Name: 极化神经组织工程三维蚕丝胶原蛋白为基础的模式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 了解利用蚕丝盐析法制备多孔支架、接种大鼠原代皮层神经元并进行胶原包埋，构建三维类脑组织模型的方法。该模型可用于研究神经网络组装及神经退行性疾病。

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感谢Stephen Moss博士的实验室提供了胚胎大鼠脑组织。M.D.T. 设计了原始实验方案。本工作由美国国立卫生研究院P41组织工程资源中心资助项目EB002520支持。K.C. 获得了德国研究基金会（DFG）博士后奖学金（CH 1400/2-1）的资助。

脑组织分离方案已获塔夫茨大学机构动物照护与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》（机构动物照护与使用委员会编号 B2011-45）。
1. 蚕丝支架的制备
<ol>
	<li>按照先前所述方法从 Bombyx mori 蚕茧制备丝素溶液19,20。
	<ol>
		<li>使用剪刀将每个蚕茧剪成8等份。制备5 g碎片化蚕茧约需11个蚕茧。（15分钟）</li>
		<li>配制2 L的0.02 M Na2CO3溶液，并使用加热板加热至沸腾。（15分钟）</li>
		<li>称取5 g碎片化蚕茧，放入Na2CO3溶液中煮沸30分钟。每隔几分钟用刮勺搅拌一次正在沸腾的蚕丝。此步骤也称为脱胶，用于从亲水性蛋白丝胶蛋白（sericin）中纯化出丝素蛋白。（30分钟）</li>
		<li>用手挤干丝素蛋白，并用蒸馏水至少冲洗三次，以去除残留的丝胶蛋白和化学物质。（5分钟）</li>
		<li>将湿润的丝素蛋白置于培养皿中，并在通风橱中过夜干燥。</li>
		<li>次日称量干燥后的丝素蛋白质量，并将其放入玻璃烧杯中。（15分钟）</li>
		<li>为将丝素蛋白溶解于9.3 M LiBr溶液中，按丝素蛋白干重乘以4计算所需LiBr体积（单位为ml）。缓慢将LiBr溶液倒入丝素蛋白上，并用刮勺使所有丝素纤维完全浸没。盖上烧杯以防止蒸发，并在60 °C条件下放置4小时，使纤维充分溶解。（15分钟）</li>
		<li>使用注射器从烧杯中收集丝素溶液，并装入截留分子量为3,500的透析盒中。在蒸馏水中透析48小时，每隔几小时更换一次水。</li>
		<li>使用注射器将透析盒中的丝素溶液收集至50 ml锥形管中，在4 °C条件下以9,000 rpm（约12,700 × g）离心两次，每次20分钟。每次离心后将上清液倒入新管中，弃去沉淀物。（40分钟）</li>
		<li>通过测定干重估算丝素蛋白浓度。取1 ml丝素溶液加入称量舟中，在60 °C烘箱中干燥2小时。称量干燥后的丝素蛋白质量，并将该质量乘以100，计算出丝素蛋白溶液的浓度。预期丝素溶液浓度为6–9%（w/v）。</li>
		<li>用蒸馏水稀释丝素溶液，将其浓度调整至6%（w/v）。 
		暂停点：液态丝素蛋白可在密闭容器中于4 °C保存长达一个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>由丝素溶液制备多孔支架。
	<ol>
		<li>对颗粒状NaCl进行筛分，分离出粒径为500–600 µm的颗粒，用于后续步骤。丢弃粒径小于500 µm或大于600 µm的颗粒。（15分钟）</li>
		<li>将30 ml的6%丝素溶液倒入聚四氟乙烯（PTFE）模具中（图1）。将60 g过筛后的NaCl均匀撒布于丝素溶液表面。轻敲容器以获得均匀的盐层。在室温下孵育48小时，使丝素蛋白完成聚合。</li>
		<li>将含有支架的PTFE模具置于60 °C烘箱中1小时，以完成聚合过程并蒸发残留液体。</li>
