Name: 全激光内皮移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学习全激光内皮移植技术，使用飞秒激光精确切割供体角膜组织并进行激光焊接。该方法实现微创角膜移植手术，术后一天即可观察到供体内皮粘附，降低瓣片移位风险。

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作者谨此感谢由托斯卡纳大区资助的FORTE项目（POR CReO FESR 2007-2013，单一招标Bando Unico R&amp;#38;S 2012）、欧盟第七框架计划（FP7）项目 ECHORD++ 实验 LA-ROSES（部分支持了本研究工作），以及由托斯卡纳大区资助的 FP7 生物光子学增强项目“LITE”。

本研究经医院伦理委员会前瞻性批准，并已获得知情同意。研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则。
1. 供体血管内皮制备
<ol>
	<li>使用当地眼库在室温下制备的供体角膜。</li>
	<li>在手术室内，将供体角膜从运输容器中取出，并分离用于角膜转运的组织保存与营养液。</li>
	<li>将供体角膜-巩膜环置于人工前房上，该装置可注入液体并产生可变压力；用组织固定头覆盖角膜。</li>
	<li>通过三通连接器将人工前房（AAC）连接至装有角膜保存与营养液的注射器。</li>
	<li>使用压缩环牢固固定固定装置。</li>
	<li>使用连接至人工前房（AAC）的注射器维持前房内压力：向前房注入组织保存液，直至达到最佳压力（见步骤1.7）。关闭连接器。</li>
	<li>用手指测试前房内的压力。调节内部压力，使其达到合适的内压范围（60–70 mmHg）。关闭三通连接器。</li>
	<li>使用光学相干断层扫描仪（OCT）测量供体角膜的厚度。将带有该角膜的人工前房固定于仪器光学系统前方，然后进行全层OCT扫描采集。</li>
</ol>
2. 飞秒激光制备供体角膜内皮
<ol>
	<li>在飞秒激光设备下对供体角膜进行压平。使用飞秒激光对供体组织进行三次连续切割：后侧切口、全层板层切口和前侧切口。为这三次切割设置以下参数：
	<ol>
		<li>对于全层板层切口（光栅模式，由外向内开始），将切割深度设置为供体角膜最薄处的对应值（通过OCT测量，如步骤1.8所述），并始终减去95 µm。脉冲能量设置在0.8–0.9 µJ范围内（根据工作深度调整）。直径设为8.7 mm。切向光斑间距设为2 µm。径向光斑间距设为2 µm。</li>
		<li>对于前侧切口，将后部深度设置为比前一次全层板层切口深30 µm。脉冲能量设为2.10 µJ；直径设为8.6 mm；光斑间距设为3 µm，层间间距设为3 µm。</li>
		<li>对于后侧切口，将后侧切口的前部深度设置为比全层板层切口前30 µm。后部深度设为900 µm。脉冲能量设为2.10 µJ；直径设为8.3 mm；光斑间距设为2 µm；层间间距设为2 µm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 受体眼准备
<ol>
	<li>为患者做好手术准备。使用4.0 mm预校准刀具在12点钟位置制作一个4.00 mm的角膜切口。使用1.2 mm预校准刀具在2点钟位置制作一个角膜缘旁切口。使用30°穿刺刀在6点钟位置制作另一个角膜缘旁切口。</li>
	<li>通过2点钟位置的旁切口将前房维持器插入患者前房。</li>
	<li>使用专用钩针进行直径为8.2 mm的环形Descemet膜剥离术。</li>
	<li>将Descemet膜和内皮从后部基质上剥离，并用Descemet钩将组织取出。</li>
</ol>
4. 色素的制备
<ol>
	<li>将1 mg吲哚菁绿粉末放入1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>加入9 mg无菌水（吲哚菁绿水溶液为10% w/w）。</li>
	<li>使用金属搅拌器手动混合吲哚菁绿粉末和水。</li>
</ol>
5. 供体血管内皮染色
<ol>
	<li>将供体角膜内皮置于Busin注射器较宽的部分，内侧面与注射器表面接触。</li>
	<li>使用刮匙在供体角膜内皮内侧面的周边区域滴加光敏剂溶液进行染色。正确染色的组织呈均匀的淡绿色。在开始步骤5.3前等待3分钟。</li>
	<li>将供体角膜内皮卷曲后拉至Busin注射器的前部。</li>
</ol>
6. 植入供体角膜内皮
<ol>
	<li>使用无创同轴角膜内皮镊夹取并植入折叠的供体内皮组织。</li>
	<li>移除前房维持器。</li>
	<li>用尼龙10-0单缝线缝合角膜切口及步骤3.1中制作的侧切口。</li>
	<li>注入气泡以展开供体组织，并使其紧贴受体角膜。气泡必须完全充满前房空间。</li>
</ol>
7. 激光焊接
<ol>
	<li>使用钩子从角膜内部或使用刮刀从角膜外部移动气泡，将供体透镜置于受体角膜中央。</li>
	<li>使用发射波长为 810 nm 的二极管激光器，配备核心直径为 300 µm、数值孔径（NA）为 0.22 的无菌光纤。</li>
	<li>将光纤尖端保持在眼球外部，通过透明的角膜组织将激光照射至染色的内皮层。光纤尖端处于非接触模式。</li>
	<li>激光参数设置如下：单点发射模式，脉冲持续时间为 70–80 msec，每脉冲能量为 35–40 mJ，启用氦氖（He-Ne）瞄准光束。</li>
	<li>在供体内皮染色的边缘区域施加单个激光点，按顺序依次施加，最终在供体透镜边缘形成一圈激光点。相邻两个激光点中心之间的距离为单个光斑直径的两倍。</li>
	<li>在患者眼部佩戴接触镜，并使用 0.3% 妥布霉素和 0.1% 地塞米松滴眼悬浮液。</li>
</ol>

