Name: 一机能磁性纳米纤维素的细菌与氧化铁纳米粒子的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学习利用木醋杆菌原位沉淀氧化铁纳米粒子制备磁性细菌纳米纤维素，用于血管修复和脑动脉瘤微创治疗。该方法可增强细胞滞留能力，促进损伤部位愈合。

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本工作由美国国防部资助，合同编号为 W81XWH-11-2-0067

1. 细菌纳米纤维素（BNC）的制备
注意：除非另有说明，所有步骤均需在无菌条件下进行。
<ol>
	<li>准备培养基。
	<ol>
		<li>将25 g酵母提取物、15 g蛋白胨、125.0 g甘露醇与500 ml高纯度水混合，配制500 ml液体培养基。在120 °C下高压灭菌20 min，于4 °C保存。</li>
		<li>将15 g琼脂加入5.0 g酵母提取物、3.0 g蛋白胨、25.0 g甘露醇和100 ml高纯度水中，配制100 ml半固体培养基。在120 °C下高压灭菌20 min。灭菌后，将5 ml培养基混合物倒入90 mm × 16 mm的塑料培养皿中。置于4 °C使溶液凝胶化，并在此温度下储存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复水 G. xylinus 按照制造商说明，通过加入1 ml液体培养基并用移液器反复吹打，使冻干安瓿管中保存的菌株复苏。</li>
	<li>使用接种环将少量细菌悬液以小液滴形式接种于含有半固体培养基的培养皿中。通过从培养皿边缘向中心以“之”字形移动接种环，确保接种物覆盖整个培养皿表面。</li>
	<li>将培养皿置于26 °C培养箱中孵育72小时，无需CO2孵育期结束后，可见微小的白色菌落。若菌落未立即使用，可用封口膜密封培养皿盖后倒置存放于4 °C。菌落可按此方式保存长达6个月。</li>
	<li>将步骤（1.1.1）中制备的液体培养基每孔2 ml转移至24孔细胞培养板的各孔中。用接种针从步骤（1.3）中已接种的培养皿中挑取两个菌落，放入细胞培养板的第一孔中。对剩余的23个孔重复相同操作。</li>
	<li>在30 °C下孵育细胞培养板7天。这将产生总共24个细菌纤维素（BNC）膜片，直径为16 mm，厚度约为2-3 mm，如图所示 图1. 
	注意：在培养期间的任何时间点都不得扰动细菌培养物，例如晃动培养板。在培养期间， G. xylinus 向空气-液体界面挤出葡萄糖吡喃糖分子，形成聚合的结晶网状结构，在静态培养条件下其形状和大小与培养瓶一致。这种聚合物基质被称为细菌纳米纤维素（BNC），在培养结束时清晰可见。</li>
	<li>从培养基中收集BNC菌膜，并将其置于200 ml含1% NaOH溶液中，在50 °C下灭菌1小时，以彻底去除所有残留物 G. xylinus可选地，使用磁力搅拌子和搅拌板以300 rpm转速搅拌该溶液。弃去氢氧化钠溶液，加入200 ml新配制的1% NaOH溶液。重复此步骤一次或直至溶液中的BNC菌膜呈现半透明状。</li>
	<li>用清水冲洗BNC薄膜三次，并将其置于高纯水中室温保存。确保BNC薄膜完全浸没在水中，任何时候均不得使其干燥。</li>
	<li>在121 °C下高压灭菌BNC膜20分钟。 
	注意：一个 体内 大鼠皮下研究由Märtson及其同事开展，结果显示细菌纤维素（BNC）在植入60周后未出现降解迹象。事实上，BNC可被微生物和真菌酶自然降解，而此类酶在哺乳动物体内并不存在。另一方面，BNC的生物降解性可能源于削弱微原纤网络的机械、化学和生物过程 体内4.</li>
</ol>
2. 聚合物包覆氧化铁纳米颗粒的合成及其在细菌纤维素膜中的沉积
<ol>
	<li>向1,000 ml高纯水中通入氮气鼓泡，以去除水中溶解的氧气并用氮气取代。</li>
	<li>使用三口圆底烧瓶制备氯化铁六水合物（FeCl₃·6H₂O）与醋酸钠（NaOAc）摩尔比为2:1的溶液。3·6H2O) 和四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O) 用脱氧的高纯水稀释。例如，使用 5.4 g FeCl3·6H2O 和 1.98 g FeCl2·4H2O，溶于10 ml脱氧高纯水中。如果该溶液过于黏稠而难以搅拌，可使用0.54 g FeCl3·6H2O 和 0.198 g FeCl2·4H2O₂ 在 20 ml 脱氧高纯水中。 
	注意：减少 FeCl 的暴露时间2·4H2尽可能快速称量该化合物，以防止其从 O 氧化为空气。一旦将其加入三颈圆底烧瓶，立即用隔膜塞密封三颈圆底烧瓶，直至其与氮气供应系统及冷凝管连接。</li>
	<li>利用反应容器的两个瓶口，将氮气源连接至插有针头的隔膜塞，并将隔膜塞固定在容器的两个瓶口上，以实现氮气的持续通入和排出。</li>
	<li>将此前在步骤1.5中制备好的1片BNC薄膜（直径15.6 mm，厚度2–3 mm）放入装有反应物的容器中，确保样品完全浸没于液体中。</li>
	<li>将容器的剩余管口连接至冷凝管。此外，在冷凝管顶端安装一个装有无水硫酸钙的干燥管。向冷凝管中通入冷却水。</li>
	<li>用真空润滑脂密封所有玻璃接头。</li>