		<li>将PTFE模具中的内容物放入盛有2 L蒸馏水的烧杯中，浸泡48小时以浸出盐分。每日换水2–3次。当盐完全浸出后，将海绵状支架从模具中取出。暂停点：海绵支架可浸没于水中，在4 °C密闭容器中保存，以防脱水。</li>
		<li>使用5 mm直径的活检打孔器切割支架。预先切割支架使其高度约为2 mm。再用2 mm直径的活检打孔器在支架中心打孔（图2A）。（1小时）</li>
		<li>将支架浸没于水中进行高压灭菌处理（湿热循环，121 °C，20分钟）。暂停点：海绵支架可浸没于水中，在4 °C密闭容器中保存，以防脱水。</li>
		<li>在计划接种细胞前，将支架浸入无菌的0.1 mg/ml多聚-L-赖氨酸（PDL）溶液中，在37 °C孵育1小时。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤支架3次，以去除未结合的PDL。（30分钟）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大鼠皮层神经元的分离
<ol>
	<li>在获得批准的动物实验方案后，按照 Pacifici 和 Peruzzi27 之前所述的方法，分离胚胎第18天（E18）Sprague-Dawley 大鼠的大脑皮层。（2 小时）</li>
	<li>将10个大脑皮层组织置于5 ml含0.25%胰蛋白酶和0.3% DNase I（来自牛胰腺）的溶液中，37 °C孵育20分钟。</li>
	<li>加入等体积的1 mg/ml大豆蛋白以终止胰蛋白酶的消化作用。</li>
	<li>使用10 ml巴斯德吸管轻柔吹打20次，直至形成单细胞悬液。操作时应轻柔，避免产生气泡。（10 分钟）</li>
	<li>将细胞悬液以127 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于10 ml培养基中（Neurobasal 培养基，1× B27 添加剂，1× Glutamax，1% 青霉素/链霉素），计数细胞。预期细胞浓度约为2×107/ml。（20 分钟）</li>
</ol>
3. 构建体的组装与培养
<ol>
	<li>细胞接种于支架上。
	<ol>
		<li>将无菌支架及所有所需器械移入细胞培养超净台内。使用无菌镊子将支架放入96孔细胞培养板中，每孔放置一个支架。（10 分钟）</li>
		<li>用细胞培养基浸没支架，以在接种细胞前使其达到平衡状态。于37 °C孵育1小时。（10 分钟）</li>
		<li>吸除支架中多余的培养基。</li>
		<li>每支架加入100 µl细胞悬液。（10 分钟）</li>
		<li>将细胞于37 °C过夜孵育，以使细胞贴附于支架上。</li>
		<li>次日早晨吸除非贴壁细胞，并向每孔加入200 µl新鲜培养基。（10 分钟）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支架包埋于胶原基质中。（2 小时）
	<ol>
		<li>将10× PBS、水、1 N NaOH和大鼠尾部I型胶原置于冰上。按照制造商说明配制胶原工作液。在接种细胞的构建物准备好之前（最长1小时），保持其处于冰上。</li>
		<li>从培养箱中取出接种细胞的丝素蛋白构建物，并吸除多余的培养基。</li>
		<li>使用无菌镊子将支架转移至培养板中的空孔内，并将每个支架浸入100 µl浓度为3 mg/ml的胶原溶液中。将组织培养板放回培养箱孵育30分钟，以使胶原发生聚合。</li>
		<li>每孔加入100 µl预热的细胞培养基。将构建物培养一周，每天更换培养基，仅替换一半体积的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 显微镜分析
<ol>
	<li>活细胞/死细胞染色（1 小时）
	<ol>