<ol><li>Tan, D. T., Dart, J. K., Holland, E. J., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Corneal transplantation.</a> Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).</li>
<li>El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+Review+and+Update+of+Surgical+Treatment+for+Corneal+Endothelial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmol+Ther%22%5BJournal%5D)">Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases.</a> Ophthalmol Ther. , (2014).</li>
<li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+tissue+welding+in+ophthalmic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Laser tissue welding in ophthalmic surgery.</a> J Biophotonics. 1 (4), 331-342 (2008).</li>
<li>Pini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+femtosecond+laser+ablation+and+diode+laser+welding+in+lamellar+and+endothelial+corneal+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE+Ophthalmic+Technologies+XVIII%22%5BJournal%5D)">Combining femtosecond laser ablation and diode laser welding in lamellar and endothelial corneal transplants.</a> Proc. SPIE Ophthalmic Technologies XVIII. 6 (844), 684411-1-684411-7 (2008).</li>
<li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-laser%27+endothelial+corneal+transplant+in+human+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE+Ophthalmic+Technologies+XXII%22%5BJournal%5D)">All-laser' endothelial corneal transplant in human patients.</a> Proc. SPIE Ophthalmic Technologies XXII. 8209, 82091O-1-82091O-3 (2012).</li>
<li>Rossi, F., Pini, R., Menabuoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+model+analysis+on+the+temperature+dynamics+during+diode+laser+welding+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Experimental and model analysis on the temperature dynamics during diode laser welding of the cornea.</a> J Biomed Opt. 12 (1), 014031-1-014031-7 (2007).</li>
<li>Menabuoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+corneal+welding+in+cataract+surgery%3A+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cataract+Refract+Surg%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted corneal welding in cataract surgery: retrospective study.</a> J Cataract Refract Surg. 33 (9), 1608-1612 (2007).</li>
<li>Buzzonetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Welding+in+Penetrating+Keratoplasty+and+Cataract+Surgery+in+Pediatric+Patients.+Early+Results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cataract+Refract+Surg%22%5BJournal%5D)">Laser Welding in Penetrating Keratoplasty and Cataract Surgery in Pediatric Patients. Early Results.</a> J Cataract Refract Surg. 39 (12), 1829-1834 (2013).</li>
<li>Menabuoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27anvil%27+profile+in+femtosecond+laser-assistedpenetrating+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The 'anvil' profile in femtosecond laser-assistedpenetrating keratoplasty.</a> Acta Ophthalmol. 91 (6), e494-e495 (2013).</li>
<li>Canovetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+penetrating+keratoplasty%3A+one+year%E2%80%99s+results+in+patients%2C+using+a+laser-welded+%E2%80%9Canvil%E2%80%9D-profiled+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted penetrating keratoplasty: one year’s results in patients, using a laser-welded “anvil”-profiled graft.</a> Am J Ophthalmol. 158 (4), 664-670 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