	<li>将溶液置于硅油浴中，使用搅拌加热板加热至 80 °C，并在此温度下保持至步骤 2.10。加入一小段磁力搅拌子，以 350 rpm 的速度搅拌反应物 5 分钟。确保 BNC 被亚铁溶液充分浸渍，且反应物完全溶解。持续搅拌混合物直至实验结束。 
	注意：使用温度计检测硅油的温度，应稳定在 80 °C。</li>
	<li>将搅拌速度提高至700 rpm，并在5分钟时间内逐滴加入5 ml氢氧化铵（NH₄OH）。4使用已插入隔膜塞中的移液针，向10 ml的亚铁溶液中加入氢氧化铵（OH, 14%）。加入氢氧化铵后，溶液颜色由黄色/橙色变为黑色。</li>
	<li>继续在 80 °C 下搅拌溶液 5 分钟。避免高速搅拌，以保持样品的完整性。高速搅拌， 即，高于1,000 rpm 可能会破坏样品。</li>
	<li>将搅拌加热板的温控底座调至使溶液温度降至 30 °C，并继续搅拌 5 分钟。随后关闭加热板。此时，IONP 已被整合至 BNC 网格中。</li>
	<li>将混合物冷却至室温，使用强永磁体分离磁性纳米颗粒（MNP）和细菌纳米纤维素（BNC）。例如，1 特斯拉）。为此，将混合物转移至容器烧瓶中，然后在保持磁铁靠近容器的同时，固定磁性纳米颗粒（MNPs）和细菌纳米纤维素（BNC），随后倾倒上清液。 
	注意：操作强磁铁时需谨慎，因使用不当可能造成伤害。在步骤（2.12）–（2.14）和（2.16）中，应使用此前在步骤（2.1）中制备的脱氧高纯水，以防止颗粒氧化。</li>
	<li>将磁性纳米颗粒（MNPs）和细菌纤维素（BNC）重悬于100 ml水中。轻轻振荡溶液，以去除未牢固结合到BNC中的所有MNPs。使用磁铁固定MNPs和BNC，再次倾去上清液。</li>
	<li>用去离子水反复洗涤磁性纳米颗粒（MNPs）和细菌纳米纤维素（BNC）数次，直至上清液达到中性pH（pH~7），通过比色试纸测定确认。</li>
	<li>使用镊子将磁性功能化的细菌纳米纤维素（MBNC）从磁性纳米颗粒（MNPs）中分离，并用清水反复冲洗 MBNC，直至冲洗液澄清。</li>
	<li>通过将 MBNC 置于紫外光（110-280 nm）下过夜暴露，对 MBNC 进行灭菌。</li>
	<li>将500 ml去氧高纯水在120 °C下高压灭菌20分钟，并将MBNC储存于20 ml该水中。</li>
	<li>无菌条件下，将样品浸入1% PEG中，室温（37 °C）下搅拌2小时。该步骤可提高沉积在BNC中的氧化铁纳米颗粒（特别是暴露于表面的纳米颗粒）的生物相容性和稳定性。5-7PEG 涂层将分布在 MBNC 三维网络上。 
	注意：裸露的IONP由于具有高化学活性，在空气中容易被氧化8尽管聚乙二醇（PEG）被认为是一种非生物可降解材料，但其化学稳定性取决于所处的生物学环境，例如水分含量、pH值、温度、酶的存在、活性氧物种、活性氮物种等因素。9.</li>
</ol>
3. BNC和MBNC菌膜的表征
<ol>
	<li>力学性能
	<ol>
		<li>使用 Berkovich 压头进行常规的加载-卸载纳米压痕测试。Berkovich 金刚石压头的半径为 20 nm。</li>
		<li>使用熔融石英和钨在室温（RT）下校准接触面积与压痕深度之间的函数关系。测试过程中，用胶水将样品固定在压痕仪上，压头沿样品厚度方向接近样品表面。</li>
		<li>在样品表面随机选择压痕位置，保持相邻两个压痕之间的间距为 200–300 mm。</li>
		<li>以分级加载方式对样品施加载荷，并记录压头相应的位移。通过分析载荷-深度曲线确定杨氏模量。</li>
		<li>在去离子水（DI 水）环境中对样品进行纳米压痕测试，加载速率设定为 0.0001 mN/sec 至 0.005 mN/sec，峰值载荷范围为 0.01 mN 至 0.60 mN。</li>
		<li>使用液体池装置，使样品保持在液体环境中。这种专用于流体环境下纳米力学表征的独特设置，可有效模拟细菌纳米纤维素（BNC）和磁性细菌纳米纤维素（MBNC）膜在实际生物力学环境中的功能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描电镜结构表征
	<ol>
		<li>通过扫描电子显微镜（SEM）对纳米纤维素纤维结构进行表征。</li>
		<li>将样品在 -80 °C 下冷冻干燥 24 小时，随后固定于 SEM 样品台，溅射镀 Au-Pd 膜 10 秒，然后进行 SEM 分析。</li>
		<li>在 5 kV 加速电压下，以 22,000X 和 60,000X 的放大倍数采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁畴分析
	<ol>
		<li>将 MBNC 薄膜在室温（RT）下完全干燥后，暴露于 1 特斯拉（Tesla）的永磁体中 5 分钟。</li>
		<li>立即按照制造商的操作规程，使用生物原子力显微镜（bio-AFM）进行磁力测量。</li>
		<li>每次测量时，先获取样品表面形貌图像，再在第二次扫描中采集磁畴信息。两项测量均在 bio-AFM 的非接触模式下完成。</li>
		<li>采用 Quantum Design 公司的物理性能测量系统（PPMS）中的振动样品磁强计（VSM）在室温&#160;（300 K）下对纳米颗粒进行磁学表征，施加磁场范围为 -10,000 至 10,000 Oe。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞相容性
