Name: 平面梯度扩散系统的调查趋化三维胶原基质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习平面梯度扩散系统用于三维胶原基质中的细胞趋化性研究。该方法利用共聚焦显微镜追踪细胞运动，为发育生物学中的细胞迁移机制研究提供可靠平台。

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作者谨感谢 Jonathan Reichner 博士和 Angle Byrd 博士在细胞实验方面的指导。本研究工作由美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（GRFP）资助。

1. 3D 模具设计与部件
<ol>
	<li>模具制备
	<ol>
		<li>实验前准备硅胶弹性体试剂盒、活细胞成像室、22 mm 玻璃盖玻片，以及尺寸为 10.07 mm × 3.95 mm × 5.99 mm 的精密加工铝金属块。按照供应商说明，将盖玻片放入活细胞成像室的底座中，并组装其余部件，完成成像室的准备以用于模具制作。</li>
		<li>接着使用镊子将精密加工的铝金属块放置在活细胞成像室外壳中央、盖玻片上方，然后将其静置备用。</li>
		<li>根据制造商说明书混合硅胶弹性体溶液，制备 5 ml 弹性体。</li>
		<li>使用一次性实验铲将硅胶弹性体溶液倒入已组装好的活细胞成像室装置中，注意不要移动已放置的铝金属块。将该装置置于实验台安全位置，过夜（O/N）固化。</li>
		<li>次日早晨，按照制造商建议拆解活细胞成像室，并用镊子取出模具。用镊子小心地从模具中取出铝金属块。将模具移至水槽，用去离子水冲洗，随后将其置于纸巾上晾干。</li>
		<li>待模具完全干燥后，使用 hobby 用美工刀在硅胶模具内部沿纵向两端间隔 2.34 mm 切出切口。确保模具在干燥安全处保存，直至准备用于实验系统构建。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亲水性与疏水性玻璃盖玻片的制备
	<ol>
		<li>为使胶原基质能够附着于表面，需制备亲水性盖玻片：
		<ol>
			<li>使用一次性移液管量取 150 µl 3-氨丙基-三甲氧基硅烷，倒入 50 ml 离心管中。使用另一支一次性移液管向该 50 ml 管中加入 30 ml 100% 乙醇，盖紧管盖。涡旋混合 2 min，确保充分混匀。将溶液倒入玻璃培养皿中，静置备用。</li>
			<li>在第二个培养皿中倒入 15 ml 100% 乙醇，静置备用（务必标记各培养皿）。</li>
			<li>使用一支新的一次性移液管量取 30 ml 去离子水，倒入 50 ml 管中。再使用另一支新的移液管量取 1,875 µl 戊二醛，加入同一 50 ml 管中，盖紧管盖。涡旋混合 2 min，确保完全混匀。将混合液倒入第三个培养皿中，静置备用。</li>
			<li>使用镊子取出一片 22 mm 圆形玻璃盖玻片，用一次性移液管以 100% 乙醇混合液冲洗两面。</li>
			<li>将冲洗后的盖玻片放入含 3-氨丙基-三甲氧基硅烷与 30 ml 100% 乙醇的溶液培养皿中，浸泡 5 min。</li>
			<li>用镊子取出盖玻片，再次使用一次性移液管以 100% 乙醇溶液冲洗。</li>
			<li>将冲洗后的盖玻片浸入含 1,875 µl 戊二醛与 30 ml 去离子水的混合液中，静置 30 min。</li>
			<li>30 min 后，用镊子取出盖玻片，以去离子水冲洗，并置于干燥纸巾上，室温（RT）过夜（O/N）干燥。</li>
			<li>根据实验需要，使用相同配制的溶液重复上述盖玻片浸渍与转移操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照指定方案制备疏水性盖玻片。
