Name: 选择反应监测质谱法进行绝对定量蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学习使用液相色谱-选择反应监测质谱法对复杂生物样品中的目标蛋白进行绝对定量。该方法以小鼠巨噬细胞趋化信号通路为研究对象，通过合成肽段标准品和稳定同位素稀释技术，实现高通量、高准确度的蛋白质组学分析。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所内部研究计划资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

绝对蛋白质定量对于多种生物医学应用至关重要，例如生物标志物验证和信号转导通路建模。近年来，基于液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）的靶向蛋白质组学在多个技术环节取得了显著进步，包括肽段标准品制备、高效液相色谱（HPLC）、三重四极杆质谱（QqQ-MS）以及LC-SRM数据分析方法。因此，该技术已成为免疫测定法的一种强大替代方案。免疫测定法虽然具有极高的灵敏度和通量，但建立一个稳健的免疫测定方法极具挑战性，因其可能受到交叉反应或干扰的影响，与细胞/组织裂解/匀浆方法不兼容，或难以实现多重检测5,8。例如，评估交叉反应最全面的方法是使用基因敲除样本进行免疫测定，而这类样本的制备往往具有挑战性。
本方案描述了靶向肽段的选择、液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）检测方法的建立、定性和定量LC-SRM分析，以及LC-SRM数据分析。该方法曾用于测定RAW 264.7细胞中36种趋化性信号通路蛋白的绝对丰度56，但其适用范围远不止于此。尽管该方案最初设计用于细胞沉淀中的蛋白质定量，但也可调整用于其他生物样本（例如，体液）和其他S...

使用质谱法（MS）的蛋白质组学实验可采用非靶向（鸟枪法）或靶向方法进行设计。发现型蛋白质组学通常依赖自下而上的鸟枪法质谱技术，可通过传统的数据依赖性采集模式，或采用近期开发的数据非依赖性技术之一来实现例如，硕士E，SWATH）1,2Shotgun 蛋白质组学是用于高通量肽段鉴定和相对定量的有力工具，但通常不适用于绝对定量或针对少量特定（约数十个）蛋白质的分析。在靶向蛋白质组学中，最常用的质谱方法是选择反应监测（SRM），因其具有高灵敏度、快速检测能力和宽动态范围3-5SRM 的替代方法包括平行反应监测，后者利用高分辨率的全扫描 MS 技术6.
SRM 通常使用与纳米电喷雾电离（nano-ESI）离子源联用的纳米流速反相高效液相色谱（nano-RP-LC）仪器，并连接三重四极杆质谱仪（QqQ-MS）进行。在典型实验中，样品蛋白质经蛋白酶消化后，产生的肽段通过色谱分离、解吸并离子化。生成的前体离子由第一重四极杆（Q1）按质荷比（m/z）筛选，并在第二重四极杆（q2）中通过与碰撞气体碰撞而发生碎裂。所产生的碎片离子在第三重四极杆（Q3）中再次按 m/z 筛选，并由打拿极进行定量。每一对前体离子与碎片离子称为一个“跃迁”（transition），每个跃迁在特定时间段（驻留时间；通常为 2–50 毫秒）内被监测。在 LC-SRM 过程中，QqQ-MS 在预设的跃迁列表中循环（工作周期通常 ≤3 秒），从而生成每个跃迁的色谱图。
用于蛋白质定量的替代策略通常使用免疫测定法，例如点印迹（dot blots）、Western印迹（Western blots）、酶联免疫吸附测定（ELISAs）、抗体微阵列、反相蛋白质微阵列、微流控免疫测定、数字ELISA以及基于微球的免疫测定7。最先进的免疫测定法可显著比液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）更灵敏，且免疫测定法的样本通量可显著高于LC-SRM5。然而，开发免疫测定法可能成本高昂和/或耗时，并且所获得的测定方法可能易受交叉反应和/或干扰的影响，与细胞/组织裂解/匀浆方法不兼容，和/或难以实现多重检测5,8。其中部分问题可通过结合抗体与质谱（MS）技术来解决。例如，可在蛋白质酶解及LC-SRM分析之前，通过免疫沉淀富集目标蛋白质9-12。另一种方法SISCAPA技术则是在肽段水平酶解之后进行免疫沉淀13,14。除了免疫富集策略外，还可采用免疫耗竭法去除高丰度蛋白质，以减少共洗脱分析物的干扰，从而提高LC-SRM的检测灵敏度15,16。
基于质谱的蛋白质定量可分为相对定量和绝对定量，同时也可分为无标记定量和稳定同位素标记定量（例如，代谢标记、化学标记以及重同位素标记的蛋白质和肽段内标）。无标记技术可用于相对蛋白质定量，但不适用于精确的绝对定量。相比之下，标记技术可降低样品制备和质谱变异带来的误差，常用于相对蛋白质定量17。例如，利用培养的人源细胞系制备的稳定同位素标记蛋白质组（SILAP）标准品，已实现通过液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）对人血清中潜在生物标志物的相对定量18。质谱法实现准确的绝对蛋白质定量，要求在质谱分析前将纯化并定量的、带有同位素标记的蛋白质或肽段内标加入生物样品中。将重同位素标记的内标引入液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）工作流程，可实现绝对定量，且已被证明具有高度的可重复性，并可在不同实验室之间转移16,19。
用于质谱法绝对定量蛋白质的稳定同位素标记内标包括通过固相合成制备的肽段标准品20、由串联的可被蛋白酶切割的肽段标准品组成的蛋白质21，以及全长蛋白质标准品22。目标蛋白质的共价修饰以及样品制备不完全（即样品裂解与匀浆不完全，以及蛋白质溶解、变性、烷基化和蛋白酶解不完全）可能会影响定量的准确性。内源性蛋白质标准品受上述大多数潜在问题影响的可能性最小，但通常也是最难制备的。另一种方法是使用多个包含天然氨基端和羧基端侧翼残基的内标肽段分别对每个目标蛋白质进行分析。无论采用何种类型的内标，都应尽可能在样品制备的早期阶段将其加入生物样品中。此外，应尝试多种样品制备技术（例如不同的变性条件）。采用多种正交实验技术（实验交叉验证）是克服大多数潜在定量挑战的有效策略23-25。
液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）蛋白质定量是一种高度灵活的技术，已广泛应用于多种研究领域。值得注意的是，该技术已被用于研究临床样本（如血清、穿刺活检组织和细针穿刺抽吸物）中的肽段和蛋白质生物标志物5。LC-SRM 还被用于测定蛋白质复合物的化学计量比5,26、检测肉毒神经毒素27、量化信号通路中蛋白质磷酸化的动态变化5，以及量化蛋白质构象的变化28。
本实验室正在利用液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）技术定量介导巨噬细胞趋化性的信号蛋白，以支持趋化性通路模拟的建立。该方案的整体流程（图1）首先对初步选定的目标肽段进行排序。随后合成粗制的外源性肽段标准品，并用于建立LC-SRM检测方法，以对生物样本进行定性分析。若在生物样本中检测到目标肽段，则制备纯化的重同位素标记内标肽段标准品，用于定量LC-SRM分析。该方案可用于准确定量多种类型的生物样本中的蛋白质，并支持对多种蛋白质靶标的深入研究。