	<ol>
		<li>将人主动脉平滑肌细胞（HASMC）以 1.0×103 个细胞/cm2 的密度接种于 6 孔组织培养板中，并在测试样品（BNC 和 MBNC 薄膜，直径均为 15.6 mm）存在下培养 24 小时。</li>
		<li>分别以未经处理的细胞和过氧化氢处理的细胞作为阴性对照和阳性对照。</li>
		<li>按照制造商的操作规程及 A. Azqueta &amp;#38; A.R. Collins10 建议的指南进行彗星试验（Comet assay）。</li>
		<li>在该试验中，使用核酸染料 SYBR Gold 按照制造商说明书对电泳后的样品中的 DNA 进行嵌入和荧光标记。 
		注：在 BNC 和 MBNC 样品存在下未发生 DNA 损伤的细胞将显示为荧光圆形绿色核区，而发生 DNA 损伤的细胞则呈现长尾“彗星”状结构——阳性样品表现为“彗星头部”（即核区）后接含有断裂 DNA 片段的“尾部”（尾部 DNA 百分比）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxena%2C+IM+%22Bacterial+Nanocellulose%3A+A+Sophisticated+Multifunctional+Material%22">Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material</a>. , 1-18 (2012).</li>
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<li>Zaborowska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bacterial+cellulose+as+a+potential+scaffold+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 6, 2540(2010).</li>
<li>Karimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+mechanical+properties+of+the+umbilical+vein+and+umbilical+artery+under+uniaxial+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Artery+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading.</a> Artery Res. 8, 51(2014).</li>
<li>Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+bacterial+nanocellulose-based+uniform+wound+dressing+for+large+area+skin+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation.</a> Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995(2013).</li>
<li>Olsson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+flexible+magnetic+aerogels+and+stiff+magnetic+nanopaper+using+cellulose+nanofibrils+as+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates.</a> Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).</li>
<li>Torre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force+microscopy+and+energy+loss+imaging+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过改变静态培养过程中的培养时间以及培养容器的尺寸，可轻松调控细菌纤维素（BNC）膜的厚度和大小。通过调节静态培养中的氧气比例，可以改变BNC的微观特性（如孔隙率）。较高的氧气浓度可产生机械强度更高的BNC11。A. Bodin 及其同事通过在 G. xylinus 发酵过程中将氧气比例从大气氧浓度调整至100%氧气，制备出了爆破压力高达880 mm Hg的BNC管状结构12。类似地，也可通过在发酵过程中引入致孔剂（如石蜡微球）来调控BNC的孔隙率。此时，所形成的孔隙率及孔间连通性将取决于致孔剂的粒径大小13。
BNC 的多孔网络结构使其能够与纳米颗粒进行功能化结合， 例如，用于药物递送载体。在本研究中，我们通过合成并生长IONP，对BNC进行了功能化修饰 原位 将纳米颗粒引入BNC膜中，以在基于BNC的支架中实施磁性方案，实现细胞的快速募集与黏附。纳米力学测试表明，BNC的纳米尺度响应与血管相似14 具有极低的杨氏模量，EBNC<...