		<ol>
			<li>在 50 ml 管中加入 500 µl 三氯氟辛基-1,1,2,2-四氢辛基、100 µl 乙酸和 19.4 ml 己烷，涡旋混合 2 min。将溶液倒入玻璃培养皿中，静置备用。</li>
			<li>使用洁净镊子取出一片盖玻片，浸入已配制的混合溶液中 2 min。2 min 后用镊子取出，使用一次性移液管以去离子水冲洗，置于干燥纸巾上，室温（RT）过夜（O/N）干燥。干燥后将盖玻片储存于塑料培养皿中，待用。</li>
			<li>根据实验需要，使用相同配制的溶液重复上述盖玻片浸渍与转移操作。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 模具组装
<ol>
	<li>使用模具前，用一次性移液管将90%乙醇在化学废液容器上方冲洗模具。随后，将模具放入盛有去离子水的培养皿中，静置过夜。</li>
	<li>用镊子将模具从溶液中取出，置于纸巾上晾干，然后开始模具组装。</li>
	<li>在模具晾干期间，使用高精度金刚石刻划工具将方形亲水盖玻片切割成略大于3.95 mm × 5.99 mm的两个矩形。将每个切割好的矩形盖玻片滑入硅胶模具的槽口中。</li>
	<li>将模具翻转倒置，用一次性移液管在硅胶模具底部涂抹真空脂。然后将模具翻回正面朝上，将模具底部压在圆形亲水玻璃盖玻片上，形成密封。</li>
	<li>戴上一次性手套，拿起组装好的模具，放入一次性培养皿中，再置于生物安全柜内。打开生物安全柜的紫外灯照射1小时，对模具进行灭菌，然后开始实验。</li>
</ol>
3. 胶原蛋白混合物与三维基质
<ol>
	<li>在制备胶原混合物之前，根据标准方案28对细胞进行染色并为成像做好准备。</li>
	<li>在生物安全柜中，使用标准实验室技术与方案29,30，将细胞培养基和趋化因子在15 ml离心管中混合至所需的趋化因子浓度。用移液器吸取5 ml特定浓度的细胞培养基-趋化因子混合液至另一15 ml离心管中，并将其放入预热的水浴中。</li>
	<li>使用移液器吸取5 ml纯细胞培养基至第二个15 ml离心管中，并置于加热的水浴中，以预热用于显微镜实验的溶液。</li>
	<li>在生物安全柜中，用移液器向微量离心管中加入30 µl 10x磷酸盐缓冲液（PBS），再向同一微量离心管中加入6 µl 1 N氢氧化钠（NaOH），并涡旋振荡15秒。</li>
	<li>从冰箱中取出大鼠尾部I型胶原溶液，并使用标准实验室技术与方案29转移至生物安全柜中。确保胶原保持低温状态。用移液器吸取168.3 µl胶原加入同一微量离心管中。</li>
	<li>接着，用移液器向同一微量离心管中加入18 µl黄色-绿色荧光羧基化修饰微球。将含有所有溶液的微量离心管涡旋振荡30秒。</li>
	<li>向微量离心管中加入77.7 µl所需浓度的细胞培养基-细胞混合液（约2 × 106 个细胞/ml），并用移液器头混合20秒。根据荧光微球添加和细胞活力调整的定制胶原混合方案（表1），按需调节基质密度。</li>
	<li>用移液器将300 µl胶原-细胞混合物加入已准备好的模具组件的中心孔（孔#2）中。将模具放置于一次性培养皿上，并转移至37 °C、5% CO2的标准培养箱中孵育20分钟。</li>
	<li>从培养箱中取出装置并放回生物安全柜中。使用镊子夹住每个疏水性盖玻片的顶部，向上并远离模具方向拔出，移除两个疏水性盖玻片。</li>
	<li>将整个装置转移至目标显微镜下进行成像，以确保胶原模具边缘仍保持直线，从而形成平面扩散梯度。</li>
	<li>在显微镜下操作，使用100 µl单通道移液器向孔#1中加入100 µl细胞培养基；随后，使用100 µl单通道移液器向孔#3中加入100 µl含有目标浓度趋化因子的细胞培养基。</li>
