微珠植入斑马鱼胚胎
2015年7月30日
斑马鱼是遗传和发育研究的优秀模型系统。珠子植入是一种有价值的组织作技术，可用于通过引入局部细胞环境的改变来询问发育机制。该协议描述了如何在斑马鱼胚胎中进行微珠植入。
以下实验的总体目标是在斑马鱼胚胎发生过程中使用微珠植入在特定空间和时间点引入局部组织环境的改变。这是通过首先准备微珠植入托盘来实现的，以促进微珠的精确处理和植入。作为第二步，斑马鱼卵被孵化到所需的发育阶段。
然后在适当的实验溶液中制备微珠，并小心地转移到胚胎内的所需位置。最终，可以在不破坏正常斑马鱼发育的情况下进行微珠植入，从而可以评估目标分子对斑马鱼胚胎发生的影响。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，例如不同的分子如何影响器官发生过程？
一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为需要练习才能熟练处理微珠。要准备微珠植入托盘，首先将新鲜制备的 2%aro 溶液加热 90 秒。在 250 mL 锥形瓶中，每 30 秒旋转一次培养瓶，以防止凝胶起泡。
接下来，将 60 x 15 毫米培养皿的盖子放入 150 x 15 毫米的培养皿中，盖子内部朝上。然后用食指固定较小的培养皿的盖子。将热的 aros 凝胶倒入较大的盘子中。
在较小的盖子下方形成一层薄薄的 agros，以防止形成冷凝水，并使 agros 冷却时在显微镜下更容易看到珠子。但在凝固之前，将孔模具慢慢倾斜到凝胶顶部，以便更容易放置胚胎。当凝胶凝固后，使用微刮刀小心地去除孔模。
然后将 E 三溶液加入培养皿中，并在 4 摄氏度下储存。要收获斑马鱼胚胎，请用系统水填充交配室。然后在腔室中间放置一个隔板，将成年雄性和雌性斑马鱼添加到腔室的相应侧面。
第二天早上，使用细金属丝网过滤器收集受精卵。在干净的 10 厘米培养皿内将过滤器倒置，然后用细流 E 3 冲洗网孔，直到过滤器中没有鸡蛋，培养皿中大约有 25 毫升 E 3 溶液。然后将鸡蛋以每皿 50 至 60 个鸡蛋的价格分装在几个培养皿中，以避免过度拥挤，并在 28.5 摄氏度的 E 三溶液中孵育鸡蛋，然后植入微珠，将它们在适当体积的测试、目标分子或对照载体中孵育适当的时间。
然后，当胚胎达到所需的发育时间点时，使用细镊子去除它们的 kons，并在过滤的林格溶液中孵育斑马鱼。在胚胎适应期间补充抗生素 10 分钟。将微珠转移到先前制备的微珠板中，嵌入植入托盘内，然后冲洗微珠和林格溶液 10 分钟。
在洗涤后的 50 分钟内，微珠在植入托盘的孔内一次排列一个胚胎，以便可以接触到微珠植入区域。使用钨针在胚胎上做一个小切口，然后按下微珠移液管的球，轻轻地将微珠拉入毛细管柱并释放压力，将微珠输送到植入托盘中，使微珠更易于处理。轻轻推动珠子，使其沉入模具内的林格溶液中。
然后使用微针将微珠移动到胚胎上并进入切口。最后，使用晶须工具将微珠从切口部位移开，这样微珠在愈合时不会被排出。然后可以通过体视显微镜立即评估微珠植入的成功与否，因为微珠将保持稳定定位在组织内。
在这个实验中，在尾芽阶段或某些肌生成过程中的后期时间点，将两种不同大小的单个微珠单独用林格溶液冲洗注入斑马鱼胚胎中，以确保珠子位置在实验期间没有因内源性组织而移动。形态发生。胚胎样本可以通过终生过程摄影进行可视化，或者在图像显示微珠植入时定期检查。在没有任何共轭的情况下，可以在 SPR 鱼胚胎 U 的正常发育过程中实现小分子而不会产生粗略的形态影响。
按照此程序，可以执行其他方法，如 Whole Mount Institute hyper 来研究微珠如何影响基因表达。总体而言，了解磁珠随时间推移的位置对于解释结果至关重要，例如评估小分子对靶组织或发育过程的影响。
概述
本文介绍了一种在斑马鱼胚胎中植入微珠的协议，这是一种用于研究发育生物学的有用技术。该方法允许研究人员在不干扰正常发育的情况下操纵局部组织环境。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 遗传学
- 胚胎学
背景
- 斑马鱼是遗传学研究的宝贵模型生物。
- 微珠植入可以改变局部细胞环境。
- 这种技术有助于理解发育机制。
- 它允许评估分子对器官形成的影响。
研究目的
- 在斑马鱼胚胎发生过程中引入组织环境的改变。
- 评估特定分子对发育过程的影响。
- 改进微珠植入技术以获得更好的实验结果。
使用的方法
- 准备微珠植入托盘。
- 将斑马鱼胚胎孵化到所需的发育阶段。
- 使用钨针小心地将微珠植入胚胎。
- 观察微珠的稳定性和对发育的影响。
主要结果
- 成功植入微珠而不干扰正常发育。
- 微珠在组织中保持稳定的位置。
- 胚胎的视觉评估显示没有粗大的形态学影响。
- 有可能进行进一步的基因表达和发育过程研究。
结论
- 微珠植入是研究发育生物学的可行方法。
- 了解珠子的位置对解释实验结果至关重要。
- 这种技术可以促进研究各种分子对发育的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Microbead implantation in zebrafish embryos enables precise spatiotemporal manipulation of signaling molecules to interrogate developmental pathways. This approach supports target validation by allowing functional assessment of molecular effects on organogenesis without gross morphological disruption. The method provides a disease-relevant system for mechanistic de-risking in early discovery, particularly for pathways conserved between zebrafish and humans.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by altering local tissue environments with secreted peptides or signaling molecules of interest.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of bead stability and phenotypic effects using stereo microscopy.