		<li>用蒸馏水配制碘化丙啶（PI）储存液，浓度为 1 mg/ml（1.5 mM）。</li>
		<li>用丙酮配制荧光素二乙酸酯（FDA）储存液，浓度为 2 mg/ml。</li>
		<li>用 PBS 稀释储存液，配制工作液，其中含 10 µM PI 和 0.15 µM FDA。将工作液在水浴中预热至 37 °C。</li>
		<li>用预热的 PBS 洗涤细胞，以去除血清酯酶。吸除 PBS。</li>
		<li>将预热的工作液加入细胞中，孵育 2 分钟，然后用 PBS 洗涤。</li>
		<li>使用落射荧光显微镜观察细胞（PI 激发波长 λ=490 nm，发射波长 λ=570 nm；FDA 激发波长 λ=490 nm，发射波长 λ=514 nm）。染色信号在 40 分钟内保持稳定。长时间染色可能导致细胞非特异性摄取 PI，以及 PI 与 FDA 在细胞内的共定位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫染色
	<ol>
		<li>在培养的预定时间点，用 4% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 30 分钟。由于 PFA 蒸气具有毒性，固定步骤应在化学通风橱中进行。</li>
		<li>用 PBS 洗涤支架 3 次。暂停点：PFA 固定的样品可在 4 °C 的 PBS 中保存数天，再进行后续步骤。</li>
		<li>将支架置于含 0.2% Triton 和 0.25% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 中，并加入一抗，4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>次日弃去染色液，用 PBS 洗涤支架 3 次，每次 30 分钟，以去除未结合的一抗。</li>
		<li>将样品与用含 0.2% Triton 和 0.25% BSA 的 PBS 稀释的二抗在室温下孵育 2 小时。</li>
		<li>弃去染色液，用 PBS 洗涤支架 3 次，每次 30 分钟，以去除未结合的二抗。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜，配备 20X 物镜，以 1 µm 步长采集样品 100 µm 的 z 轴切片图像。为清晰观察细小的神经突起，图像分辨率应至少达到 1,024 × 1,024 像素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA、DNA 和蛋白质提取 
	注意：RNA、DNA 和蛋白质的提取使用商业化的 AllPrep DNA/RNA/蛋白质 Mini Kit，按照制造商说明书操作。
	<ol>
		<li>使用无菌镊子将支架从培养板转移至 2 ml 无菌离心管中。每管放置一个支架。</li>
		<li>向每根离心管中加入 200 µl RLT 缓冲液。</li>
		<li>使用无菌显微剪将支架剪碎，以破坏其结构。</li>
		<li>为均质化破碎组织，将管内内容物转移至离心柱中。在微量离心机中以最大速度离心 2 分钟。裂解液在通过离心柱时即被均质化。</li>
		<li>收集穿流液，并立即按照制造商方案用于 RNA、DNA 和蛋白质的提取。</li>
		<li>使用任何兼容的方法（例如，NanoDrop）定量核酸产量。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用 BCA 蛋白质测定法定量蛋白质产量。使用酶标仪在 562 nm 波长下测定结果。 
		注意：每个支架中核酸和蛋白质的预期产量与细胞密度的关系见图 4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

