Name: 重金属和微藻的产其他无机污染物的量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 了解利用ICP-MS和CVAAS技术量化微藻Nannochloropsis salina中重金属及其他无机污染物的方法。该研究评估污染物对藻类生长的影响及其在生物质中的积累，为工业废气耦合微藻培养生产生物燃料和生物修复提供重要数据支持。

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作者感谢美国国家科学基金会（资助号：1335550）、犹他州水研究实验室、Joan McLean 教授和 Tessa Guy 在金属/类金属分析过程中提供的帮助。作者还感谢 Laura Birkhold 在数据收集方面的支持以及 Danna Olbright 的帮助。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

盐生微藻N. salina可在设计的培养系统中成功培养，结果可重复且生物量产量高。在7天的培养周期内，气升式搅拌实现了良好的悬浮培养混合状态，沉降或生物污染极少。荧光灯组光照强度的微小差异也被证明不会对生长产生明显影响。
研究表明，含有重金属污染介质的培养环境，其浓度若与燃煤烟气整合条件相当，会对生物量生长产生负面影响。本研究的可重复性凸显了多金属体系对生产率的影响。该过程中的多个步骤可能对生长产生不利影响，并导致系统污染，因此需要严格的实验准备。实验开始前测定培养基的 pH 值是一项质量控制步骤，可用于验证培养基是否发生酸化（例如，酸浸泡后光生物反应器冲洗不当所导致）。培养基酸化将影响藻类生长，并改变营养物质的生物可利用性（例如，无机碳形态和金属形态的变化），从而影响藻类结合位点、营养物质与金属之间的相互作用。这些研究要求对实验室设备进行细致的准备，以确保所添加金属的质量平衡能够准确测定。该过程中的其他步骤可能引入未被计量的金属，突显了使用适当纯度等级溶剂和化学品的必要性。在整个过程中实施适当的质量控制，可有效识别重金属污染物...

与传统陆生作物相比，微藻由于具有更高的固有太阳能转化效率，已被证明可实现更高的生物量和脂质产量1,2。要实现微藻的高生产率培养，需要提供多种营养物质，包括外源碳源。预计大规模微藻培养设施将与工业废气流（如工业烟气）相结合，以降低生产成本，同时实现环境修复。工业废碳通常以气态二氧化碳形式存在，并可能含有对微藻生产产生负面影响的污染物。具体而言，来自燃煤的烟气包含多种污染物，包括但不限于燃烧产物水和二氧化碳，以及硫氧化物和氮氧化物、细颗粒物、二噁英和呋喃等有机污染物，和重金属等无机污染物。这些污染物中的大多数，包括某些已知的重金属，对微藻生产力的影响尚未得到充分研究。其中一些元素在适当浓度下可作为营养物质，但在较高浓度下可能导致细胞功能障碍甚至死亡3。
将微藻与工业烟气结合可能会将无机污染物直接引入培养基中。燃煤烟气中含有多种无机元素（例如 As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Sb、Se、Sn、V 和 Zn），其浓度各不相同，其中部分元素在低浓度下可作为微藻生长所需的营养物质。无机污染物具有高度亲和性，易于与微藻结合，并通过营养转运蛋白进一步被细胞内吸附。某些无机污染物（即 Co、Cu、Zn 和 Mn）是营养元素，可构成参与光合作用、呼吸作用及其他生理功能相关酶的组成部分3,4。然而，当这些金属元素过量时，可能产生毒性。其他元素如 Pb、Cd、Sn、Sb、Se、As 和 Hg，目前未发现其在任何浓度下对细胞功能具有促进作用，属于非营养性金属，可能对微藻培养生长产生负面影响3,5,6。这些污染物的存在均有可能对微藻细胞功能造成不利影响。此外，多种金属与微藻的相互作用使生长动态更加复杂，并可能影响其生长表现。
大规模经济效应与栽培系统的生产力直接相关7-19此外，微藻培养系统中的培养基循环利用至关重要，对于开放式跑道池（ORP）和光生物反应器（PBR）而言，其分别占系统总质量的99.9%和99.4%20培养基中无机污染物的存在可能因污染物的累积而最终限制微藻的生产效率以及培养基的循环利用。本研究通过实验确定了14种无机污染物（As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Sb、Se、Sn、V 和 Zn）在微藻培养系统与燃煤烟气耦合过程中可能达到的浓度下，对微藻生产效率的影响 N. salina 在气升式光生物反应器中培养。本研究中使用的污染物不仅存在于燃煤烟气中，还存在于城市垃圾烟气、生物污泥烟气、城市污水、产出水、受污染的地下水以及海水中。21-23本研究中所用浓度是基于微藻培养系统与燃煤CO₂排放源相结合时可能达到的预期水平。2 具有在商用PBR系统中已证实的吸收效率的来源20Napan 中提供了支持重金属和无机污染物浓度的详细计算过程 等24 采用分析技术来研究金属在生物量、培养基和环境中的分布情况。所提出的方法能够评估微藻在无机污染物胁迫下的生产潜力，并量化其最终归宿。

