1 - 2 cm3（图3——肿瘤明显位于左下腹部）。此时，处死小鼠并通过心脏穿刺每只小鼠采集1 ml血液（图3）。同时，采集未处理的非荷瘤小鼠血液。随后，通过密度梯度离心法纯化高密度中性粒细胞（HDN）（方案2.1及图4），获得高纯度（>98%）的中性粒细胞群体。中性粒细胞的活力通过台盼蓝染色法测定（方案2.1）。然后将中...

中性粒细胞不仅在宿主防御侵入性微生物方面发挥重要作用，还参与对肿瘤细胞的免疫监视。本文描述了具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离技术，以及监测抗肿瘤中性粒细胞功能的方法。 体外 和 体内.

中性粒细胞是人体循环中数量最多的白细胞，在宿主抵御病原体入侵过程中发挥重要作用……

本实验的总体目标是研究中性粒细胞在癌症中的功能。首先获取外周血，然后通过密度梯度法纯化中性粒细胞，接着进行过夜共培养，以实现这一目标。使用荧光素酶标记的肿瘤细胞后，可定量检测细胞的荧光素酶活性。最终，每个共培养体系中荧光素酶的含量可与其中中性粒细胞的细胞毒性呈反比关系。该技术相较于现有的抗体法分离中性粒细胞及其他细胞活力评估方法的主要优势在于，该实验流程可最大限度减少中性粒细胞的非特异性活化，并可在无需使用放射性标记的情况下实现细胞活力的测定。演示该实验操作的是我实验室的一名博士研究生以及我实验室的博士后研究员Dr. Simoni。要从荷瘤小鼠中分离中性粒细胞，首先将通过心脏穿刺获得的1毫升血液加入含0.5% BSA的PBS中稀释至终体积为6毫升。接着，将3毫升无菌过滤的密度为1.119克/毫升的蔗糖溶液加入15毫升圆锥形聚丙烯离心管底部。然后缓慢而小心地倾斜离心管。在1.119克/毫升蔗糖溶液上方加入3毫升无菌过滤的1.077克/毫升蔗糖溶液，随后加入6毫升稀释血液。将蔗糖梯度中的细胞在室温下以700 ×g离心30分钟进行分离。离心结束后，大部分红细胞将位于试管底部。高密度中性粒细胞将位于蔗糖层界面处白至红环的约三毫升标记位置。而低密度白细胞则位于1.077克/毫升层与含BSA的PBS之间的白色环状区域，大约在六毫升标记处。吸取P-B-S-B-S-A层，直至低密度细胞层上方5毫米处。然后使用1毫升移液器吸头，在缓慢旋转混匀细胞的同时，通过缓慢抽吸去除低密度细胞。将细胞加入含有0.5% BSA的30毫升PBS中。然后将高密度中性粒细胞转移至另一支含有30毫升PBS加BSA的离心管中。同样条件下，离心收集两组细胞，再将沉淀重悬于36毫升无菌HPLC级水中。30 秒后，加入 9 毫升含 2.5% BSA 的 5×PBS 恢复细胞等渗环境，离心沉淀细胞。再次将细胞重悬于 10 毫升 PBS-BSA 中，通过台盼蓝排斥法测定活细胞数量。随后再次离心，将中性粒细胞重悬于孵育培养基中，调整至适当的最终细胞密度。从癌症患者体内分离循环中性粒细胞。首先将10毫升肝素抗凝的人血与等体积的3% DExT strand T 500生理盐水溶液混合，在室温下孵育30分钟，使红细胞沉降。当红细胞沉淀后，缓慢将富含白细胞的上清液叠加于10毫升密度为1.077克/毫升的蔗糖溶液上，通过离心分离细胞。如前所示，人高密度中性粒细胞将存在于沉淀中，而低密度中性粒细胞则与单核细胞和淋巴细胞共同纯化，位于密度为1.077克/毫升的蔗糖层与血浆之间的界面处。收集中性粒细胞后，将其在 10 毫升 0.2% 氯化钠溶液中稀释，作用 30 秒以裂解污染的红细胞。