细菌纳米纤维素（BNC）由Acetobacter xylinum菌株合成，该菌株也称为Gluconacetobacter xylinus，在静止培养期间于气液界面以薄膜或菌膜的形式沉积。这些BNC菌膜的形状与培养容器的形状一致，其厚度取决于培养天数。A. xylinus利用培养基中的葡萄糖，通过聚合及随后的结晶过程合成纤维素微纤丝。葡萄糖残基的聚合发生在细菌细胞的胞外膜上，葡聚糖链从细胞包膜上分布的单个孔道中被挤出。纤维素微纤丝的结晶发生在胞外空间，通过范德华力形成葡聚糖链片层，再通过氢键作用堆叠成片层结构1。
将磁性纳米颗粒整合到BNC基质中后，可通过外加磁场轻松操控，从而增加引导和限制含有磁性纳米颗粒的平滑肌细胞（SMCs）在动脉壁损伤部位定向聚集所需的力。该策略可防止SMCs进入其他组织，并抵抗血流施加的力，使细胞稳定停留在目标位置。已有研究表明，SMCs在血管的弹性功能中发挥重要作用，这些细胞主要位于中膜（tunica media），并形成丰富的细胞层2。
MBNC的合成方法是将BNC膜浸入并搅拌于氯化铁六水合物和氯化亚铁四水合物的溶液中，温度保持在80 °C。随后加入氢氧化铵，使铁氧化物纳米颗粒在BNC网络结构内部生成。加入氢氧化铵后，溶液颜色由橙色变为黑色。IONP沿BNC纤维束聚集分布，呈非均匀分布状态。
本方案聚焦于一种细菌纳米纤维素-磁性纳米颗粒薄膜的设计，我们将其命名为磁性细菌纳米纤维素（MBNC），旨在作为缺失、受损或受伤的小直径血管的替代材料。H. S. Barud 及其同事近期发表了一项类似研究，通过将细菌纳米纤维素（BNC）薄膜与聚乙二醇（PEG）中的稳定水相分散液及超顺磁性氧化铁纳米颗粒混合，制备出一种基于BNC的柔性磁性纸张。3在此，我们介绍细菌纤维素的制备及其浸渍方法 原位 使用磁性纳米颗粒。采用基于单链DNA断裂检测的细胞毒性实验来评估BNC和MBNC薄膜的生物相容性。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Glucoacetobacter xylinus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>700178</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>A1296-500G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-甘露醇 Bioxtra</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>M9546-250G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD 生物科学</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>细菌用蛋白胨</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠，50% 水溶液</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>六水合三氯化铁</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>236489-100G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵&amp;nbsp;</td><td>Macron 精细化学品</td><td>6665-46</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇，平均分子量 400</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>202398-250G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>四水合二氯化铁</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养皿</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>BR452000</td><td></td></tr><tr><td>一次性接种环</td><td>费舍尔科技</td><td>22-363-604&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>无水硫酸钙</td><td>W.A. Hammond Drierite&amp;nbsp;</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>高真空润滑脂</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>带 90&amp;deg; 钝端的实验室移液针</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>CAD7937-12EA</td><td></td></tr><tr><td>pH 试纸&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>P4786-100EA</td><td></td></tr><tr><td>圆底三颈角式蒸馏烧瓶</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>CLS4965250</td><td></td></tr><tr><td>油浴用硅油</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>85409-250ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>干燥管</td><td>Chemglass</td><td>CG-1295-01</td><td></td></tr><tr><td>隔膜塞，套筒型</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-98</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>Chemglass</td><td>CG-2001-05</td><td></td></tr><tr><td>冷凝器</td><td>Chemglass</td><td>CG-1218-01</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>BriskHeat</td><td>SDC120JC-A</td><td></td></tr><tr><td>搅拌加热板</td><td>费舍尔科技</td><td>11-100-49SH&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>彗星试验试剂盒</td><td>Trevigen</td><td>4250-050-K</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold 核酸凝胶染料</td><td>生命科技</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>生物原子力显微镜（bio-AFM）</td><td>JPK 仪器</td><td>NanoWizard 4a BioScience AFM</td><td></td></tr><tr><td>纳米压痕仪</td><td>Micro Materials 有限公司</td><td>多模块力学测试仪&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜（SEM）</td><td>日立高新科技美国公司</td><td>日立 S-4800</td><td></td></tr></tbody></table>