“全激光”内皮移植是一种用于微创角膜移植的原创性方法。
本方案中所述的所有操作均在手术室内进行，遵循手术过程中常见的卫生与消毒规范，例如使用无菌手套、手术衣、口罩和帽子。吲哚菁绿（ICG）溶液在手术室内配制，配制完成后立即用于供体角膜内皮的染色。所用的ICG粉末、水及配制染色液的所有器械均为无菌且可商业获得，适用于人体受试者。激光光纤经过灭菌处理，并安装在特定的手持装置上，以便在手术显微镜下使用。
在所提出的方法中，术中光学相干断层扫描（OCT）可用于准确测量供体组织的厚度。该信息用于设计个性化的切削轮廓，通过飞秒激光对供体组织进行切削，从而获得理想且更薄的供体透镜厚度。随后进行激光焊接操作，以稳定供体透镜在受体床中的位置。该技术能够降低供体组织移位的风险：据我们所知，这是将供体角膜内皮缝合至受体床的唯一方法。
该操作的一个关键点在于，吲哚菁绿（ICG）溶液必须在手术室内于使用前立即配制，原因是ICG的光学特性会迅速降解。未来可改进的方向是开发一种即用型试剂盒。另一个关键...

本研究提出了一种内皮性角膜移植术的原创方法，该方法基于飞秒激光制备供体组织，并利用近红外二极管激光将供体组织焊接至受体床。术中对供体角膜进行测量，对于准确设计供体组织的尺寸至关重要。近年来，内皮性角膜移植术已被提出用于替代穿透性角膜移植术，以治疗角膜内皮疾病1,2。该技术的主要优势在于与穿透性角膜移植术相比，具有更快的视力恢复速度、术中麻醉需求减少、移植物排斥风险降低以及眼结构完整性的保留。其主要风险因素是术后供体透镜移位。标准技术是将供体角膜内皮植入最终位置，并通过注入气泡使其固定：由于角膜内皮的机械、生物物理和尺寸特性，无需使用缝线。此外，视力恢复可能受到限制，主要原因在于移植组织过厚，导致供体与受体组织之间存在不匹配。
本文介绍了一种可克服上述主要问题的内皮角膜移植术操作方法。通过使用激光焊接技术，可确保供体角膜内皮在最终位置的固定。该技术是一种可控且局部化的光热过程，可在供体与受体界面处诱导产生。该技术在过去十年中已被研究，并已应用于穿透性角膜移植术及内皮移植3-5。由低功率二极管激光器发射的近红外光（波长：810 nm）被引导至伤口部位的生物组织。角膜对该波长具有天然透明性；为了使该组织能够吸收激光，必须使用发色团对其进行染色。所采用的染料为无菌饱和吲哚菁绿（Indocyanine Green, ICG）水溶液。我们已证实，当角膜组织经该ICG制剂适当染色后，在810 nm处呈现吸收峰6。此外，ICG已广泛应用于临床诊断，其在人体中的安全性已有充分验证。经染色的角膜吸收二极管激光的能量，主要效应是在焊接部位产生可控的温度升高。未染色组织则不会产生热效应。温度升高可引起基质胶原蛋白发生可逆性热变性，冷却后伤口边缘立即闭合。该激光焊接效应最初已在白内障手术7,8和穿透性角膜移植术9,10中得到证实。本文所介绍的是一种经过优化的方法，专为应用于内皮角膜移植术而研究设计。
在所提出的手术中，将单个激光点（持续数十毫秒）作用于组织，从而在光斑尺寸范围内（数百微米内）产生局部化的光热效应 &#181;直径为 m：该效应为硬激光焊接，即在供体与受体组织界面处局限性的胶原蛋白光凝固。焊接部位胶原蛋白变性后可导致供体与受体组织之间形成牢固黏附，从而产生标准技术（缝合）无法实现的缝合效果。术后短期内（1个月）组织即可恢复自然外观，且在愈合早期阶段通过激光焊接可进一步增强供体与受体组织间的黏附。
为避免内皮角膜移植术的另一主要风险， 即 使用厚供体组织进行移植时，术中采用光学相干断层扫描（OCT）：商用设备测量供体角膜的厚度，从而利用飞秒激光设计出精确的切削轮廓。因此，这种所提出的“全激光”内皮移植术似乎可改善此类微创手术的临床效果。

