Name: 微珠植入斑马鱼胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 学习微珠植入技术，在斑马鱼胚胎发育过程中局部改变组织环境，研究分子对器官发生的影响。该方法可在不干扰正常发育的情况下评估基因功能，为发育生物学研究提供可靠手段。

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本工作得到了NIH资助项目DP2OD008470的支持。&#160;

本方案中所述的斑马鱼胚胎操作程序已获得圣母大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 林格氏液的配制
<ol>
	<li>配制含有116 mM NaCl、2.9 mM KCl、3.6 mM CaCl₂的溶液2，以及含超纯水的 5 mM Hepes2O，通过持续搅拌避免任何盐析出。</li>
	<li>加入盐后，在溶液持续搅拌的同时，每毫升加入100单位青霉素和100 µg链霉素。</li>
	<li>添加所有抗生素和盐后，对溶液进行过滤除菌，并储存于无菌容器中。 
	注意：可在林格氏液中添加N-苯基硫脲（1-苯基-2-硫脲，PTU），以阻断珠植入胚胎中的色素形成，且不会对胚胎健康产生不良影响。配制含色素抑制剂的林格氏液时，PTU浓度应为0.003%。由于PTU添加量极低，建议配制较大体积的林格氏液（至少1 L），以避免称量过少的PTU粉末。在步骤1.2中溶液搅拌时加入PTU。</li>
</ol>
2. 三卡因溶液的配制
<ol>
	<li>每升溶液中加入 2 g 三卡因甲磺酸盐（Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt, Tricaine）以及 0.1 M Tris（使用超纯 H2O 配制、pH 平衡至 9.5 的 1 M 储存液）。 
	注意：三卡因（Tricaine）将用于在预定时间点处死斑马鱼胚胎，以便检测珠植入表型。</li>
</ol>
3. E3 溶液的配制
<ol>
	<li>在1 L超纯水中加入0.25 M NaCl、10 mM KCl、12.5 mM CaCl2和16.6 mM MgSO4，配制成1 L E3溶液。</li>
	<li>向E3溶液中加入200 µl亚甲蓝，以抑制真菌生长。</li>
</ol>
4. 拉制用于微珠转移的玻璃针
<ol>
	<li>使用带丝的火焰抛光硼硅酸盐玻璃，外径：1.0 mm，内径：0.5 mm，长度为 10 cm。</li>
	<li>将硼硅酸盐玻璃放入微电极拉制仪中，以制备精细针头。 
	注意：以下四个参数可作为拉制针头的起始条件：加热温度 = 540，拉力 = 245，速度 = 200，时间 = 125。</li>
	<li>拉制足够数量的针头后，将其存放于带盖的塑料培养皿中，并置于黏土条或胶带条上固定，以防止针尖断裂，待后续使用。</li>
	<li>为将针尖修剪至所需的孔径大小，可用一对精细镊子在针头末端进行划痕处理。 
	注意：针头孔径大小应根据所用微珠的尺寸及操作者的使用习惯进行调整。若使用 50–100 µm 的微珠，建议初始孔径范围设定在 100–200 µm 之间。</li>
	<li>使用前，将修剪好的针头插入毛细管固定夹中，组装成完整的微珠转移装置。</li>
</ol>
5. 胡须/睫毛工具制备
<ol>
	<li>取一根胡须、睫毛或其他细小但具有一定硬度的天然或合成毛发纤维。在纤维基部以45°角剪断。使用永久性透明胶水将毛发纤维粘附在P-1000微量移液器吸头的尖端。</li>