	<li>在向两个孔中加入溶液后，立即开始成像。</li>
</ol>
4. 成像与扩散建模
<ol>
	<li>若要查找特定胶原蛋白密度的扩散系数以计算特定浓度，请遵循以下方案：
	<ol>
		<li>按照上述标题为“胶原蛋白混合物与三维基质”的方案操作，不使用含有目标趋化因子浓度的细胞培养基，而是根据标准计算方法和方案，在15 ml离心管中配制5 µM的罗丹明溶液30。</li>
		<li>使用倒置显微镜搭载的共聚焦系统，并以氩离子激光器（488 nm）激发，对三维胶原基质进行荧光成像。每2至3秒采集一次图像，持续最长7小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩散建模：根据下方所示的数学模型，编写计算软件代码，按以下通用步骤进行数据处理与分析。 
	<img alt="扩散方程，C(x,t)=C1+(x/L)(C2-C1)+Σan*e^-n²π²α²t/L²*sin(nπx/L)，数学公式。" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1">
	<ol>
		<li>将图像导入计算软件，按最大强度进行重缩放和归一化处理。将图像转换为灰度图以确定边缘。选择穿过图像中心的轴线，以及位于中心右侧和左侧的轴线。</li>
		<li>利用计算软件代码，绘制归一化强度曲线，同时绘制真实强度曲线以及两者之间的差异。</li>
		<li>接下来，输入拟合所需参数（浓度、时间与长度）。</li>
		<li>绘制归一化浓度随时间变化的曲线，以及沿x轴的浓度分布曲线，并对数据进行多项式拟合。</li>
		<li>利用计算软件代码计算扩散系数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 实验测量
<ol>
	<li>参考扩散方程，重写方程以求得系统内任意位置处的特定浓度，如下所示。 
	<img alt="热扩散方程，瞬态分析，数学公式，科学计算" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 2"> 
	其中： 
	L = 胶原基质的长度 
	x = 待研究的位置 
	D = 扩散系数 
	t = 经过的时间</li>
	<li>在趋化实验过程中，务必记录趋化因子加入系统的具体时间。一旦观察到细胞迁移运动，应确保进行共聚焦延时成像记录，并注明成像发生时相对于边缘的具体时间和位置。</li>
	<li>在数据分析过程中，将记录的经过时间、位置以及特定细胞的扩散系数代入方程，以计算在扩散实验和细胞实验中胶原基质内任意点的归一化特定浓度。</li>
</ol>
6. 利用牵引力显微镜技术追踪细胞迁移
<ol>
	<li>使用 TFM/DVC 技术追踪细胞迁移，请遵循以下方案：
	<ol>
		<li>向 3 号孔中加入所需浓度的趋化因子后，启动倒置显微镜上配备的共聚焦系统对三维胶原基质进行成像，以寻找待研究的细胞。</li>
		<li>一旦发现移动中的细胞，将其置于视野中央，并利用压电马达（用于 Z 轴成像），每 1 或 2 分钟采集一次图像。</li>
		<li>为计算细胞产生的力和形变，编写计算程序，根据 TFM/DVC 方案31追踪荧光微珠的位移。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Leddy, H., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Molecular+Diffusion+in+Articular+Cartilage+Measured+using+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