利用氧化铁纳米颗粒制备功能化磁性细菌纤维素

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

本研究中，由细菌产生的细菌纳米纤维素（BNC） Gluconacetobacter xylinus 合成并浸渍 原位 使用氧化铁纳米颗粒（IONP）（Fe3O4）以制备磁性细菌纳米纤维素（MBNC）。MBNC的合成是一个精确且经过专门设计的多步过程。简而言之，细菌纳米纤维素（BNC）膜由保存的 G. xylinus 根据我们对菌株大小和形态的实验要求进行筛选。六水合氯化铁（FeCl₃·6H₂O）溶液3·6H2O) 和四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）以2:1的摩尔比配制，并用脱氧高纯水稀释。随后将BNC薄片引入含有反应物的容器中。该混合物在硅油浴中于80 °C下搅拌加热，然后逐滴加入14%的氢氧化铵，使亚铁离子在BNC网络结构中沉淀。此步骤可实现 原位 四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4在细菌纳米纤维素（BNC）网络内部引入离子纳米颗粒（IONP），以赋予BNC薄膜磁性。采用毒理学检测方法评估BNC-IONP薄膜的生物相容性。使用聚乙二醇（PEG）包覆IONP，以提高其生物相容性。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，IONP主要位于BNC基质的纤维交织间隙中，但部分也分布于BNC带状结构上。在磁性细菌纳米纤维素（MBNC）上进行的磁力显微镜测量检测到具有高强度和弱强度磁场的磁畴存在，证实了MBNC薄膜的磁性特征。本研究获得的杨氏模量值与先前报道的多种血管数值具有较好的一致性。