然后加入 10 毫升 1.6% 氯化钠溶液以恢复细胞的等渗环境，并轻轻倒置试管一次以混匀。离心收集细胞，并用 20 毫升 HBSS 洗涤沉淀物三次。然后计数细胞，并将其重悬于补充有2% FBS的RPMI 1640培养基中，调整至适当的细胞密度。为分离硫代糖苷或Xan诱导的中性粒细胞，使用带有23号一英寸针头的结核菌素注射器进行腹腔注射。向小鼠腹腔注射一毫升适当的溶液。4至24小时后，使用配有25号、五分之八英寸针头的五毫升注射器，向已处死动物的腹膜腔内注入五毫升无菌PBS。轻轻按摩腹膜腔，然后将液体重新吸回注射器，以收集腹腔渗出细胞。用含10% FBS的RPMI 1640培养基洗涤细胞。然后，为去除巨噬细胞，将每毫升1×10⁶个细胞接种于含FBS补充培养基的组织培养级培养皿中，37°C孵育2小时。为染色分离的中性粒细胞，将1×10⁵个细胞重悬于50 µL PBS分装液中，将细胞悬液置于薄层细胞制备适配器中，150 ×g离心5分钟。之后，从适配器中取出预标记的玻片，固定并染色细胞。接着，用自来水将载玻片清洗15次。让载玻片再次自然晾干，然后在光学显微镜下观察细胞，以评估中性粒细胞的抗肿瘤活性。用添加了0.5% FBS的优化型低血清培养基，将每毫升含5 × 10⁴个荧光素酶标记的肿瘤细胞稀释五倍。然后在白色96孔平底组织培养板的每孔中加入100微升含0.5%FBS的优化低血清培养基，接种5×10³个肿瘤细胞。4小时后，向每孔加入50微升含0.5%FBS的优化低血清培养基，其中包含1×10⁵个中性粒细胞，进行过夜培养。次日早晨，轻轻吸除上清液，并用200微升PBS洗涤每孔一次。然后吸去 PBS，并向每孔加入 50 微升被动裂解缓冲液。接着将培养板用铝箔覆盖后，在室温下置于旋转摇床上以 150 转/分钟孵育。20 分钟后，将培养板放入化学发光检测仪中进行检测。向每个孔中加入50 µL荧光素酶检测试剂，每孔读取10秒化学发光信号。最后使用公式计算肿瘤细胞裂解百分比，以检测本代表性实验中中性粒细胞的细胞毒作用程度，实验中细胞比例为1×10⁵。中性粒细胞与表达荧光素酶的4T1靶细胞共培养，共培养体系中所用中性粒细胞如前所示，来源于无肿瘤小鼠。 观察到肿瘤细胞的杀伤作用非常有限。然而，从荷瘤小鼠中纯化的中性粒细胞表现出显著的细胞毒性，用于检测低密度和高密度中性粒细胞的免疫抑制特性。在抗 CD3 激活后，评估了经抗 CD3 或抗 CD3 联合低密度或高密度中性粒细胞刺激后 CD8 阳性脾 T 细胞的数量。观察到CD8阳性细胞数量显著增加。然而，与低密度中性粒细胞共培养时，CD8阳性细胞明显减少，而在高密度中性粒细胞存在的情况下未观察到此效应。此外，还评估了CFSE的保留程度，作为增殖的指标。注意抗CD3处理的细胞以及在高密度中性粒细胞存在下培养的抗CD3处理细胞均出现向左的峰移，表明在这两种情况下CD8阳性细胞的增殖均增加。完成此操作后，还可进行其他方法，如检测氧化爆发、吞噬作用或迁移能力，以回答更多问题，例如：在不同病理情况下中性粒细胞功能如何受到影响？

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

隔离和中性粒细胞的表征与抗肿瘤性质

本报告中，我们描述了一种用于分离高度纯化的肿瘤浸润白细胞群体的实验方案。该方案改编自 Miltenyi Biotech...