</ol>
6. 微珠植入托盘的制备
<ol>
	<li>将 2 g 琼脂糖与 100 ml E3 溶液混合，制备 2% 的 E3 琼脂糖凝胶。</li>
	<li>将 2% 琼脂糖溶液置于 250 ml 锥形瓶中，加热 1 分 30 秒，每隔 30 秒轻轻旋转锥形瓶，以防止凝胶沸腾溢出。</li>
	<li>取一个 60 mm × 15 mm 培养皿的皿盖，将其内面朝上放入一个较大的 150 mm × 15 mm 培养皿中。</li>
	<li>将热的琼脂糖凝胶倒入 150 mm × 15 mm 培养皿中，注意用食指固定小培养皿的皿盖。 
	注意：确保小培养皿皿盖下方形成一层薄薄的琼脂糖，以消除凝胶倒入时产生的冷凝水；这将使在解剖显微镜下更容易观察到样品。</li>
	<li>在琼脂糖冷却但尚未完全凝固时，将点样孔模具放置于凝胶表面，以便后续更方便地放置胚胎。</li>
	<li>注意：为避免点样孔内产生气泡，应缓慢倾斜地将模具放置于凝胶表面，直至其漂浮在凝胶上。</li>
	<li>待凝胶完全凝固后，使用微型刮铲小心移除点样孔模具。加入 E3 溶液，并于 4 °C 保存。</li>
</ol>
7. 胚胎收集
<ol>
	<li>通过向交配室中加入系统用水并用隔板分隔，然后将成年斑马鱼雄鱼和雌鱼配对放入交配室中过夜。</li>
	<li>使用细金属网筛收集受精卵（胚胎发育阶段会略有差异）。</li>
	<li>将筛子倒置，用细流E3培养液冲洗，直至筛子中无残留卵粒，并将受精卵转移至洁净的直径10 cm的培养皿中，使培养皿中E3溶液体积约为25 ml。</li>
	<li>收集后，将卵分装至多个培养皿中（每皿约50–60枚卵），以避免过度拥挤，防止同一批次胚胎发育不同步，从而便于在目标时间点准确收集样本。</li>
	<li>将胚胎置于28.5 °C的E3溶液中孵育，以便根据标准斑马鱼发育分期系列进行发育评估40。 
	注意：若后续操作在较晚阶段进行且需要良好的光学透明度，应在受精后24小时（hpf）将胚胎转移至含PTU的E3溶液（E3/PTU）中，以抑制色素形成。</li>
</ol>
8. 微珠植入
<ol>
	<li>将微珠在适当体积的所需测试分子浓度溶液或相应的溶剂溶液中孵育所需时间。 
	注意：研究人员可使用直径为3-6 cm的无菌培养皿或多孔板，两者均能便于观察溶液中的微珠。孵育时间可能因目标分子的类型和用量而异，研究人员应参考制造商或已发表文献的建议，确定孵育时长以及其他因素（如对光和温度的敏感性）。</li>
	<li>当胚胎达到所需的发育时间点后，使用精细镊子将胚胎从绒毛膜中取出。</li>
	<li>将胚胎在含抗生素的过滤林格溶液中孵育10分钟，使其适应该溶液环境。</li>
	<li>在胚胎适应过程中，将微珠转移至植入托盘内的微珠板中，并用林格溶液冲洗10分钟。 
	注意：在此步骤完成后50分钟内完成微珠植入。这将降低植入微珠中目标分子浓度不足的风险。</li>
	<li>将胚胎排列至微珠植入托盘的孔中，注意调整其方向，使微珠拟植入的目标区域易于接触。</li>
	<li>使用钨针在胚胎上制造一个小切口。</li>
	<li>使用微毛细移液管将微珠转移至胚胎上：按压移液管的橡胶球，轻柔地将微珠吸入毛细管柱内，然后释放压力，将微珠转移至目标位置。</li>
	<li>使用纤毛/睫毛工具将微珠定位至胚胎内部组织中。注意：务必确保微珠被置于远离切口部位的组织内，以防止胚胎愈合过程中将微珠排出。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