- Predictive Value: Facilitates assessment of molecular impact on developmental processes, aiding in target confidence and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream analysis such as whole mount in situ hybridization to study gene expression changes.
- Quantitative Output: Allows visualization of bead positioning over time, enabling correlation of molecular exposure with developmental outcomes.
- Scalability: Embryos can be incubated in multi-well formats and incubated with test molecules prior to implantation, supporting medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Leverages high genomic conservation between zebrafish and humans to model vertebrate developmental processes.
- Translational Continuity: Connects discovery-stage pathway modulation to phenotypic outcomes relevant to congenital disorders or regenerative medicine.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of whether observed effects are due to specific molecular activity rather than developmental toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through phenotypic screening to preclinical assessment, particularly for pathways governing morphogenesis and organogenesis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling localized delivery of molecules to specific embryonic regions at defined stages.
- Screening: Describes preparation of embryos in test molecule solutions prior to implantation, enabling compound exposure assessment.
- Analytics: Relies on stereo microscopy and time-lapse imaging to track bead position and developmental progression as key readouts.
- Translational Research: Connects molecular perturbation in embryos to downstream gene expression analysis, supporting biomarker-aligned pathway validation.
- Enterprise Reuse: Implantation tray and microsurgical tools can be standardized across projects studying different morphogens or genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into pathway modulation by enabling precise spatial and temporal control of molecular presentation.
- Operational Value: Standardized tray preparation and bead handling protocols improve reproducibility across users and laboratories.
- Strategic Value: Reduces ambiguity in target validation by decoupling molecular effects from systemic toxicity or developmental delay.
- Portfolio Impact: Enables early go/no-go decisions based on whether a molecule perturbs a pathway of interest in a vertebrate context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery and zebrafish embryology to handle embryos and implant beads without causing lethal damage.
- Dependent on instrumentation including tungsten needles, microcapillary pipettes, and stereo microscopes for precise bead manipulation.
- Necessitates standardization of embryo staging, bead size, and solution conditions to ensure comparability across experiments.
- Adaptation across model systems may be limited by the optical accessibility and external development unique to zebrafish embryos.
- Practical limitations include the learning curve for bead handling and the need to validate that implanted molecules remain bioactive and localized.