本视频文章的出版由康宁公司赞助。

本文介绍了构建一种分区的三维类脑组织模型的指南。该模型具有神经元密集极性培养的特征，从而形成两个形态不同的区域：一个区域包含密集排列的细胞体，另一个区域则包含纯轴突网络。总体而言，支架结构和生长模式模拟了脑皮层组织，包括六层板层结构和白质纤维束21。
这种基于丝素蛋白的环形组织模型可对机械性能、多样的结构形态、水凝胶填充物和细胞组分进行修饰和调控，因此该组织模型为多种研究建立了基础平台。丝素蛋白因其良好的生物相容性、以水为基的加工方式以及优异的机械性能和降解特性，成为生物材料平台的理想候选材料22。此外，丝素基质还可作为稳定的锚定点，减少培养过程中胶原凝胶的收缩。本模型所用支架的丝素蛋白浓度和孔隙率等参数此前已优化，以实现最佳的细胞生长状态和机械性能，从而获得类似脑组织的弹性模量18,23,24。为确保实验的成功和可重复性，建议保持这些参数不变。
通过结合两种具有不同力学性能的生物材料，实现了三维神经网络的形成：一种刚性支架用于提供神经元锚定，另一种较软的凝胶基质则允许轴突在三维空间中延伸和连接。丝素蛋白支架与软性水凝胶对材料的选择性偏好，为将神经元本体与轴突连接分隔在不同区域提供了基本原理。由于丝素蛋白支架具有惰性，需通过聚-D-赖氨酸功能化处理以实现神经元的附着。然而，也可使用其他促进细胞黏附的因子，例如 RGD25 或纤连蛋白26。为实现三维网络的构建，需在神经元附着于支架后及时用水凝胶填充丝素蛋白支架。同样，胶原蛋白基质填充物也可替换为其他水凝胶，从而允许研究三维细胞外环境对轴突网络形成的影响，并作为评估新型水凝胶神经相容性的平台。此外，除大鼠皮层神经元外，还可使用其他神经元来源，如海马神经元或诱导性多能干细胞（iPSc）来源的神经元。此外，该组织模型还可通过共培养胶质细胞与神经元来研究异细胞间的相互作用，进而构建更为复杂的类脑组织。
如先前所示，我们的模型可用于在三维微环境中评估神经元功能，适用的检测方法包括细胞活力、基因表达、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和电生理学等，从而证明了该模型的生理相关性18。其他常用于评估三维组织工程构建物的方法，如免疫染色和显微成像8,9,11，也可用于评估细胞分布及轴突网络形成的程度。然而需要注意的是，由于胶原基质密度较高，抗体渗透和成像深度仅限于几百微米。此外，非特异性背景荧光可能影响信噪比。这一问题可通过使用脂溶性细胞示踪剂或基因表达的荧光蛋白来克服，从而减少对免疫染色的依赖11。 Alternatively, the imaging can be performed with 2-photon microscopy instead of usual one-photon technique, which may reduce the signal loss, photobleaching, and can be extended to several hundred micrometers of depth.
综上所述，基于丝素蛋白和胶原蛋白的类脑组织为研究三维神经元网络提供了一个可靠的平台，并为未来开发更先进的神经系统疾病模型奠定了基础。无论采用何种评估方式，该组织模型的相对简便性均支持其在实用性、成功性和可重复性方面的优势。

中枢神经系统（CNS）可能受到多种疾病的损害，包括血管性、结构性、功能性、感染性或退行性疾病。据估计，每年约有680万人死于神经系统疾病，这在全球范围内造成了日益加重的社会经济负担1。然而，目前仅有少数疾病拥有有效的治疗方法。因此，迫切需要为患有神经系统疾病的患者开发创新的治疗策略。遗憾的是，许多针对中枢神经系统的治疗手段在临床试验中失败，部分原因在于所使用的临床前研究模型不够充分，无法通过生理学相关功能指标来评估急性与慢性影响。
尽管过去几十年中已开展了大量研究，但关于中枢神经系统（CNS）的结构与功能仍存在大量未知领域。为了获取更多知识，动物模型常被用于模拟病理状态，如创伤性脑损伤（TBI）或痴呆，尤其是在临床前研究中。然而，动物与人类在中枢神经系统的解剖结构、功能、基因表达及代谢方面均存在显著差异。2-4另一方面，2D 体外 培养细胞是研究细胞生物学的常用方法，也常规用于药物发现。然而，与人脑相比，二维细胞培养缺乏复杂性和生理相关性。5-7尽管二维细胞培养研究具有成本低、操作简单的优势，动物模型也能提供复杂的生理环境，但三维组织工程有望构建更优的研究模型，以弥补二维与三维之间的差距 体外 和 体内 方法。三维组织工程通过生物材料支架提供的三维细胞间相互作用和细胞外信号，创造了更接近生理状态的实验条件。尽管已有大量证据支持三维培养的价值，目前仍仅有少数三维中枢神经系统组织模型，例如由干细胞衍生的类器官培养物。8-10神经球11 分散的水凝胶培养12,13先进的技术方法，包括多层光刻14，以及3D打印15 已被用于研究肺、肝和肾组织。然而，目前仍缺乏能够实现神经元生长区域化、模拟大脑皮层结构与生物学特性的三维中枢神经系统（CNS）模型。此前已有研究通过微加工技术在二维培养中实现了神经突与神经元胞体的分离生长。16,17 从而能够研究轴突束示踪、钙离子内流、神经网络结构及其活动。这一设想启发我们开发了一种三维极化神经组织，其中细胞体与轴突束位于不同的区域，模拟大脑的分层结构18我们的方法基于一种独特的丝素蛋白支架设计，该设计可在有限体积内容纳高密度细胞，并支持致密轴突网络向胶原凝胶中延伸生长。本文展示了类脑组织的完整构建流程，包括支架制备与神经元培养。