在过去的一个世纪中，人们对身体结构模式形成和器官发生过程的理解取得了巨大的进展。组织操作技术在揭示这些重要过程的关键信息方面发挥了至关重要的作用。基因修饰是确定基因功能最常用的方法之一，而嵌合体分析方法（如细胞移植）则为理解基因功能的自主性提供了有效的研究途径。微珠植入技术为探究特定分子如何改变发育动态提供了另一种手段，该方法通过引入信号分子或抑制剂来改变局部组织环境。目前市面上有多种不同类型的微珠可供选择，其尺寸和其他物理特性各不相同例如， 电荷），以便在特定实验条件下使用。因此，通过将浸泡过目标蛋白质或化学物质的微珠植入生物体内，研究人员可以研究发育过程中局部效应，并探索目标基因或分子与特定生物学表型之间的关联。
Wada 及其同事开展的研究利用微珠植入技术，评估了Hedgehog信号通路增强对斑马鱼前脑神经颅（ANC）骨骼模式形成的影响 23先前的研究表明 Shh 是中性粒细胞胞外诱捕网（ANC）形成所必需的 14利用Shh包被的微珠，研究人员发现该信号可促进前神经嵴（ANC）中的软骨形成。通过微珠植入技术，证实了Hedgehog信号通路与ANC中软骨形成之间的明确关联。在斑马鱼中，该组织操作技术的另一个关键应用实例见于相关研究，科学家在这些研究中探讨了成纤维细胞生长因子（Fgf）信号通路在斑马鱼早期脑发育过程中对ETS结构域转录因子Erm（ETS相关分子）和Pea3（多瘤病毒增强子激活因子3）的转录调控作用。 19通过微珠植入实验，他们能够证明Fgf8和Fgf3可在异位激活表达 erm 和 pea3这些实例说明了微珠在揭示组织形成过程中协同作用的发育机制方面的实用性，而这些机制可通过基因表达分析方法进行充分表征。 41因此，微珠移植可作为一种有效的方法用于探索其他组织，例如生成肾脏的中间中胚层（IM）。具体而言，该方法将有助于肾脏发育研究，以探究不同分子如何影响肾单位的分段。 42 和管状形成 43,44，这些过程目前仅被初步了解。此外，微珠植入已开始被用于研究斑马鱼的再生过程 29] 并可适用于多种器官再生模型，例如在激光消融胚胎组织（如肾单位）后的研究 45 或与已制定的用于对相应成体结构进行研究的方法结合使用 46-49最后，微珠植入技术有望被用于人类疾病模型，例如癌症模型。 50,51 或组织退化 52,53.
在本实验方案中，我们展示了在斑马鱼胚胎中植入微珠的方法。尽管其他研究人员也曾类似地描述过该方法，但尚未通过视频形式展示1。经过少量练习后，我们能够以每小时约8–10个胚胎的速度进行微珠植入，表明研究者在具备一定经验后，该操作具有良好的可行性。本文展示的结果表明，不同尺寸的微珠均可在胚胎发育早期阶段成功植入，并且只要操作谨慎，这种组织操作技术对胚胎造成的物理干扰极小。需要特别强调的一项改进是使用毛发/睫毛工具将微珠定位至胚胎内。这种相对廉价且简单的工具直径与微珠相近，易于获取，并有助于加快植入过程。可根据研究者的操作熟练程度和个人偏好，将毛发/睫毛剪裁至合适长度，制成坚固而精细的微珠操作工具。最后，尽管本文详细描述了如何对微珠和斑马鱼胚胎进行物理操作以完成植入，但并未具体说明针对不同药物或肽类物质的处理流程。通常情况下，经化学处理的微珠应尽快植入动物体内，以避免对机体其他部位产生非预期效应；此外，研究者在开展研究前应充分了解所用化学物质可能带来的安全风险。
总之，我们展示了一种相对简单且高效的微珠植入方法，该方法使用实验室中 readily available 的材料，具有广泛的应用前景。最终，我们希望本操作指南能够帮助研究人员更好地应对斑马鱼组织操作中的精细特性。