<table><tbody><tr><td>吲哚菁绿</td><td>Pulsion Medical Systems，德国</td><td>ICG-PULSION (http://www.pulsion.com/international-english/perfusion/icg-pulsion/)</td><td>替代产品：IC-GREEN，Akorn&amp;nbsp; Inc.，Lake Forest，Illinois - 美国 (http://www.icginjection.com/)</td></tr><tr><td>飞秒激光器&amp;nbsp;</td><td>Abbott Medical Optics，&amp;nbsp; Abbott Laboratories Inc.，Abbott Park，Illinois，美国</td><td>iFS150 (http://www.abbottmedicaloptics.com/products/refractive/ilasik/ifs-advanced-femtosecond-laser)</td><td></td></tr><tr><td>光学相干断层扫描仪（OCT）</td><td>Carl-Zeiss Meditec，加利福尼亚州都柏林，美国 (http://www.zeiss.com/meditec/en_de/home.html)</td><td>Visante</td><td></td></tr><tr><td>二极管激光器</td><td>E.l.En. Group s.pa.，Calenzano-FI，意大利 (http://www.elengroup.com/en/divisions/medical)</td><td>型号 WELD 800</td><td></td></tr><tr><td>人工前房</td><td>CORONET 角膜移植产品，Network Medical Products Ltd.，Coronet House，Kearsley Road，Ripon，North Yorkshire，HG4 2SG，英国</td><td>带大、小组织固定头的人工前房（A.A.C.），货号 51-935 (http://www.networkmedical.co.uk/ophthalmic_artificial_&lt;br /&gt;anterior_chamber.html)</td><td></td></tr><tr><td>组织保存与营养液&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>AL.CHI.MI.A. Srl，Viale Austria 14，35020 - Ponte S. Nicol&amp;ograve; - PD&lt;br/&gt; &amp;nbsp;意大利</td><td>Carry-C 培养基，用于角膜脱水及室温下运输，12 × 50 ml (http://www.alchimiasrl.com/en/organ-culture-at-31&amp;deg;-c-eb/carry-c-eb)</td><td></td></tr></tbody></table>

一种“全激光”角膜内皮移植术

An &#8220;All-laser&#8221; Endothelial Transplant

“全激光”辅助内皮角膜移植术是一种采用飞秒激光在预定深度切割供体组织，并使用近红外二极管激光焊接角膜组织的手术方法。该技术可实现内皮角膜移植术的三个主要目标：精确控制供体组织的厚度、便于供体组织植入受体床，以及降低供体透镜移位的风险。供体角膜的厚度在手术室内通过光学相干断层扫描（OCT）进行测量，以准确设计供体组织的尺寸。使用飞秒激光对供体角膜进行切割。受体眼通过手工剥离Descemet膜完成准备。将供体内皮组织装入Busin注射器，其周边内侧用适当的发色团染色（吲哚菁绿水溶液），然后将其推入前房。移植组织被放置于最终且正确的位置后，从眼球外部诱导二极管激光焊接。该手术已在15例以上患者中实施，结果显示手术操作性能得到改善，视力恢复良好，且供体透镜移位事件减少。

提出采用“全激光”手术方法进行微创角膜移植。该手术操作简便（见图1）：与标准的内皮移植术相比，仅额外增加了测量角膜厚度、染色供体组织以及投照激光光线的步骤。所获得的优势远远超过手术时间延长数分钟的代价。术中光学相干断层扫描（OCT）用于测量供体角膜厚度，结合飞秒激光定制供体透镜的尺寸，可显著改善供体与受体界面的黏附性（见图2）。由此，手术可根据每位患者的个体需求和形态学特征进行个性化设计。激光焊接技术可实现供体与受体界面的即时闭合4。在标准技术中，由于供体组织的生物力学特性和位置限制，无法对其进行任何形式的缝合。常见的术后风险是供体透镜移位。在我们的经验中，接受治疗的15例患者均未发生供体角膜内皮移位。为实现这一目标，关键在于投照完整的环形光斑，覆盖供体与受体界面的外径。在临床试验初期，我们在部分患者中采用了半环形焊接路径。其中一位患有Fuchs角膜营养不良并伴有角膜缺损的患者出现了部分透镜移位（见图3）：仅在激光焊接区域观察到明显的界面黏附。因此，我们改进了操作方案，采用完整的环形光斑投照，取得了更优的效果。</...

