斑马鱼胚胎中的微珠植入

以下实验的总体目标是利用微珠植入技术，在斑马鱼胚胎发育的特定时空点上，对局部组织环境进行干预和改变。该方法首先通过制备微珠植入用托盘，以辅助微珠的精确操作与植入；第二步，将斑马鱼卵孵化至所需发育阶段。

随后将微珠制备于适当的实验溶液中，并小心地转移至胚胎内的目标位置。最终，微珠植入可在不干扰斑马鱼正常发育的情况下完成，从而能够评估目标分子对斑马鱼胚胎发育的影响。该方法有助于回答发育生物学领域的一些关键问题，例如不同分子如何影响器官发生过程？

通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为操作磁珠需要经过练习才能熟练掌握。首先，将新配制的2%aro溶液加热90秒，以制备磁珠植入托盘。在250毫升锥形瓶中，每隔30秒轻轻摇晃一次锥形瓶，以防止凝胶沸腾溢出。

接下来，将一个60 mm × 15 mm培养皿的皿盖内面朝上放入一个150 mm × 15 mm的培养皿中。然后用食指固定较小培养皿的皿盖，将热的琼脂凝胶倒入较大的培养皿中。

待琼脂糖冷却时，在较小的盖子下方形成一层薄薄的凝胶层，以防止冷凝水形成，并使珠子在显微镜下更易观察。但在其完全凝固前，缓慢倾斜地将孔模插入凝胶顶部，以便于后续更方便地放置胚胎。当凝胶完全凝固后，使用微型刮铲小心移除孔模。

然后向培养皿中加入E3溶液，并在4°C下保存。为了收集斑马鱼胚胎，先用系统水充满交配室。随后将隔离板置于交配室中央，并将成年雄性和雌性斑马鱼分别放入交配室的相应两侧。

次日早晨，使用细密的金属网筛收集受精卵。将网筛倒置放入一个洁净的10厘米培养皿中，用细流的E3溶液冲洗网筛，直至网筛上无残留卵粒，且培养皿中约有25毫升E3溶液。随后将卵分装至多个培养皿中，每皿50至60枚卵，以避免密度过高。将卵在28.5°C的E3溶液中孵育。在植入微珠前，需根据实验要求，将卵置于适当体积的待测分子溶液或对照溶剂中，孵育相应的时间。

然后当胚胎发育至所需的时间点时，用精细镊子去除其绒毛膜，并将斑马鱼胚胎置于含抗生素的过滤林格溶液中孵育10分钟，同时使胚胎适应环境。将微珠转移至此前准备好的、位于植入盘内的微珠板中，并用林格溶液冲洗微珠10分钟。

在清洗珠子后50分钟内，将植入托盘孔中的胚胎逐个取出，使微珠植入区域暴露以便操作。使用钨针在胚胎上做一个小切口，然后按压微毛细移液管的吸 bulb，轻轻将微珠吸入毛细管柱内，再释放压力，将微珠排出至植入托盘中，以便更方便地操作微珠。轻柔推动微珠，使其沉入模具内的林格溶液中。

然后使用微针将微珠移至胚胎上并进入切口内。最后，利用纤毛工具将微珠从切口处移开，以防止愈合过程中微珠被排出。通过体视显微镜可立即评估微珠植入是否成功，因为微珠将稳定地停留在组织内。

在本实验中，将两种不同大小的微珠单独用林格液冲洗后，植入斑马鱼胚胎的尾芽期，或在某些肌发生过程中的较晚时间点植入，以确保在整个实验过程中，由于内源性组织形态发生，微珠位置未发生偏移。可通过连续时间摄影观察胚胎样本，或按周期检查，如图所示进行微珠植入。在无任何偶联的情况下，小分子可在正常发育过程中实现，且不会产生明显的形态学影响，即 SPR 斑马鱼胚胎。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如整体安装组织染色）来研究微珠对基因表达的影响。总体而言，了解微珠在不同时间点的位置对于结果的解读至关重要，例如评估小分子对特定靶组织或发育过程的作用效果。