<table><tbody><tr><td>乙腈（ACN），液相色谱-质谱级</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>BCA（双辛可宁酸）蛋白检测试剂盒</td><td>Fisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>珠击破碎用珠子，二氧化锆-硅石，0.1 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101z</td><td></td></tr><tr><td>亮抑酶肽盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>B8385-10MG</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用DMEM（含葡萄糖，不含L-谷氨酰胺）</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用EDTA，500 mM，pH 8</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用台盼蓝活力染色液，0.4% w/v</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4 细胞计数仪</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4 一次性计数板</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>甲酸，液相色谱-质谱级，安瓿装</td><td>Fisher</td><td>A117-10X1AMP</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板，改进型Neubauer，深度0.1 mm</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0640030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，1 M，pH 7.2</td><td>Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>盐酸，37% w/w</td><td>VWR</td><td>BDH3028-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>激光拉制微移液管仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>液相色谱涂层石英毛细管，内径50 &amp;micro;m</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>液相色谱小瓶，自动进样器用，12 mm x 32 mm 聚丙烯</td><td>SUN SRI</td><td>200-268</td><td></td></tr><tr><td>液相色谱小瓶螺口盖，自动进样器用，预切口PTFE/硅胶</td><td>SUN SRI</td><td>500-061</td><td></td></tr><tr><td>荧光素酶，来源于Photinus pyralis</td><td>Sigma</td><td>L9506-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>EMD Millipore</td><td>516481-25MG</td><td></td></tr><tr><td>pH试纸 colorpHast（pH 0.0–6.0）</td><td>EMD Chemicals</td><td>9586-1</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop 磷酸酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>04906837001</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak 固相萃取柱，C18，1 ml，100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT023590</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak 固相萃取装置，20位</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak 固相萃取用平头橡胶吸头</td><td>Fisher</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 真空浓缩仪</td><td>Fisher</td><td>SPD111V</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA），液相色谱-质谱级</td><td>Fisher</td><td>A116-50</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，测序级，修饰型</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Micronic管用去盖器</td><td>USA Scientific</td><td>1765-4000</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 微量离心管，带O型圈螺口盖，无菌</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>U0631-500g</td><td></td></tr><tr><td>水，液相色谱-质谱级</td><td>Fisher</td><td>W6-1</td><td></td></tr></tbody></table>

