平面梯度扩散系统的调查趋化三维胶原基质

该程序的总体目标是创建一个平面梯度扩散室，以研究 3D 胶原蛋白基质中的化疗税。这是通过首先使用活细胞成像室制造 3D 硅胶模具来实现的。第二步是制作亲水和疏水盖玻片，并使用它们组装 3D 硅胶模具。

接下来，将胶原细胞混合物添加到中心隔室并使其聚合。最后一步是在孵育后从模具中取出疏水盖玻片，并将普通培养基添加到一个储液槽中，将带有化疗引诱剂的培养基添加到另一个储液槽中。最终，共聚焦显微镜用于跟踪细胞趋化性随时间的变化，并可视化胶原蛋白基质内的细胞运动位移。

与 boin 室和微型运动等现有技术相比，该技术的主要优点是它允许使用简单的设置来研究 3D 空间中的迁移，只需简单的扩散梯度，无需使用一次性移液器。量出 150 微升氨基seline A-P-T-M-S，并将其倒入 50 毫升的试管中。然后用第二支一次性移液器向试管中加入 30 毫升 100% 乙醇，并盖上盖子。

涡旋溶液 2 分钟以确保完全混合。然后将溶液倒入玻璃培养皿中，放在一边。接下来，将 15 毫升 100% 乙醇倒入第二个培养皿中，并使用新的一次性移液器将其与第一个培养皿一起放置。

量出 30 毫升去离子水，将溶液倒入 50 毫升试管中。接下来，使用新的一次性移液器向试管中加入 1.875 毫升葡萄糖醛并盖上盖子。将溶液涡旋 2 分钟，然后将混合物倒入第三个培养皿中。

用镊子取出 1 22 毫米圆形玻璃盖玻片，用 100% 乙醇混合物冲洗两侧。使用一次性移液器，将冲洗玻璃盖玻片放入第一个含有氨基seline的培养皿中，然后用镊子在溶液中静置 5 分钟。取出玻璃盖玻片，再次用 100% 乙醇冲洗。

然后将冲洗过的玻璃盖、玻片放入装有戊二醛的培养皿中，静置 30 分钟。30 分钟后，用镊子取下玻璃盖玻片，并用去离子水冲洗。将冲洗过的盖玻片放在纸巾上，在室温下干燥过夜。

要制备疏水性盖玻片，首先在 50 mL 试管中加入 500 μL TTS、100 μL 乙酸和 19.4 mLheane 并涡旋 2 分钟。然后将溶液倒入玻璃培养皿中，用干净的镊子将一张玻璃盖玻片放入准备好的溶液中，静置 2 分钟。两分钟后，用镊子取出玻璃盖玻片，用一次性移液管用去离子水冲洗，将盖玻片放在纸巾上，在室温下干燥过夜。

将干燥的盖玻片存放在塑料培养皿中，直到需要开始，按照随附文本协议中的说明组装活细胞成像室。接下来，根据制造商的说明混合有机硅弹性体溶液，制成 5 毫升弹性体。然后使用一次性实验室刮刀将有机硅弹性体溶液缓慢倒入活细胞成像室设置中，以免干扰模具组件。

将模具放在安全的地方，让室温保持一夜。第二天早上，用镊子拉出模具，小心地从模具中取出加工好的铝金属立方体。接下来，去水槽用去离子水冲洗模具，然后将模具放在纸巾上晾干。

干燥后，使用业余美工刀在硅胶模具内的每个纵向端之间切出 2.34 毫米的狭缝空间。确保模具放在安全干燥的地方，直到实验需要时再使用。用 90% 乙醇冲洗模具，然后将模具放入装满去离子水的培养皿中静置过夜。

第二天早上，将模具转移到纸巾上，并在模具干燥时让它风干。使用高精度金刚石划线工具切割正方形。亲水盖滑入两个矩形，略大于 3.95 毫米 x 5.99 毫米。

然后将每个切割好的矩形盖滑入插槽中，切入硅胶模具，倒置模具并使用一次性移液器沿硅胶模具底部涂抹真空润滑脂。接下来，将模具正面朝上，将模具底部压在圆形亲水玻璃盖玻片上。为了形成密封，在 15 毫升试管中以所需浓度制备培养基和化疗引诱剂的混合物，将 5 毫升混合物移液到新的一毫升试管中，将 5 毫升普通培养基移液到第二支试管中。

将两根管子移入加热至 37 摄氏度的水浴中。接下来，将 30 微升 10 XPBS 移液到微量离心管中。将 6 微升一种正常氢氧化钠溶液加入同一微量离心管中，涡旋 15 秒。

然后将 18 微升黄绿色荧光羧酸盐、修饰的微球加入微量离心管中，并加入 168.3 微升冰冷。1 型大鼠尾胶原。将混合物涡旋 30 秒。

接下来，添加 77.7 微升所需的细胞。将培养基中 6 个细胞以 2 倍 10 倍/毫升的浓度输入到微量离心管中并混合。使用移液器吸头 20 秒，将 300 微升胶原细胞混合物移液到准备好的模具组件的中心孔中。

然后将模具放在一次性培养皿上，将其移至标准培养箱中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下放置 20 分钟。孵育期结束后，用镊子夹在每个盖玻片的顶部，然后向上拉并离开模具，以去除两个疏水盖玻片。将整个系统移至显微镜并检查腔室，以确保胶原蛋白模具的侧面仍然笔直，从而在系统仍在显微镜下的情况下实现平面扩散梯度。将 100 μL 细胞培养基加入第一个孔中。

接下来，将 100 μL 具有所需化疗引诱剂浓度的细胞培养基添加到基质另一侧的孔中。参考荧光标记的微球跟踪细胞迁移，如随附的文本协议中所述。这里展示的一系列图像显示了瘤胃在每毫升 1 毫克胶原蛋白凝胶中的扩散。

此示例显示了系统的真实平面扩散梯度，这也可以预料到任何引入的化疗引诱剂。在此处显示的示例中，在红色方块标识的位置随时间测量了反刍信号的强度。这些位置的浓度在此图表上显示为一条单独的线，当在稳态下测量时，该线会根据凝胶中的位置产生线性浓度梯度。

这种关系在一系列胶原蛋白基质浓度范围内保持线性，使该系统对细胞实验非常有用。在这张图片中，红色的中性粒细胞显示在胶原蛋白基质中，胶原蛋白基质上散布着用作位置参考的荧光绿色微球。接下来的三张图片显示了中性粒细胞在化疗引诱剂梯度上移动时的定向迁移，如白色箭头所示。

看完这个视频后，您应该对如何创建一个简单的扩散室来研究 3D 胶原蛋白基质中的细胞迁移有了很好的了解。