G. xylinus 的培养周期总共为 9 天，但菌膜开始形成的时间较早，约 2 天后即已明显可见。细菌纤维素（BNC）的宏观形貌如图 1所示，其形状与培养皿中培养的菌落形态相似。图 2 描述了 BNC-IONP 菌膜的制备过程，概括了上述实验方案中的主要步骤以及各主要组分的组装方式。
SEM图像用于解析BNC纤维的微观结构、形貌及空间分布图3）以及离子纳米颗粒在功能化细菌纳米纤维素中的分布（图4）。BNC由细长的带状结构（直径约50 nm）构成，这些带状结构相互连接形成贯穿整个网络的开放孔隙，且无特定排列模式。IONP优先分布于纤维交错形成的孔隙之间，聚集成尺寸为100 nm或更大的簇状结构，同时也有单个IONP结合在带状结构上。与BNC相比，MBNC的纤维结构较为疏松，这可能是由于IONP促使BN...

在此，我们介绍一种用于受损血管重建应用的细菌纤维素（BNC）磁性化制备方案。该BNC由 G. xylinus 菌株。另一方面，BNC 的磁化是通过 原位 Fe沉淀2+ 和 Fe3+ BNC 网格内部的亚铁离子。

本研究中，由木醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）产生的细菌纳米纤维素（BNC）被合成，并原位浸渍铁氧化物……