发育生物学研究人员利用多种细胞、分子和遗传学方法，揭示控制生物体形成过程的机制。在这些方法中，组织操作是解析细胞命运、细胞迁移以及组织结构等复杂问题的关键工具。其中一种改变局部组织环境的方法是通过手术方式植入经处理的微珠，以提供局灶性的蛋白质或其他信号分子来源1。这类实验操作已在经典的脊椎动物胚胎学模型（如青蛙和鸡）中广泛应用2。
斑马鱼已成为研究器官发生的重要的脊椎动物模型生物，并且在疾病建模方面也具有诸多独特优势3-5，因为其与人类具有高度的基因保守性6。特别是，斑马鱼胚胎的光学透明性和体外发育特性为观察组织发生过程提供了无与伦比的视角3-5。大规模正向遗传筛选技术的应用已建立起一个强大的斑马鱼突变品系资源库，可供进一步研究7,8，同时已开发出可在单个实验室中以较小规模高效实施的替代筛选技术9,10。此外，转基因技术与反向遗传学方法的进步11,12以及化学遗传学的发展13-15，进一步推动了斑马鱼的实验研究。
组织操作技术，例如微珠的应用，&#160;在斑马鱼中的应用尚不广泛，但这些方法仍为深入理解发育过程中细胞信号传导提供了有用的工具。微珠植入技术已被用于研究斑马鱼视网膜器官形成过程 16,17心脏 18, 脑 19-22，神经嵴 23，以及鳍 24,25在这些及其他研究中，研究人员在发育过程中使用微珠以探究信号分子的扩散情况 26，梯度如何影响细胞迁移 27 和轴向模式形成 28近年来，微珠已被用于评估成年斑马鱼的再生机制 29在发育生物学研究中，例如，通过研究斑马鱼胸鳍的形成，微珠实验为肢体发育机制提供了重要见解 25斑马鱼的胸鳍芽与小鼠的前肢芽同源 30 和鸡胚 31脊椎动物肢体芽具有两个关键的信号中心：建立前后轴的极化活性区（ZPA），其通过表达 Sonic hedgehog (Shh 和下游 Hox 基因靶点，以及位于肢芽顶端的顶外胚层脊（AER），后者通过表达成纤维细胞生长因子来建立肢体的近端至远端身份 (Fgfs. 通过将含有 Fgf 的微珠植入斑马鱼 Shh 基因突变体, 研究人员发现Fgf对脊椎动物肢体细胞周期的进程和生长至关重要 25此外，除了 Fgf 和 Shh 建立位置身份的信号级联通路，利用鸡胚肢芽进行的开创性研究发现，视黄酸（RA）是一种能够模拟极化区作用的分子 &#160;建立前后身份 32这些实验通过将浸有视黄酸的Whatman滤纸小条植入鸡胚肢芽，以评估趾的模式形成 32此外，研究人员利用微珠、细胞移植和外源性视黄酸（RA）处理等方法在斑马鱼中开展了其他精巧的研究，以确定RA在斑马鱼后脑和中胚层中发挥长距离位置信号的作用。 28然而，目前关于Fgf和RA等信号因子在脊椎动物发育多个方面所起的作用，仍有许多问题尚未解决。视黄酸（RA）作为形态发生素，其信号效应影响多种器官的发育 33，例如正在发育的心脏 34 以及肾祖细胞，其中视黄酸（RA）决定近端肾细胞类型的命运 35-39对这些主题的进一步理解&#160;可显著受益于利用组织操作和微珠植入技术的实验研究。
尽管与鸡胚等模型相比，在斑马鱼中进行的微珠植入研究较少，但已开展的相关研究提供了极具价值的信息。斑马鱼胚胎中基于微珠植入的研究之所以稀少，一个可能的原因是人们普遍认为，由于胚胎体积较小，存在较大的技术难度，从而阻碍了此类操作的成功实施。然而，通过练习并结合对操作技术的直观观察，斑马鱼胚胎的微珠植入技术是可以掌握的，因此可作为一种研究发育机制的有效手段。本文中，我们展示了将微珠精确植入斑马鱼胚胎的方法，该方法可用于开展多种关于组织形成和细胞形态发生的实验分析。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-苯基硫脲（PTU）</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 锥形瓶</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 一次性无菌培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm × 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm × 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 mm × 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Chemware 微型刮勺</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 微量移液器吸头</td><td>Fischer Scientific</td><td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>低温培养箱</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435</td><td></td></tr><tr><td>微珠（45-106 &amp;micro;m）</td><td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>微珠（45 &amp;micro;m）</td><td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖镊</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>钨针</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>毛细管固定架</td><td>Globe Scientific Inc.&amp;nbsp;</td><td>51674</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼胚胎中的微珠植入