成功进行有或无细胞的扩散实验最关键的步骤包括：正确组装模具；培养必要的手动技巧，以防止在取出疏水性盖玻片时造成损伤；确保找到一条非常理想的线性起始线，以准确计算扩散系数；正确计算胶原蛋白和趋化因子的实验浓度；正确使用活细胞成像系统，确保基质不会干燥；以及维持无菌、健康的细胞培养环境。
进行扩散实验时，必须确保扩散曲线符合传统线性扩散模型的形状（图4）。
在每个样品的不同x位置进行多次分析，可以计算出罗丹明在各种浓度胶原中的平均扩散系数，如表2所示。这些结果与先前的研究一致：随着胶原浓度降低，胶原凝胶的扩散系数减小，这是由于基质孔隙率增加所致。
根据稳态下的扩散模型方程，预期在 x 值方向上浓度呈线性分布。通过对各数据点拟合线性函数，可以看出它们实际上均呈线性关系。三种胶原蛋白浓度条件下最佳拟合直线的线性趋势线拟合 R2 值均达到或高于 0.92。所有外推图中残差的范数为 0.0227...

细胞向浓度梯度方向迁移的偏好行为，即趋化性，在机体的病理和生理过程中起着重要作用。例如皮肤和黏膜伤口愈合1、形态发生2、炎症反应3以及肿瘤生长4,5。研究还表明，癌细胞可通过单个细胞迁移和集体细胞迁移两种策略进行移动6。此外，扩散不稳定性机制可促使单个或成簇的细胞从肿瘤组织/物体中分离，并向营养源迁移，从而侵入更广泛的区域和组织7。
此外，由于黏附分子的作用不同，已在研究中发现多种迁移机制在二维（2D）和三维（3D）环境中均可发挥作用8。因此，转向具有生理相关性的体外（in vitro）检测方法，以可测量且简便的方式研究细胞运动性，对于理解细胞运动现象具有重要意义9。然而，由于细胞迁移分析存在困难，全面且可量化的趋化性检测通常需要依赖耗时且繁琐的方法，这些方法建立在无偏细胞运动性测量和物质输运现象模型的基础之上。
过去研究细胞趋化性的实验方法包括Boyden小室10和琼脂糖下趋化试验11。然而，在这些早期实验中，细胞迁移实验并未对细胞运动的时间过程进行监测。更重要的是，实验所使用的浓度梯度并不明确或未被充分理解，且信号维持时间通常不超过数小时。此外，早期的趋化性小室实验将细胞迁移限制在二维空间内，无法监测迁移的动力学过程12。以Boyden小室为例，其终点检测法无法使研究者直观观察细胞迁移过程，也不能直接区分趋化性（定向运动）与趋化激活性（随机运动）。此外，多种变量——如膜孔径大小和膜厚度的差异——使得该装置难以重复使用，并掩盖了细胞对趋化因子的迁移反应13,14。
随着对微流控技术的新认识，研究人员已探索了新型腔室和微装置，用于在间质流条件或趋化作用下研究细胞运动15,16。在这些新型装置中，引入并研究了新的细胞参数，例如剪切应力对细胞的影响17,18。然而，以往和当前的微流控趋化腔室将细胞迁移研究局限于二维基底，这是一个重要的局限，因为许多生物过程（包括肿瘤细胞侵袭与转移以及免疫细胞迁移）均涉及三维迁移。
已有研究报道了直接观察室——其中趋化因子溶液与含有细胞的三维凝胶直接接触19,20。这类观察室包含两个并列的腔室，一个含有趋化因子，另一个含有细胞，两者在水平方向上并排连接21，或呈同心环状排列22。这些系统的设计方向正确，但无法长时间维持趋化迁移系统的稳定状态。
此外，研究人员还研究了透析池中胶原膜的扩散性，以及在静水压力作用下示踪分子在胶原样品中的扩散过程23-25。一些在胶原凝胶中进行的扩散实验依赖于利用磁场和化学掺杂对凝胶进行物理和化学修饰26。一种常用的模拟胶原组织中扩散性的方法是连续点光漂白荧光成像法。该方法揭示了在取向胶原组织中大分子扩散系数的各向异性。然而，光漂白技术此前仅应用于关节软骨，而未用于胶原基质。尽管两者相似，但仍需针对胶原凝胶的扩散系数开展专门的建模实验。更重要的是，现有系统并未采用可测量细胞力生成的方法。
遗憾的是，大多数系统似乎缺少理想系统所需的某些关键要素：无法实现细胞追踪，难以理解趋化因子通过基质形成的扩散梯度，缺乏相对简单且易于重复的设置，难以最小化细胞间相互作用，以及无法测量具有量化意义的空间维度参数。即、速度、力、比浓度）。Moghe 等27 提出了一种满足其中大部分要求的系统，该系统最初将细胞分散在凝胶中，而非集中在滤膜表面，但难以测量细胞产生的力。
为此，我们介绍一种平面梯度扩散系统，用于在三维胶原基质中研究趋化性，该系统能够克服现有基于延时显微镜并结合图像分析技术以测量三维环境中细胞受力的检测方法中扩散室的现代局限性。本方案提供了一种简单而创新的方法，用于构建可研究不同细胞三维趋化性的简易三维扩散室。