本实验的总体目标是合成细菌纳米纤维素（BNC），并通过原位浸渍四氧化三铁纳米颗粒使其具备磁性。磁性BNC膜的设计目的是在血流动力学条件下局部吸引并滞留磁化细胞。本方法所合成的磁性BNC的主要优势在于，其可为脑动脉瘤附近提供一种微创治疗手段。传统的脑动脉瘤治疗方法（如夹闭术以及神经和血管核心栓塞术）具有侵入性和创伤性，不适用于大多数风险增加的患者。该技术的应用可延伸至血管疾病的治疗，因为由磁性支架制成的血管移植物可通过提高损伤部位的细胞滞留来加速愈合。按照文本方案中的描述，首先准备液体培养基以开始本实验操作。将两毫升液体培养基转移至24孔组织培养板的每个孔中。用接种针从上一步接种过的培养皿中挑取两个菌落，放入组织培养板的第一个孔中。对剩余的23个孔重复相同操作。将组织培养板在30摄氏度下孵育七天。这将获得总共24片BNC菌膜，直径为16 mm，厚度约为2至3 mm。从培养基中收集BNC菌膜，并将其置于200毫升的1%氢氧化钠溶液中，在50摄氏度下灭菌一小时，以彻底去除所有G. Xylinus残留物。弃去溶液，加入200毫升 freshly prepared 的1%氢氧化钠溶液。重复此步骤一次或直至溶液中的BNC薄膜呈现半透明外观。用纯水冲洗BNC薄膜三次，并将其储存在室温下的高纯度水中。确保细菌纤维素（BNC）膜完全浸没在水中，且在任何情况下均不得使其干燥。随后，在121摄氏度下对BNC膜进行高压灭菌20分钟。开始合成前，向1000毫升高纯度水中通入氮气，以去除水中溶解的氧气，并用氮气置换。使用三口圆底烧瓶配制溶液，其中三氯化铁六水合物与二氯化铁四水合物的摩尔比为2:1，并用脱氧高纯水稀释。使用烧瓶的两个瓶口，通过将氮气源连接至插入隔垫塞并固定在瓶口的针头，实现氮气的持续通入和排出。将一片BNC薄膜置于反应容器中，与反应物一同放置。确保样品完全浸没在液体中。然后，将所有玻璃接头处涂抹真空脂。将容器剩余的接口连接至冷凝管，冷凝管顶端接一个装有无水硫酸钙的干燥管。将水通入冷凝管中。接着，使用搅拌加热板将溶液在硅油浴中加热至80摄氏度，并维持该温度。用一个小的磁力搅拌子以350转/分钟的速度搅拌反应物5分钟。确保BNC已用亚铁溶液充分浸渍，并且反应物完全溶解。将搅拌速度提高至700转/分钟。在五分钟的时间间隔内，使用已插入隔膜塞中的移液针，将5毫升氢氧化铵加入10毫升亚铁溶液中。加入氢氧化铵后，溶液颜色由黄橙色变为黑色。将溶液在80摄氏度下继续搅拌五分钟。避免高速搅拌，以保持样品的完整性。使用搅拌加热板的温度控制底座将溶液温度降至30摄氏度，并继续搅拌五分钟。然后，关闭电热板。此时，氧化铁纳米颗粒已嵌入细菌纳米纤维素（BNC）网络中。接下来，将混合物冷却至室温，并转移至容器瓶中，利用强永磁体分离磁性纳米颗粒（MNPs）和BNC。为此，将磁铁靠近容器以固定磁性纳米颗粒（MNPs）和细菌纳米纤维素（BNC），同时倾倒上清液。将磁性纳米颗粒和细菌纳米纤维素重新悬浮于 100 毫升水中。轻轻摇动溶液，以去除未牢固结合到细菌纳米纤维素中的所有磁性纳米颗粒。然后，用磁铁固定磁性纳米颗粒（MNPs）和细菌纳米纤维素（BNC），再次倾去上清液。用清水洗涤 MNPs 和 BNC 数次，直至使用比色试纸测得上清液呈中性 pH。用镊子将磁性功能化的 BNC（即 MBNC）与 MNPs 分离，并用清水反复冲洗 MBNC，直至冲洗水变澄清。通过紫外线照射过夜对磁性细菌纳米纤维素（MBNC）进行灭菌。将MBNC储存于20毫升已脱氧并经120摄氏度高压灭菌20分钟的高纯度水中。在无菌条件下，将样品浸入1%的聚乙二醇（PEG）中，在室温下搅拌2小时。PEG包覆可提高沉积在BNC中的氧化铁纳米颗粒的生物相容性和稳定性，因为PEG能够分布于MBNC的三维网络结构中。此处展示了细菌纤维素（BNC）的宏观形貌。培养容器赋予了菌膜其特定形状。扫描电子显微镜结果显示，直径约为50纳米的细带构成了BNC的微观结构，并在整个网络中形成开放的孔隙。与BNC相比，BNC的磁性功能化导致纤维结构更为疏松。氧化铁纳米颗粒优先分布在由纤维交错形成的孔隙之间。原子力显微镜形貌检测到MBNC表面存在两个区域，表现出特征性的磁力梯度。高强度磁场以黄色显示，弱强度磁场以绿色显示。通过磁力显微镜（MFM）观察到的磁性区域的存在，由振动样品磁强计数据得以证实，该数据显示氧化铁纳米颗粒具有超顺磁性，从而使BNC具有磁性。在人主动脉平滑肌细胞中，无论是否存在BNC或MBNC，经过24小时孵育后，细胞内DNA的完整性均得以保持，这一点在与经双氧水处理的细胞进行比较时尤为明显。观看本视频后，您应能充分理解如何使细菌纳米纤维素具备磁性，以应用于受损血管的重建。当我们需要在细菌纳米纤维素网络的复杂基质中诱导磁性纳米颗粒形成密度梯度时，便首次提出了该方法的构想。由于需将氧化铁纳米颗粒整合入该网络中，因此我们不得不在细菌纳米纤维素（BNC）合成过程中引入相应的操作步骤。通常，初次接触该方法的人会遇到困难，因为将氧化铁纳米颗粒渗入细菌纳米纤维素（BNC）涉及多个复杂的步骤。

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生物工程

一机能磁性纳米纤维素的细菌与氧化铁纳米粒子的制备

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磁铁矿嵌入的细菌纤维素膜的制备

来源： Arias, S. L., et al．利用氧化铁纳米颗粒制备功能化磁性细菌纳米纤维素． J. Vis. Exp.

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靶向细胞递送在多种生物医学应用中具有重要意义。本实验方案旨在利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）标记细胞，从而实现磁性细胞靶向，以高度可控的方式进行细胞递送与定位。...

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学习利用木醋杆菌原位沉淀氧化铁纳米粒子制备磁性细菌纳米纤维素，用于血管修复和脑动脉瘤微创治疗。该方法可增强细胞滞留能力，促进损伤部位愈合。

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