选择性反应监测质谱法用于蛋白质绝对定量

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

在复杂的生物样品中对目标蛋白质进行绝对定量，对于广泛的研究和临床应用至关重要。本方案提供了使用选择反应监测（SRM）质谱法（MS）开发和应用定量检测方法的逐步操作指南。首先，基于多种标准筛选出可能适用于定量的特征性目标肽段，包括识别具有蛋白特异性的肽段、避开翻译后修饰位点，以及分析目标肽段相对于目标蛋白的唯一性。接下来，合成粗制的外源性肽段标准品，用于开发SRM检测方法，并利用所建立的检测方法对生物样品进行定性分析。最后，制备经过纯化、准确定量并带有重同位素标记的内标肽段，用于开展同位素稀释系列SRM检测。本文展示了对所有质谱数据的分析过程。该方案已成功用于准确定量小鼠单核/巨噬细胞系RAW 264.7细胞中趋化因子信号通路相关蛋白的绝对丰度，并详细描述了对Gi2（一种异源三聚体G蛋白α亚基）的定量过程。

建立信号转导通路的预测性计算模型是系统生物学的基本目标之一53不幸的是，即使对于那些已被广泛研究且具有重要临床意义的信号通路，目前仍普遍无法定量预测其在受到扰动后的通路行为。例如，这对MAPK/ERK通路也是如此54）。最近，一项研究采用靶向蛋白质组学、转录组学以及计算建模与模拟方法，对小鼠巨噬细胞趋化信号通路进行了研究56研究的重点是鞘氨醇-1-磷酸介导的RAW 264.7细胞（一种小鼠单核/巨噬细胞系）的趋化作用。为了便于通路建模，开发并实施了液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）检测方法，以测定RAW 264.7细胞内趋化作用通路蛋白的绝对丰度。所得的丰度值被用作通路模型的参数。
整体实验方案（图1）始于一组目标蛋白列表，其中包括异源三聚体G蛋白α亚基Gi2。整个实验流程的成功高度依赖于选择具有蛋白典型性和定量典型性的肽段靶标，例如YDEAASYIQSK。制备并分析了外源肽段标准品的混合物，采用鸟枪法液相色谱-三重四极杆质谱（LC-QqQ...

本方案介绍了如何在复杂的生物样品中使用选择反应监测技术对目标蛋白质进行绝对定量分析。该方法已用于准确量化小鼠巨噬细胞趋化信号通路中的蛋白质。文中详细描述了目标肽段的选择、检测方法的建立，以及定性和定量分析过程。

在复杂的生物样本中对目标蛋白进行绝对定量，对于广泛的研究和临床应用至关重要。

本实验的总体目标是利用液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）技术，对复杂生物样品中的目标蛋白质进行绝对定量。在选定肽段靶标后，合成粗制的外部肽段标准品，并结合液相色谱-质谱（LC-MS）技术用于开发SRM检测方法。所建立的检测方法可用于对制备好的生物样品进行定性LC-SRM分析。如果检测到来源于生物样本的目标肽段，则通过添加稳定同位素稀释系列的内标肽段标准品，使用定量液相色谱-选择反应监测（lc SRM）检测方法对生物样本进行分析。最终，液相色谱-选择反应监测（lc SRM）可用于准确量化多种多样的生物样本中的蛋白质，并支持针对多种蛋白质靶标的深入研究。与现有的免疫检测等方法相比，该技术的主要优势在于检测方法的开发相对快速且成本较低，所建立的检测方法易于实现多重检测，且不受抗体交叉反应的干扰。首先，按照文本方案中的描述制备冻干肽标准品。然后向每份冻干肽标准品中加入 100 微升甲酸-乙腈溶液，使肽浓度达到 10 微摩尔。将样品涡旋振荡两分钟，并进行水浴处理。超声处理5分钟，以确保肽完全溶解。将溶解后的肽液转移至真空浓缩仪中浓缩，最终体积为80微升。加入20微升乙腈以溶解任何可能析出的肽沉淀。样品现在含有每种肽各10 µM，以及20%（体积比）乙腈，可用于制备内标和外标肽段标准品。使用与三重四极杆质谱仪联用的纳米流速高效液相色谱系统，通过鸟枪法质谱分析外标肽段标准品混合物，每针进样量约为每种肽段1至10皮摩尔。如文本方案中所述，确保每次液相色谱-质谱（LCMS）运行包含60分钟线性梯度洗脱、色谱柱再生步骤和色谱柱重新平衡步骤。使用数据库搜索对获得的鸟枪法质谱数据进行分析，比对目标外标肽段标准品的序列。手动检查所有肽段鉴定结果，确保其均无歧义，并剔除任何存在歧义的肽段鉴定。利用鸟枪法质谱肽段鉴定结果，使用诸如 Skyline 等软件程序构建谱图库。根据每个前体离子的 3 至 10 个最强跃迁，制备 LC-SRM 转换列表。利用生成的转换列表对体外肽段标准品混合物进行液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）分析。手动审查生成的LC-SRM数据，并删除任何性能不佳的检测方法。随后准备生物样本。首先，按照文本方案中所述收获细胞。加入 400 µL 新鲜配制的尿素裂解缓冲液，通过轻柔吹打混匀各样本。将每个样本转移至含有约 100 µL 0.1 毫米氧化锆硅珠、带 O 形圈螺口盖的 2 毫升离心管中，于最大转速下涡旋震荡 5 分钟以裂解细胞。在室温下对样品进行10分钟的超声处理，以促进匀质化和蛋白质变性。然后对裂解液进行蛋白质浓度测定，例如使用双缩酸法进行定性分析。为稳定同位素稀释系列准备每份200微克的细胞裂解液。向样品中加入内标肽标准品的回声摩尔混合物的稳定同位素稀释系列。通过向每个样品中加入0.7 µL的一摩尔DTT，并将样品在60 °C下孵育30分钟，还原蛋白质中的