<table><tbody><tr><td>硅酮弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning Corp</td><td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td><td>双组分混合物，混合比例为10:1</td></tr><tr><td>活细胞成像腔室</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CM-B18-1</td><td>适用于18&amp;nbsp;mm圆形盖玻片的CMB</td></tr><tr><td>22&amp;nbsp;mm玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0180281</td><td>Neuvitro Corp. 盖玻片 22&amp;nbsp;mm 1.5</td></tr><tr><td>机加工铝金属立方体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> hobby 用途刀具</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3-(氨基丙基)三甲氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>戊二醛，电镜级，8%</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>标准落地式和台式离心机</td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>可重复使用培养皿：完整型（60 x 15&amp;nbsp;mm）</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td>尖头镊子</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-105A</td><td>矩形；30 x 22&amp;nbsp;mm；厚度1号</td></tr><tr><td>十三氟-1,1,2,2-四氢辛基</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>乙酸ACS试剂，&amp;ge;99.7%</td></tr><tr><td>己烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>无水，95%</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof，适用于分子生物学</td></tr><tr><td>高精度金刚石划线工具</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>直头延长尖划针，直径.020&quot;（.50&amp;nbsp;mm），尖端长度.200&quot;（5.0&amp;nbsp;mm）</td></tr><tr><td>真空润滑脂</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5C</td><td>高真空润滑脂</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>15 ml 锥形离心管，具有疏水性、生物惰性表面</td></tr><tr><td>10倍磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td>1.37 M 氯化钠，0.027 M 氯化钾，和 0.119 M 磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;N 氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td><td>氢氧化钠浓缩液</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>大鼠尾部&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-332</td><td>体积：2.0 ml；&lt;br /&gt;外径 x 长度：13&amp;nbsp;x&amp;nbsp;40&amp;nbsp;mm；&lt;br /&gt;无菌，单个包装</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>羧基修饰微球</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;F-8813</td><td>羧基修饰微球，0.5 &amp;micro;m，黄绿色荧光（505/515），2% 固含量</td></tr><tr><td>罗丹明</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>用于荧光的罗丹明B</td></tr></tbody></table>

用于在三维胶原基质中研究趋化性的平面梯度扩散系统

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

细胞迁移在人类生命发育过程中具有重要意义。当细胞迁移时，会产生力学力并将这些力传递到周围环境，从而导致细胞的移动和迁移。为了理解能够改变或影响细胞迁移的机制，可以对这些力学力进行研究。理论上，阐明细胞迁移背后的基本机制和力学因素，有望为疾病治疗和促进细胞移植提供有效策略。然而，目前开发的现代趋化性小室通常局限于二维（2D）环境，且具有复杂的扩散梯度，使得实验结果难以解释。为此，本文介绍并描述了一种用于趋化性研究的直视型小室，该装置能够在三维（3D）环境中克服现有趋化性小室的障碍，实现对细胞受力情况以及小室内特定浓度的测量，从而研究细胞的三维迁移行为。更重要的是，该方法能够成功模拟化学趋化因子在三维胶原基质中的扩散过程，并计算其在不同浓度胶原基质中的扩散系数，同时保持系统结构简单、操作便捷，适用于牵引力显微镜（TFM）和数字体相关（DVC）分析。

该实验能够准确评估细胞迁移能力，依赖于系统的良好设置。因此，必须仔细设计扩散系统模具，并精准放置疏水性和亲水性盖玻片，如图1所示。如果系统设计得当，并在扩散建模阶段确保获得一条良好的线性起始线，则可以获得清晰的荧光图像，用于分析系统的扩散情况，如图2所示。
成功进行细胞趋化性分析的关键在于对扩散过程建模，并通过计算软件生成的代码求解通用扩散方程，从而确定扩散系数和特定浓度方程。将图像导入计算软件并运行分析（图3）后，可评估扩散系数（表2）。图4展示了罗丹明在五种不同胶原浓度中扩散的曲线图。扩散曲线的形状符合传统线性扩散模型的典型特征。可以看出，罗丹明的扩散速率与胶原浓度呈反比关系——胶原密度越低，扩散越快。这是可预期的结果，因为较低浓度的胶原具有更高的孔隙率。在胶原浓度为1.5 mg/ml的扩散曲线中出现的水平线段（图4B）仅仅是示踪信号过度饱和所致。更重要的是，如...

细胞迁移是人类发育和生命活动的重要组成部分。为了理解可能改变细胞迁移的机制，我们介绍一种平面梯度扩散系统，用于在三维胶原基质中研究趋化性，该系统能够克服现有检测方法中传统扩散室的局限性。