<table><tbody><tr><td>化学试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>九水合偏硅酸钠&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S408-500</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钾</td><td>EMD Chemical</td><td>PX1520-5</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铁铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>I72-500</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td></td></tr><tr><td>二水合钼酸钠</td><td>EMD Chemical</td><td>SX0650-2</td><td></td></tr><tr><td>四水合氯化锰</td><td>Fisher Scientific</td><td>M87-500</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸锌</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td></td></tr><tr><td>五水合硫酸铜</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489-500</td><td></td></tr><tr><td>生物素&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>230090010</td><td></td></tr><tr><td>硫胺素&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>148990100</td><td></td></tr><tr><td>维生素B12&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>405920010</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化铜(II)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221783-100G</td><td>刺激性，对环境有害</td></tr><tr><td>氯化铅(II)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>268690-250G</td><td>有毒，对环境有害</td></tr><tr><td>二水合重铬酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398063-100G</td><td>氧化性，剧毒，对环境有害</td></tr><tr><td>六水合氯化钴(II)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255599-100G</td><td>有毒，对环境有害</td></tr><tr><td>六水合氯化镍(II)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223387-500G</td><td>有毒，对环境有害</td></tr><tr><td>亚砷酸钠(偏亚砷酸钠)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71287</td><td>有毒，对环境有害</td></tr><tr><td>氯化镉&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202908-10G</td><td>剧毒，对环境有害</td></tr><tr><td>氯化汞(II)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215465-100G</td><td>有毒，对环境有害</td></tr><tr><td>二水合氯化亚锡</td><td>Fisher Scientific</td><td>T142-500</td><td>腐蚀性。适用于汞分析。有极高危险性。</td></tr><tr><td>四水合氯化锰</td><td>Fisher Scientific</td><td>M87-500</td><td></td></tr><tr><td>五氧化二钒</td><td>Acros Organics</td><td>206422500</td><td>对环境有害</td></tr><tr><td>二氧化碳&amp;nbsp;</td><td>Air Liquide</td><td>I2301S-1</td><td>压缩气体</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>H325-500</td><td>Fisher Scientific</td><td>水溶液中含30%</td></tr><tr><td>ICP-MS标准品</td><td>ICP-MS-6020</td><td>High Purity Standards</td><td></td></tr><tr><td>汞标准品</td><td>CGHG1-1</td><td>Inorganic Ventures</td><td>1000&amp;plusmn;6 &amp;micro;g/mL，溶于5%硝酸</td></tr><tr><td>氩气</td><td>Air Liquide</td><td></td><td>压缩气体</td></tr><tr><td>氦气</td><td>Air Liquide</td><td></td><td>压缩气体，超高纯度</td></tr><tr><td>氢气</td><td>Air Liquide</td><td></td><td>压缩气体，超高纯度</td></tr><tr><td>硝酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A509-P212</td><td>67-70%硝酸，痕量金属级。注意：需在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A508-P212</td><td>35%盐酸，痕量金属级。注意：需在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>科学预真空灭菌器</td><td>Steris</td><td>31626A</td><td>SV-120</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Fisher</td><td>46910</td><td>RC-6 Plus</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Shimadzu</td><td>1867</td><td>UV-1800</td></tr><tr><td>pH控制器</td><td>Hanna</td><td>BL981411</td><td>X4</td></tr><tr><td>转子流量计，X5</td><td>Dwyer</td><td>RMA-151-SSV</td><td>T31Y</td></tr><tr><td>转子流量计，X5</td><td>Dwyer</td><td>RMA-26-SSV</td><td>T35Y</td></tr><tr><td>循环水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-873-45A</td><td></td></tr><tr><td>紧凑型冷却器</td><td>VWR</td><td>13270-120</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Labconco</td><td>7752020</td><td></td></tr><tr><td>搅拌器</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49S</td><td></td></tr><tr><td>pH实验室电极</td><td>Phidgets Inc</td><td>3550</td><td></td></tr><tr><td>电感耦合等离子体质谱仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>7700 Series ICP-MS</td><td>连接CETAC ASX-520自动进样器</td></tr><tr><td>FIAS 100</td><td>Perkin Elmer Instruments</td><td>B0506520</td><td></td></tr><tr><td>原子吸收光谱仪</td><td>Perkin Elmer Instruments</td><td>AAnalyst 800</td><td></td></tr><tr><td>石英加热池</td><td>Perkin Elmer Instruments</td><td>B3120397</td><td></td></tr><tr><td>微波消解仪</td><td>Milestone</td><td></td><td>可编程，最大功率1,200 W</td></tr><tr><td>微波转子</td><td>Milestone</td><td></td><td>配备24个75 ml聚四氟乙烯（PTFE）消解罐，用于密闭容器微波辅助消解</td></tr><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;#956;m注射器滤器</td><td>Whatman</td><td>6713-0425</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;#956;m注射器滤器</td><td>Whatman</td><td>6713-1650</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;#956;m注射器滤器</td><td>Thermo Fisher</td><td>F2500-3</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯管</td><td>Evergreen</td><td>222-2094-050</td><td>17 x 100 mm，带盖，16 ml，聚苯乙烯</td></tr><tr><td>八角形磁力&amp;nbsp;搅拌&amp;nbsp;子</td><td>Fisher scientific</td><td>14-513-60</td><td>聚四氟乙烯（PTFE）包裹的磁铁</td></tr></tbody></table>