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

斑马鱼已成为研究发育生物学和疾病的宝贵遗传模型系统。斑马鱼在基因组保守性以及细胞、分子和生理过程方面与其他脊椎动物（包括人类）具有高度相似性。在早期个体发育过程中，斑马鱼胚胎具有光学透明性，研究人员可利用简单的体视显微镜直接观察器官发生的动态过程。微珠植入是一种通过改变局部环境因子来实现组织操控的方法，该方法使研究人员能够在发育胚胎的特定空间和时间点检测多种目标信号分子（如分泌型肽类）的作用。本文详细描述了一种在斑马鱼早期发育阶段进行微珠操控与植入的实验方案。

在研究应用中，有多种操作工具可用于处理微珠（图1）。此外，可使用一种带有小型孔穴的简单琼脂糖模具来固定斑马鱼胚胎，这对于及时且高效地开展这些实验至关重要（图1）。微珠的植入可在特定的空间位置和时间阶段进行，从而使研究人员能够精确界定目标分子作用的特定时间窗口。
在此，将单个微珠植入斑马鱼胚胎的尾芽期或体节形成阶段的较晚时期（图3）。本方案演示中使用了两种不同大小的微珠，均仅用林格氏液冲洗（图3A、图3B 和 图3C）。在未结合任何小分子的情况下进行微珠植入，表明在斑马鱼胚胎正常发育过程中，微珠植入可实现且不会引起明显的形态学异常（图4）。
实验人员在将微珠移入位于胚胎顶部的钨针穿刺孔时可能会遇到操作困难。为了在微针将微珠放置到胚胎上后更好地操控微珠，可使用毛发/睫毛工具。该工具可采用自然脱落的猫或狗的胡须制作，尽管也可使用其他天然或合成的睫毛状纤维（图1）。使用钨针或胡须工具轻轻推动微珠，即可使其沉入模具中的任氏液内。一旦微珠沉入模具，如有需要，可使用钨针将其移动较长距离；当微珠到达胚胎顶部时，可使用钨针或胡须工具将其准确置入胚胎内部。通过体视显微镜观察可立即判断微珠植入是否成功，因为微珠将在组织中稳定停留。为评估微珠在实验过程中的位置变化，可对每个胚胎样本进行活体时间序列摄影成像，或在固定时间间隔进行检查（如图4所示），以确保微珠位置未因内源性组织形态发生而发生偏移。准确掌握微珠在时间进程中的位置对于结果的科学解读至关重要，例如评估小分子对特定靶组织或发育过程的影响。
采用上述步骤将为在特定时间和位置将微珠植入斑马鱼胚胎提供理想的环境。根据我们的经验，初次使用该微珠植入方案的研究人员通常经过约一周的练习后，即可掌握稳定地对斑马鱼胚胎进行外科微珠植入所需的技术。
<img alt="珠植入工具：微珠板、精细镊子、钨针、微量移液器、毛发工具。" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 微珠植入所用工具。（A）珠植入托盘（左侧，直径15 cm），包含胚胎模具（左侧）和微珠孵育托盘（右侧，直径6 cm）。该工作托盘可使研究人员将胚胎置于显微镜工作站下所需的方向，并将准备好的用于植入的微珠放置在附近。微珠应先在小分子化合物和/或溶剂中孵育，然后在另一个独立的微珠板（右侧）中冲洗，再转移至置于显微镜工作站下的珠植入托盘中。（B）两对精细镊子将用于去除每颗斑马鱼胚胎周围的卵膜，同时也可用于折断微毛细管针的末端。（C）钨针将用于在斑马鱼胚胎上制造极细微的穿刺孔，以便放置微珠。（D）微毛细管转移移液器将用于吸取并定位一颗微珠，将其置于斑马鱼胚胎表面靠近穿刺部位的位置。（E）毛发/睫毛工具可用于轻柔地将微珠推入先前由钨针制造的胚胎切口内。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼胚胎处理示意图；包括胚胎模具、微珠托盘、钨针工具。" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 微珠植入操作示意图。（A）在体视显微镜下设置微珠植入托盘，托盘内微珠浸没于所需洗涤液中，并将胚胎放置为组织面朝上。（B）使用钨针，通过轻微但有力的动作可在胚胎上制造一个小切口。（C）使用微毛细移液管，从托盘右侧的微珠孵育腔中吸取所需微珠，并转移至左侧的胚胎操作区域。应将微珠放置于切口附近，然后使用纤毛/睫毛工具将其轻柔地推入钨针所制造的切口内。当微珠被推进切口后，应将其向组织内部（远离切口方向）推入，以稳定固定微珠位置，防止在胚胎继续发育过程中微珠移出体外。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼胚胎发育、微珠植入效应、显微图像、尾芽期至7体节期。" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 微珠可在不同发育阶段植入胚胎中。（A）在尾芽期将微珠（直径约50 µm）植入斑马鱼胚胎的躯干部位。在微珠植入后24小时观察，胚胎发育正常，且微珠在发育过程中移动极小。（B）在3体节期（ss）将微珠（直径约50 µm）植入斑马鱼胚胎的卵黄囊内，胚胎发育正常，微珠随时间推移仅有轻微移动。（C）在7体节期胚胎中植入较大的微珠（直径约70 µm），其后续发育亦正常，且几乎未见微珠从植入部位发生移动。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎珠植入研究，显微镜图像，侧视图和背视图，发育时间点。" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 在珠植入后72小时（hpbi）内，微珠的存在未对斑马鱼胚胎的整体发育造成干扰。 在7体节期（ss），将浸泡过林格氏液（直径约50 µm）的微珠植入斑马鱼胚胎。每颗微珠均通过手术方式插入躯干区域，位于第3和第4体节之间。在珠植入后24小时（hpbi）、48 hpbi或72 hpbi时，均未观察到与微珠存在相关的明显发育缺陷。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

