用于在三维胶原基质中研究趋化性的平面梯度扩散系统

本实验的总体目标是构建一个平面梯度扩散室，用于在三维胶原基质中研究趋化性。该目标首先通过活细胞成像室制备三维硅胶模具来实现；第二步是制备亲水性和疏水性盖玻片，并利用它们组装三维硅胶模具。

接下来，将胶原-细胞混合物加入中心区域，并使其聚合。最后一步是在孵育后移除模具中的疏水性盖玻片，向一个储液池中加入普通培养基，向另一个储液池中加入含有趋化因子的培养基。最终，利用共聚焦显微镜随时间追踪细胞的趋化运动，并可视化观察细胞在胶原基质内的位移情况。

与现有的博因室和微运动技术相比，该技术的主要优势在于，它能够通过简单的扩散梯度，在三维空间中研究细胞迁移，且无需使用一次性移液枪。用量筒量取150 µL的氨基酸溶液A-P-T-M-S，倒入一个50 mL离心管中。然后用另一支一次性移液枪向管中加入30 mL的100%乙醇，并盖紧管盖。

涡旋振荡溶液两分钟，以确保充分混匀。然后将溶液倒入一个玻璃培养皿中，并放置一旁。接着，用新的一次性移液管向第二个培养皿中加入15毫升100%乙醇，并将该培养皿与第一个培养皿放在一起。

量取 30 毫升去离子水，将溶液倒入一个 50 毫升离心管中。接着，使用一支新的一次性移液器向管中加入 1.875 毫升戊二醛，并盖紧管盖。涡旋振荡溶液 2 分钟，然后将混合液倒入第三个培养皿中。

用镊子取出一个22毫米圆形玻璃盖玻片，用100%乙醇混合液冲洗两面。使用一次性移液管将冲洗后的玻璃盖玻片放入第一个含有氨丙基三乙氧基硅烷（amino seline）的培养皿中，并用镊子夹住，使其在溶液中静置5分钟。取出玻璃盖玻片，再次用100%乙醇冲洗。

然后将清洗过的玻璃盖玻片放入含有戊二醛的培养皿中，静置30分钟。30分钟后，用镊子取出玻璃盖玻片，并用去离子水冲洗。将冲洗后的盖玻片放置在纸巾上，于室温下过夜干燥。

为制备疏水性盖玻片，首先在50毫升离心管中加入500微升TTS、100微升乙酸和19.4毫升正庚烷，涡旋混匀2分钟。然后将溶液倒入玻璃培养皿中，用洁净的镊子夹取一片玻璃盖玻片放入已配制的溶液中，静置2分钟。2分钟后，用镊子取出盖玻片，使用一次性移液器以去离子水冲洗，将盖玻片置于纸巾上，并于室温下静置过夜使其自然干燥。

将干燥的盖玻片存放在塑料培养皿中，待需要时再取出使用。按照随附的文字版实验方案组装活细胞成像室。接下来，根据制造商的说明混合硅胶弹性体溶液，制备5 mL弹性体。然后使用一次性实验室刮刀缓慢地将硅胶弹性体溶液倒入活细胞成像室装置中，注意不要扰动模具组件。

将模具置于安全处，在室温下静置过夜。次日早晨，用镊子取出模具，并小心地将加工好的铝金属立方体从模具中取出。接着，前往水槽用去离子水冲洗模具，然后将模具放在纸巾上晾干。

干燥后，使用 hobby 工具刀在硅胶模具内部的每个纵向末端处切割间距为 2.34 毫米的切口。确保模具在使用前存放于安全干燥处。用 90% 乙醇冲洗模具，并将模具放入盛有去离子水的培养皿中，浸泡过夜。

第二天早晨，将模具转移至一张纸巾上，并在模具干燥的同时使其自然风干。使用高精度金刚石刻划工具，将亲水性盖玻片切割成两块矩形，尺寸略大于 3.95 毫米 × 5.99 毫米。

然后将每个切割好的矩形盖玻片插入硅胶模具的槽口中，将模具翻转至倒置状态，并使用一次性移液管在硅胶模具底部涂抹真空脂。接着，将模具重新翻转回正面朝上，将模具底部压在圆形亲水性玻璃盖玻片上。为形成密封，按所需浓度在15毫升离心管中配制培养基与趋化因子的混合液，用移液器吸取5毫升该混合液加入一个新的离心管中，另取5毫升普通培养基加入第二个离心管中。

将两个试管放入37摄氏度的水浴中。随后，用移液器将30微升10倍浓度的磷酸盐缓冲液（10× PBS）加入一个微量离心管中。向同一微量离心管中加入6微升1 mol/L的氢氧化钠溶液，并涡旋振荡15秒。

然后向一个微量离心管中加入18 µL黄色绿色荧光羧基修饰微球和168.3 µL冰上预冷的Ⅰ型大鼠尾胶原。涡旋混合30秒。

接下来，向微型离心管中加入77.7 µL所需细胞，细胞浓度为每毫升培养基含2×10⁶个细胞，并混匀。使用移液器吸头，将300 µL胶原-细胞混合物移入已准备好的模具组件的中心孔中，吹打20秒以混匀。

然后将模具放置于一次性培养皿上，并放入标准培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育20分钟。孵育结束后，用镊子夹住两张疏水性盖玻片的顶部，将其从模具上提起并移开。将整个系统转移至显微镜下，检查腔室以确保胶原模具的侧边仍然保持平直，从而在显微镜下维持一个平面的扩散梯度。向第一个孔中加入100微升细胞培养基。

接下来，将含有所需趋化剂浓度的100微升细胞培养基加入基质另一侧的孔中。根据随附文本方案中所述，以荧光标记的微球为参照追踪细胞迁移。此处展示的一系列图像显示了牛血清白蛋白（rumine）在1毫克/毫升胶原凝胶中扩散的过程。

此示例展示了系统真实的平面扩散梯度，任何引入的趋化因子也应表现出类似的梯度特征。在本示例中，通过红色方框标记的位置随时间测量了发光信号的强度。图中每条曲线分别表示这些位置处的浓度变化，在稳态条件下测量时，根据凝胶中的位置形成线性浓度梯度。

这种关系在一系列胶原基质浓度范围内均保持线性，使得该系统在细胞实验中非常有用。在本图像中，一个红色的中性粒细胞位于胶原基质内，基质中散布着荧光绿色的微球，用作位置参照。接下来的三幅图像显示了该中性粒细胞沿趋化因子梯度上行时的定向迁移，趋化因子梯度以白色箭头表示。

观看本视频后，您应能充分理解如何构建一个简单的扩散室，以研究细胞在三维胶原基质中的迁移行为。