<table><tbody><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>223530</td><td></td></tr><tr><td>LiBr</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>MWCO 3500 透析盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔</td><td>66110</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>费舍尔科学</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>离心机 5804 R</td><td>艾本德</td><td></td><td></td></tr><tr><td>筛网</td><td>费舍尔科学</td><td></td><td>No. 270，No. 35，No. 30</td></tr><tr><td>PTFE 模具</td><td></td><td></td><td>自制（&lt;strong&gt;图1&lt;/strong&gt;），直径10 cm，高2 cm</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>5 mm 活检打孔器&amp;#160;</td><td>世界精密仪器</td><td>501909</td><td></td></tr><tr><td>2 mm 活检打孔器&amp;#160;</td><td>世界精密仪器</td><td>501908</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>P6407-5MG</td><td>终浓度 10&amp;#160;&amp;#956;g/ml，溶于水</td></tr><tr><td>PBS</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>D1283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>罗氏</td><td>10104159001</td><td>终浓度 0.3%</td></tr><tr><td>大豆蛋白</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>T6522-100MG</td><td>终浓度 1&amp;#160;mg/ml</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>吉布科</td><td>21103049</td><td>使用前预热至 37&amp;#160;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>B27 补充剂 50x</td><td>吉布科</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>吉布科</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>康宁</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源，100&amp;#160;mg</td><td>康宁</td><td>354236</td><td>终浓度 3&amp;#160;mg/ml</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>S2770</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>P4170-10MG</td><td>有毒</td></tr><tr><td>荧光素二乙酸酯</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>F7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯 MVX10</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>P6148</td><td>有毒，终浓度 4%</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;III微管蛋白抗体&amp;nbsp;</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>T2200</td><td>兔源，1:500</td></tr><tr><td>抗兔 Alexa-546</td><td>分子探针</td><td>A11010</td><td>山羊源，1:250</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>G9023-5ML</td><td></td></tr><tr><td>徕卡 SP2 共聚焦显微镜</td><td>徕卡</td><td></td><td>物镜 20X</td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>凯杰</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/蛋白质微量试剂盒</td><td>凯杰</td><td>80004</td><td></td></tr><tr><td>纯乙醇</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>E7023&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c/2000 紫外-可见分光光度计</td><td>赛默飞世尔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白测定试剂盒</td><td>赛默飞世尔</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪 Spectramax M2</td><td>分子器件</td><td></td><td>吸光度 562 nm</td></tr><tr><td>微型剪刀，经济型，Vannas 型</td><td>TedPella</td><td>1346</td><td></td></tr></tbody></table>