斑马鱼是进行遗传学和发育学研究的优良模式系统。珠植入是一种有价值的组织操作技术，可通过改变局部细胞环境来探究发育机制。本方案描述了如何在斑马鱼胚胎中进行微珠植入。

斑马鱼已成为研究发育生物学和疾病的宝贵遗传模型系统。斑马鱼在基因组水平上与人类具有高度相似性……

以下实验的总体目标是利用微珠植入技术，在斑马鱼胚胎发育的特定时空点上，对局部组织环境进行干预和改变。该方法首先通过制备微珠植入用托盘，以辅助微珠的精确操作与植入；第二步，将斑马鱼卵孵化至所需发育阶段。随后将微珠制备于适当的实验溶液中，并小心地转移至胚胎内的目标位置。最终，微珠植入可在不干扰斑马鱼正常发育的情况下完成，从而能够评估目标分子对斑马鱼胚胎发育的影响。该方法有助于回答发育生物学领域的一些关键问题，例如不同分子如何影响器官发生过程？通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为操作磁珠需要经过练习才能熟练掌握。首先，将新配制的2%aro溶液加热90秒，以制备磁珠植入托盘。在250毫升锥形瓶中，每隔30秒轻轻摇晃一次锥形瓶，以防止凝胶沸腾溢出。接下来，将一个60 mm × 15 mm培养皿的皿盖内面朝上放入一个150 mm × 15 mm的培养皿中。然后用食指固定较小培养皿的皿盖，将热的琼脂凝胶倒入较大的培养皿中。待琼脂糖冷却时，在较小的盖子下方形成一层薄薄的凝胶层，以防止冷凝水形成，并使珠子在显微镜下更易观察。但在其完全凝固前，缓慢倾斜地将孔模插入凝胶顶部，以便于后续更方便地放置胚胎。当凝胶完全凝固后，使用微型刮铲小心移除孔模。然后向培养皿中加入E3溶液，并在4°C下保存。为了收集斑马鱼胚胎，先用系统水充满交配室。随后将隔离板置于交配室中央，并将成年雄性和雌性斑马鱼分别放入交配室的相应两侧。次日早晨，使用细密的金属网筛收集受精卵。将网筛倒置放入一个洁净的10厘米培养皿中，用细流的E3溶液冲洗网筛，直至网筛上无残留卵粒，且培养皿中约有25毫升E3溶液。随后将卵分装至多个培养皿中，每皿50至60枚卵，以避免密度过高。将卵在28.5°C的E3溶液中孵育。在植入微珠前，需根据实验要求，将卵置于适当体积的待测分子溶液或对照溶剂中，孵育相应的时间。然后当胚胎发育至所需的时间点时，用精细镊子去除其绒毛膜，并将斑马鱼胚胎置于含抗生素的过滤林格溶液中孵育10分钟，同时使胚胎适应环境。将微珠转移至此前准备好的、位于植入盘内的微珠板中，并用林格溶液冲洗微珠10分钟。在清洗珠子后50分钟内，将植入托盘孔中的胚胎逐个取出，使微珠植入区域暴露以便操作。使用钨针在胚胎上做一个小切口，然后按压微毛细移液管的吸 bulb，轻轻将微珠吸入毛细管柱内，再释放压力，将微珠排出至植入托盘中，以便更方便地操作微珠。轻柔推动微珠，使其沉入模具内的林格溶液中。然后使用微针将微珠移至胚胎上并进入切口内。最后，利用纤毛工具将微珠从切口处移开，以防止愈合过程中微珠被排出。通过体视显微镜可立即评估微珠植入是否成功，因为微珠将稳定地停留在组织内。在本实验中，将两种不同大小的微珠单独用林格液冲洗后，植入斑马鱼胚胎的尾芽期，或在某些肌发生过程中的较晚时间点植入，以确保在整个实验过程中，由于内源性组织形态发生，微珠位置未发生偏移。可通过连续时间摄影观察胚胎样本，或按周期检查，如图所示进行微珠植入。在无任何偶联的情况下，小分子可在正常发育过程中实现，且不会产生明显的形态学影响，即 SPR 斑马鱼胚胎。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如整体安装组织染色）来研究微珠对基因表达的影响。总体而言，了解微珠在不同时间点的位置对于结果的解读至关重要，例如评估小分子对特定靶组织或发育过程的作用效果。

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

微珠植入斑马鱼胚胎

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斑马鱼胚胎中的微珠植入

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