细胞迁移的重要性体现在人类生命发育的各个阶段。当细胞迁移时，它们会产生力学力，并将这些力传递至……

本实验的总体目标是构建一个平面梯度扩散室，用于研究三维胶原基质中的趋化性。首先，利用活细胞成像室制备一个三维硅胶模具；第二步是制备亲水性和疏水性盖玻片，并用其组装三维硅胶模具。接下来，将胶原-细胞混合物加入中心区域，并使其聚合。最后一步是在孵育后移除模具中的疏水性盖玻片，向一个储液池中加入普通培养基，向另一个储液池中加入含有趋化因子的培养基。最终，利用共聚焦显微镜随时间追踪细胞的趋化运动，并可视化观察细胞在胶原基质内的位移情况。与现有的博因室和微运动技术相比，该技术的主要优势在于，它能够通过简单的扩散梯度，在三维空间中研究细胞迁移，且无需使用一次性移液枪。用量筒量取150 µL的氨基硒素A-P-T-M-S，倒入一个50 mL离心管中。然后用另一支一次性移液枪向管中加入30 mL的100%乙醇，并盖紧管盖。涡旋振荡溶液两分钟，以确保充分混匀。然后将溶液倒入一个玻璃培养皿中，并放置一旁。接着，用新的一次性移液管向第二个培养皿中加入15毫升100%乙醇，并将该培养皿与第一个培养皿放在一起。量取 30 毫升去离子水，将溶液倒入一个 50 毫升离心管中。接着，使用一支新的一次性移液器向管中加入 1.875 毫升戊二醛，并盖紧管盖。涡旋振荡溶液 2 分钟，然后将混合液倒入第三个培养皿中。用镊子取出一个22毫米圆形玻璃盖玻片，用100%乙醇混合液冲洗两面。使用一次性移液管将冲洗后的玻璃盖玻片放入第一个含有氨丙基三乙氧基硅烷（amino seline）的培养皿中，并用镊子将其固定，静置5分钟。取出玻璃盖玻片，再次用100%乙醇冲洗。然后将清洗过的玻璃盖玻片放入含有戊二醛的培养皿中，静置30分钟。30分钟后，用镊子取出玻璃盖玻片，并用去离子水冲洗。将冲洗后的盖玻片置于纸巾上，在室温下干燥过夜。制备疏水性盖玻片时，首先在50毫升离心管中加入500微升TTS、100微升乙酸和19.4毫升正庚烷，涡旋混合两分钟。然后将溶液倒入玻璃培养皿中，用洁净的镊子夹取一片玻璃盖玻片放入已配制的溶液中，静置两分钟。两分钟后，用镊子取出盖玻片，使用一次性移液枪头以去离子水冲洗，将盖玻片置于纸巾上，并在室温下静置过夜使其自然干燥。将干燥的盖玻片存放在塑料培养皿中，待需要时再取出使用。按照随附的文字版实验方案组装活细胞成像室。接下来，根据制造商的说明混合硅胶弹性体溶液，制备5 mL弹性体。然后使用一次性实验室刮刀缓慢地将硅胶弹性体溶液倒入活细胞成像室装置中，注意不要扰动模具组件。将模具放置在安全处，于室温下静置过夜。次日早晨，用镊子取出模具，并小心地将加工好的铝金属立方体从模具中取出。接着，前往水槽，用去离子水冲洗模具，然后将模具放在纸巾上晾干。干燥后，使用 hobby 工具刀在硅胶模具内部的每个纵向末端处切割间距为 2.34 毫米的切口。确保模具在使用前存放于安全干燥处。用 90% 乙醇冲洗模具，并将模具放入盛有去离子水的培养皿中，浸泡过夜。第二天早晨，将模具转移至一张纸巾上，在模具干燥的同时使其自然风干。使用高精度金刚石刻划工具，将亲水性盖玻片切割成两个矩形，尺寸略大于 3.95 毫米 × 5.99 毫米。然后将每个切割好的矩形盖玻片插入硅胶模具的槽中，将模具翻转至倒置状态，使用一次性移液管在硅胶模具底部涂抹真空脂。接着将模具翻转回正面朝上，将模具底部压在圆形亲水性玻璃盖玻片上。为形成密封，按所需浓度在15毫升离心管中配制培养基与趋化因子的混合液，用移液器吸取5毫升该混合液至一个新的离心管中，另取5毫升普通培养基加入第二个离心管中。将两个试管放入37摄氏度的水浴中。接下来，用移液器吸取30微升10倍浓度的磷酸盐缓冲液（10× PBS），加入一个微量离心管中。向同一微量离心管中加入6微升1 mol/L的氢氧化钠溶液，并涡旋振荡15秒。然后向一个微量离心管中加入18 µL黄色绿色荧光羧基修饰微球和168.3 µL冰上预冷的Ⅰ型大鼠尾胶原。涡旋混合30秒。接下来，向微型离心管中加入77.7 µL所需细胞，细胞浓度为每毫升培养基含2×10⁶个细胞，并混匀。使用移液器吸头，将300 µL胶原-细胞混合物移入已准备好的模具组件的中心孔中，吹打20秒以混匀。然后将模具置于一次性培养皿上，并放入标准培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育20分钟。孵育结束后，用镊子夹住两张疏水性盖玻片的顶部，将其从模具上提起并移开。将整个系统转移至显微镜下，检查小室以确保胶原模具的侧边仍然保持平直，从而在显微镜下维持一个平面的扩散梯度。向第一个孔中加入100微升细胞培养基。接下来，将含有目标趋化因子浓度的100微升细胞培养基加入基质另一侧的孔中。参照随附文本方案中所述，以荧光标记的微球为参照追踪细胞迁移过程。此处展示的一系列图像显示了牛血清白蛋白在1毫克/毫升胶原凝胶中扩散的过程。此示例展示了系统真实的平面扩散梯度，任何引入的趋化因子也应表现出类似的梯度特征。在此处所示的示例中，随时间测量了由红色方框标示位置处的荧光信号强度。图中每条曲线分别表示这些位置的浓度变化，当达到稳态时，根据凝胶中的位置形成线性浓度梯度。这种关系在一系列胶原基质浓度范围内均保持线性，因此该系统在细胞实验中非常有用。在本图像中，一个呈红色的中性粒细胞位于胶原基质内，基质中散布着用作位置参照的荧光绿色微球。接下来的三幅图像显示了该中性粒细胞沿趋化因子浓度梯度定向迁移的过程，趋化因子梯度方向以白色箭头表示。观看本视频后，您应充分了解如何构建简单的扩散室，以研究细胞在三维胶原基质中的迁移行为。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