微藻生产力中重金属及其他无机污染物的定量分析

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

可再生燃料需求的不断增长促使研究人员探索替代原料（如微藻）的可行性。微藻具有诸多内在优势，包括高潜在产量、可利用非耕作土地以及能够与废水等废物资源相结合。大规模微藻生产系统的营养需求将要求将培养系统与工业废弃物资源耦合，例如来自烟道气的二氧化碳和来自废水的营养物质。然而，这些废弃物中存在的无机污染物可能导致微藻生物质中污染物的生物累积，进而对生产效率产生负面影响并限制其最终用途。本研究聚焦于实验评估14种无机污染物（As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Sb、Se、Sn、V 和 Zn）对 Nannochloropsis salina 生长的影响及其归趋。实验在光生物反应器中进行，光照强度为 984 µmol m-2 sec-1，培养基 pH 值维持在 7，并添加了基于商业燃煤烟道气系统中典型成分浓度的无机污染物。在为期7天的生长周期结束后，采用冷蒸气原子吸收光谱法测定生物质和培养基中的 Hg 含量，采用电感耦合等离子体质谱法测定 As、Cd、Co、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Sb、Se、Sn、V 和 Zn 的含量。结果表明，N. salina 对多金属环境较为敏感，这些污染物的引入导致其生物量产量出现统计学上的显著下降。本文所采用的技术方法适用于定量分析微藻生长情况并确定无机污染物的归趋。

生物量产量
在本研究使用的光生物反应器（PBR）系统中，N. salina 的产量在7天内从对照组反应器的1 g/L-1 增长至8.5 ± 0.19 g/L-1（N = 12），而多金属污染组的产量为4.0 ± 0.3 g/L-1（N = 12）。实验在三个重复反应器及多批次培养中均获得了可重复的数据。图2A展示了基于三个独立PBR取样的平均培养密度，其标准误差极小。为确保该结果并非偶然，又进行了三批相似条件的培养实验，所有四批实验的综合结果如图2B所示。尽管存在生物学变异，本研究结果表明无机污染物对N. salina的生产具有持续的负面影响。从第2天起，暴露于污染物的PBR中的生物量产量与对照组PBR相比具有统计学上的显著差异（ANOVA，p &lt;0.05）。
无机污染物定量的质量控制评估
<p class="jove_cont...

将微藻培养与工业烟气相结合，最终会将重金属和其他无机化合物引入培养基中。本研究介绍了一种用于确定重金属及无机污染物对在光生物反应器中培养的Nannochloropsis salina生长过程的影响及其最终归趋的实验方法。