提出了一种全激光角膜内皮移植手术方法。该手术技术基于使用飞秒激光制备供体组织，随后采用激光焊接技术将供体角膜内皮固定于正确位置。

“全激光”辅助内皮角膜移植术是一种使用飞秒激光对供体组织进行切割的手术，用于……

本操作的总体目标是进行一种完全采用激光的微创手术，以移植薄层角膜组织。该手术首先测量供体角膜，并使用飞秒激光将其切割。随后在受体角膜基质床制作切口，并去除后弹力层和内皮层，为植入供体组织做好准备。然后将供体瓣染色并置入最终位置。最后，使用激光焊接将供体角膜透镜与受体角膜连接。术后一天可观察到供体角膜内皮细胞的黏附。与现有标准方法相比，该技术的主要改进在于，采用激光进行瓣膜焊接可降低术后瓣膜移位的风险。该技术的应用意义延伸至角膜移植手术领域，因为激光焊接技术也已在神经外科和耳鼻喉科手术中得到研究。通常情况下，初次接触该方法的人员不会遇到困难，因为该操作非常易于实施。在手术室开始操作时，于室温下将供体角膜从其运输容器中取出，并将角膜保存液留置一旁。通过三通连接器将人工前房或 a a C 与装有角膜保存及营养液的注射器相连。将供体角膜的巩膜边缘置于可通入液体并能形成可变压力的人工前房上。然后用带有组织固定头的盖子覆盖角膜。接着使用加压环将固定器牢固固定。接下来，将连接至AAC的注射器用于维持前房内压力，用组织保存液填充前房，直至达到最佳压力。然后用手指关闭三通连接器。测试前房内的压力，并进行调整，直至达到正确的内部压力。为测量供体角膜的厚度，需将带有角膜的前房保持固定位置，并使用光学相干断层扫描（OCT）进行测量。在对其应用进行解释后，取全层OCT测量值以切割供体组织，首先进行全层切割或通过将切割深度设置为供体角膜最薄点减去95微米来完成切割。将脉冲能量设置在0.8至0.9微焦耳范围内。将直径设置为8.7毫米。将切向光斑间距设置为2微米，并将前侧切割的径向光斑间距设置为2微米。后侧切割深度设置为比前一次全层角膜切割深30微米。将脉冲能量设置为2.10微焦，后侧切割直径设置为8.6毫米。定位后侧的前部深度，并在全层或切口前方30微米处进行切割。将后部深度设置为900微米。将脉冲能量设置为2.10微焦耳。将直径设为8.3毫米，点间距设为2微米，层间距设为2微米。然后使用1.2毫米预校准刀片进行切割，为手术做准备。在2点钟方向通过2点钟位置的角膜缘旁切口进行穿刺。将前房维持器插入患者前房。然后使用30度穿刺刀，在六点钟位置做第二个角膜缘旁切口。使用预校准的2.0毫米刀片在12点钟位置制作2.00毫米的角膜切口。然后用专用钩针进行一个直径为8.2毫米的圆形后弹力层环形切开。将后弹力层膜和内皮从后部基质上剥离，并使用后弹力层钩将组织移除。为供体组织染色制备发色团时，将一毫克吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）粉末加入一个1.5毫升微量离心管中。然后加入九毫克无菌水，并放入金属搅拌子。手动混合ICG溶液以悬浮粉末。将供体角膜内皮置于推注器较宽的部分，内侧面与推注器表面接触。使用刮匙将染色剂四溶液滴加到供体角膜内皮的内侧面，使其均匀染成绿色。等待三分钟后，将内

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科研

JoVE Journal

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医学

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