平面梯度扩散系统的调查趋化三维胶原基质

本文描述了一种在显微镜腔室中构建黏附性梯度和可溶性梯度的方法，用于活细胞迁移研究。该人工构建的环境结合了抗污表面与黏附轨迹以及溶液梯度，从而可确定不同导向信号之间的相对重要性。...

创建黏附性与可溶性梯度以荧光显微镜成像细胞迁移

细胞迁移是一种生物学现象，参与多种生理过程（如伤口愈合和免疫反应）以及病理生理过程（如癌症）。三维胶原基质迁移实验是一种多功能工具，可用于分析不同类型细胞在类似三维生理环境中的迁移特性。...

三维胶原基质中细胞迁移的分析

细胞外基质的力学性质和微观结构对细胞的三维迁移具有显著影响。 体外...

用于研究基质微环境对三维细胞迁移生物物理作用的同心凝胶系统

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。...

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

视觉趋化性检测对于深入理解真核细胞如何调控趋化剂介导的定向细胞迁移至关重要。本文中，我们详细描述了以下两种方法：1）对多个趋化性实验进行实时、高分辨率的监测；2）同时可视化中性粒细胞样HL60细胞中的趋化剂浓度梯度以及信号事件的时空动态变化。...

成像中性粒细胞样HL60细胞中G蛋白偶联受体介导的趋化作用及其信号事件

本文详细介绍了通过在单个微流控芯片上整合全血中性粒细胞分离和趋化实验，进行快速中性粒细胞趋化功能检测的方法。...

一种全芯片式快速中性粒细胞趋化分析方法：直接从一滴血样中完成检测

本方案描述了一种倒置垂直侵袭实验方法，可用于在三维环境中定量评估细胞的迁移和侵袭能力，同时保持细胞微环境的完整性。该实验适用于稀有和/或敏感细胞。...

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趋化因子梯度下多细胞反应的三维分析

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在发育、伤口愈合和癌症转移过程中，集体细胞迁移通常由生长因子或信号分子的浓度梯度所引导。本文介绍了一种将牵引力显微镜与微流控系统相结合的实验体系，并演示了如何在生化梯度条件下定量分析集体迁移的力学机制。...

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小鼠巨噬细胞趋化作用的延时成像

学习平面梯度扩散系统用于三维胶原基质中的细胞趋化性研究。该方法利用共聚焦显微镜追踪细胞运动，为发育生物学中的细胞迁移机制研究提供可靠平台。

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