对可再生能源需求的不断增长，促使研究人员探索替代原料的可行性，例如微藻。其固有优势……

本实验的总体目标是量化因使用燃煤电厂提供的二氧化碳作为微藻生长的碳源，而导致重金属进入微藻培养系统后所产生的影响及其最终归宿。首先通过分析燃煤烟气中可能含有的污染物水平来评估潜在的污染程度。在微藻培养过程中，以此污染水平作为基础污染基准，并据此制备相应的培养储备液。接下来，培养所需的接种物并建立大规模生长平台。随后对系统进行接种，并定期取样处理。最后，分离生物量并定量分析污染物的最终去向。最终，采用电感耦合等离子体质谱法（I-C-P-M-S）来测定生物质所吸收的金属元素，结合光密度测量，可揭示污染物对系统的影响。该方法相较于现有技术的主要优势在于能够直接量化多金属体系的最终归宿。该方法可深入了解烟气中重金属的影响。该方法也可应用于其他系统。本方法有助于回答微藻研究领域中的关键问题，例如重金属对微藻生产力的影响，以及微藻用于生物修复的能力。通常，初次接触该方法的研究人员会因潜在的污染风险和所需的精确操作而面临困难。在准备样品并使用IC PMS进行分析时，我们首次提出了该方法的构想。当时我们正试图了解烟气整合过程中金属和藻类可能产生的影响，这一想法源于与水研究实验室其他研究人员的讨论。在构建微藻实验培养系统并根据文本方案准备实验器皿后，我们才了解到该方法。用去离子水部分填充一个20升可高压灭菌的容器，并放入一个磁力搅拌子。将容器置于磁力搅拌器上，然后依次加入此处列出的化学物质，每种物质均需完全溶解后再加入下一种。在120摄氏度下高压灭菌培养基30分钟，待其冷却至室温后再加入维生素。用蒸馏水部分填充容量瓶，并加入此处列出的单一盐类，以配制无机污染物储备液。然后用蒸馏水定容至所需体积，并充分混匀。通过无菌的0.2微米注射器滤膜过滤溶液，对无机污染物储备液进行灭菌，并将滤液收集至无菌试管中。根据文本方案，在无菌培养皿中培养出Salina菌落后，制备Salina接种液：将200毫升预先配制的富营养培养基加入带挡板的锥形瓶中，接种Salina菌落，并在光照摇床中培养。让培养物生长至培养基变为绿色。将微藻转移至1.1升无菌光生物反应器（PBR）中，将PBR置于接种水浴中。使用8根T8荧光灯以200微摩尔每平方米每秒的光照强度照射，并通过循环冷却器和自动控温循环水浴系统将温度维持在23摄氏度。将空气和二氧化碳转子流量计分别调节至每分钟2.5升和每分钟25立方厘米。根据文本方案培养并收获微藻。使用70%乙醇校准pH计和pH控制器。将校准后的pH计对每个先前准备好的光生物反应器（PBR）进行灭菌。向每种无菌无机污染物储备液中各加入一毫升，使其终浓度如本表所示。随后，将浓缩的微藻接种液加入实验用PBR中，初始培养密度为每升一克。然后打开高强度光源和pH控制器，并将二氧化碳调节至30立方厘米每分钟。根据文本方案，培养七天后，通过离心（9,936 ×g）收集生物量。同时收集生物量和上清培养基，并在-80摄氏度下保存。随后在0.1毫巴和-50摄氏度下对生物量进行过夜冷冻干燥。使用刮刀在离心管内将生物量研磨成粉末，以制备用于电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析的样品。首先用肥皂和水清洗聚四氟乙烯微波消解罐，然后使其自然晾干。根据文本方案去除痕量金属后，将50毫克冻干生物量加入微波消解罐中以消解生物量。为质量控制。准备两个实验室加标空白（LFB）小瓶，分别装入五毫升的7级ICP-MS标准溶液，或五毫升的7级汞冷蒸气原子吸收光谱（CVAS）标准溶液。另留一个空瓶，用作实验室试剂空白（LRB）。在每个小瓶旁边，加入 7 毫升浓的痕量金属级硝酸和 3 毫升过氧化氢。然后轻轻旋转混合溶液以均质化，再对每个小瓶中的内容物进行消解，并根据文本方案进行分析。该图显示了对照反应器和多金属污染反应器中连续七天培养的平均 Lina 密度，标准误差极小，数据来自三个独立的 PBRs 的取样结果。为确保该结果并非偶然，又额外培养了三批样品，此处展示了全部四批样品的综合结果。本研究表明，从第二天开始，无机污染物对林那霉素（Lina）的生产具有统计学上显著的负面影响，与对照组相比差异显著。在分析的14种元素中，有12种在消解后可完全回收，如LFB百分比（R）所示，其百分比R值接近100%，表明在消解过程中分析物无损失、无增加，也无交叉污染。此处展示了在12种分析元素中，生物质内重元素和无机污染物的浓度。结合三个平行光生物反应器（PBR）四批次的实验数据一致表明，无机污染物主要存在于生物质中。第一批次三个平行PBR的实验结果表明，大多数污染物定位于生物质中，而非上清液中。使用多个接近仪器定量下限（MRL）的样品浓度进行检测。此处展示了全部四批样品的结果。在执行该操作流程时，务必注意保持系统的清洁，因为污染物可能对结果产生不利影响。按照本方案获得的结果，还可进一步开展其他生长实验，以回答更多科学问题，例如梯度营养物对受重金属污染的生长系统的影响，或微藻在生物修复中的潜在应用。观看本视频后，您应充分了解如何不仅培养藻类，而且为电感耦合等离子体质谱法（I-C-P-M-S）制备样品。请务必注意，操作重金属可能具有极高危险性，在执行本实验步骤时，应采取相应预防措施，例如佩戴手套、护目镜，并在通风橱中操作。

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评估生长因子对微藻中叶绿素a和b生成的影响

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微藻生产力中重金属及其他无机污染物的定量分析

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