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生物学

选择反应监测质谱法进行绝对定量蛋白质

稳定同位素标准与抗肽抗体富集技术（SISCAPA）将肽段的亲和富集与稳定同位素稀释质谱法（MRM-MS）相结合，可对肽段进行定量检测，从而间接反映其对应蛋白质的含量。本文描述了使用磁性微粒并在部分自动化条件下进行该实验的操作流程。...

使用肽免疫亲和富集联合质谱法进行蛋白质定量

我们提出了一种用于鉴定和定量含有相似蛋白质的物种混合物中各组分的方案。质谱法通过检测肽段实现鉴定，并通过峰面积比值进行相对定量。作为一种用于食品欺诈检测的工具，该方法可检测出牛肉中1%的马肉成分。...

利用肽段的多反应监测质谱法进行混合物中物种鉴定与定量——应用于肉类真实性检测

本文介绍了一种色谱分析方法，该方法结合了肽段前体的离子淌度分离，随后对肽段碎片进行高分辨率（约30,000）质谱检测，用于定量单克隆抗体酶解产物中添加的肽段标准品。...

一种基于液相色谱离子淌度QTOF质谱的HS-MRM方法用于蛋白质类生物制药中宿主细胞蛋白的定量分析

介绍了一种利用单个样品对生物组织中的脂质、代谢物和蛋白质进行综合提取的实验方案。...

一种用于从单个样品中全面分析代谢物、脂质和蛋白质的简单分级提取方法

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

本文介绍了一种可靠的实验方案，用于定量无细胞蛋白合成反应中涉及中心碳代谢和能量代谢的40种化合物。通过苯胺对无细胞合成混合物进行衍生化处理，以实现反相液相色谱的有效分离，随后使用同位素标记的内标物结合质谱法进行定量分析。...

采用反相液相色谱-质谱法对无细胞蛋白合成代谢进行绝对定量

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

本方案旨在介绍使用三重四极杆质谱仪对临床样本中的蛋白质进行多反应监测（MRM）的方法。我们提供了一套系统的工作流程，涵盖从样本制备到数据分析的各个环节，并列出了处理临床样本时所需采取的所有必要预防措施。...

基于多重反应监测技术检测人脑组织蛋白质的定量蛋白质组学工作流程

本文介绍了一种从干血清样本中检测低丰度生物标志物的实验方案，以胃泌素释放肽前体（ProGRP）这一生物标志物为例。采用抗体包被的磁珠对特征性ProGRP肽段进行选择性纯化与富集，捕获的肽段随后通过液相色谱-串联质谱法进行分析。...

基于质谱靶向蛋白质分析中低丰度蛋白质的微采样技术

学习使用液相色谱-选择反应监测质谱法对复杂生物样品中的目标蛋白进行绝对定量。该方法以小鼠巨噬细胞趋化信号通路为研究对象，通过合成肽段标准品和稳定同位素稀释技术，实现高通量、高准确度的蛋白质组学分析。

选择性反应监测质谱法用于蛋白质绝对定量

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