从原发性肿瘤中分离免疫细胞

在本视频中，我们通过不连续蔗糖梯度离心法，展示了从小鼠肿瘤模型血液中分离具有细胞毒性的高密度中性粒细胞和低密度中性粒细胞的过程。...

从荷瘤小鼠血液中分离具有细胞毒性的中性粒细胞

本视频展示了一种生成抗血管生成性肿瘤相关性中性粒细胞（TANs）的实验方法。通过获取含有促血管生成性TANs的小鼠黑色素瘤组织，采用荧光激活细胞分选技术（FACS）分离单细胞，并使用烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）抑制剂处理，以降低其促进血管生成的能力。...

生成抗血管生成的肿瘤相关中性粒细胞

中性粒细胞是最丰富的白细胞类型。本文介绍了通过密度梯度分离法从人血液中分离中性粒细胞，以及将人早幼粒细胞（HL60）沿粒细胞途径进行分化的方法；用于检测它们在淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性中的作用。...

中性粒细胞分离与分析以确定其在淋巴瘤细胞对治疗药物敏感性中的作用

本文描述了分离和表征来源于人和小鼠中性粒细胞的微颗粒的新方案。这些方案利用超速离心、流式细胞术和免疫印迹技术来分析微颗粒的内容物，可用于研究来源于不同细胞类型的微颗粒在细胞功能中的作用。...

中性粒细胞来源微颗粒的功能研究分离与表征

本文介绍了一种方法，即从术后腹腔灌洗液中分离的人类低密度中性粒细胞（LDN）能够大量产生中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），并有效捕获随后生长的游离肿瘤细胞。...

由腹腔灌洗液中获取的低密度中性粒细胞产生的中性粒细胞胞外诱捕网促进肿瘤细胞生长与黏附

本文介绍了一种检测固定和通透处理的组织切片中中性粒细胞存在情况，以及评估活体纯化中性粒细胞活化状态的实验方案。其中，MUB40 肽可结合存在于中性粒细胞特异性颗粒和三级颗粒中的乳铁蛋白。通过通透处理或中性粒细胞活化暴露颗粒内容物，即可实现对中性粒细胞的标记。...

用于检测中性粒细胞介导的炎症事件的 MUB40 肽

在此，我们展示了将抗血管生成性肿瘤相关中性粒细胞转移至荷瘤小鼠后所表现出的治疗潜力。该方案可用于在体外调控中性粒细胞活性，并进一步在体内评估其功能。 在肿瘤发生过程中.

将经处理的肿瘤相关中性粒细胞转移至荷瘤小鼠以研究其体内促血管生成潜能

本方案详细描述了一种从全血、血沉棕黄层或白细胞单采膜中分离中性粒细胞的方法，可获得较高的细胞得率、高纯度以及最低程度的细胞活化。我们采用梯度纯化、红细胞（RBC）沉降和红细胞裂解法，以获取高质量/高纯度的中性粒细胞制备物。...

从全血和血沉棕黄层中分离人中性粒细胞

本明确的实验方案描述了一种实时高通量显微镜技术，用于在体外可视化并定量人中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的释放。in vitro...

实时、高通量显微定量人中性粒细胞胞外诱捕网释放及拮抗剂药理学评估

本文提供了一种利用磁性分离法（阴性筛选）结合不连续密度梯度介质从全血中分离低密度和正常密度中性粒细胞的可靠方法。该方法可实现未受干扰的高纯度细胞分离（≥93%），有助于对中性粒细胞亚群进行准确的下游分析，对于理解其在健康与疾病中的作用至关重要。...

从全血中分离与鉴定低密度和正常密度中性粒细胞

学习利用密度梯度离心法分离中性粒细胞，并通过荧光素酶标记的肿瘤细胞共培养实验评估其抗肿瘤细胞毒性。该方法可避免非特异性激活，为癌症免疫学研究提供可靠的技术手段。

具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离与表征

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