基于丝素蛋白-胶原的极化神经组织工程化三维模型

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

尽管人们付出了巨大努力来解析大脑的解剖结构、组成和功能，但大脑仍是人体中最不为人所理解的器官。为了更深入地理解神经系统，科学家们试图采用组织工程方法，将基本结构单元在体外（in vitro）进行组装，以简化的形式重建脑组织。我们课题组开发了一种基于丝素蛋白和胶原蛋白的组织工程三维类脑模型，该模型模拟大脑皮层的白质与灰质结构。该模型由多孔丝素蛋白海绵构成，预先接种了大鼠脑源性神经元，并浸没于柔软的胶原基质中。在此系统中可观察到极化神经元的突起生长及神经网络的形成，轴突与胞体分别定位于不同区域。这种区室化结构有利于形成模拟天然神经组织的微环境，从而支持对神经网络组装、轴突导向、细胞间及细胞-基质相互作用以及电生理功能的研究。

预先切割成环形的固体丝素蛋白海绵是一种独特且简单的方法，可实现类似神经组织的区室化结构（图 2A）。该支架具有高度多孔结构，孔径约为 500 µm，可在小体积内提供极高的表面积，从而支持高密度细胞的接种与生长（2×107/ml）（图 2B）。此外，支架的高孔隙率有利于营养物质和代谢废物的自由扩散，从而在较长时间内维持高密度细胞培养的优异存活率。接种后，神经元迅速且均匀地附着于支架孔壁表面。
细胞在丝素蛋白基质上完成贴壁并达到平衡后，向海绵支架中填充柔软的胶原基质，以提供轴突网络形成的三维环境（图3）。若无胶原基质，轴突与胞体的区室化无法实现，因为神经元仅在孔隙表面生长突起，导致形成如二维表面所见的混合网络（图3B）。相反，胶原凝胶形成一种网状结构，支持轴突在三维空间内广泛延伸，而神经元胞体仍附着于丝素蛋白支架上（图3C）。这种生长模式实现了胞体与纯轴突网络的区室化分布（图3D），类似于大脑皮层中的灰质与白质结构。
除了显微镜检查外，还可以根据实验背后的研究目的，采用多种其他方法对构建物进行评估18。例如，可使用商业试剂盒轻松地从构建物中提取DNA、RNA和蛋白质（图4）。每个构建物中核酸和蛋白质的得率取决于最初接种到丝素支架上的细胞数量。接种的细胞越多，DNA、RNA和蛋白质的得率越高。
<img alt="陶瓷皿尺寸示意图：直径 10 cm，高度 2 cm，材料研究装置。" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 用于制备丝素蛋白海绵支架的聚四氟乙烯模具。尺寸：直径 10 cm，高度 2 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="聚合物支架结构的显微图像，灰度与荧光图像；可见放大细节。" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 类脑三维组织模型。（A）多孔丝素蛋白海绵支架。（B）细胞接种于丝素蛋白支架后第1天、包埋胶原前的神经元活/死染色结果（绿色—活细胞，红色—死细胞）。右侧图示为红色框内区域的放大图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显微镜：水凝胶结构与纤维网络、荧光、细胞整合分析。" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 三维类脑组织模型中神经元的区室化突起生长。（A）支架区室：红色—胞体区室，蓝色—轴突区室。（B）接种后第1天、包埋胶原蛋白前的神经元生长模式。（C）接种后第7天胞体区室中的神经元突起生长。（D）接种后第7天轴突区室中的神经元突起生长。绿色—βIIITubulin。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="核酸和蛋白质定量图；支架上的RNA、DNA与细胞密度关系，n=5。" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 每个构建体中（A）RNA和DNA以及（B）蛋白质的预期产量与每个支架接种细胞数量之间的关系（±标准差，n=5）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

深入了解大脑复杂的活动需要先进的研究工具。在此，我们展示了一种基于丝素-胶原蛋白的新型三维神经组织工程模型，其结构类似于大脑组织。该模型可用于研究神经元网络的组装、轴突导向、细胞间相互作用以及电活动。

尽管人们付出了巨大努力来解析大脑的解剖结构、组成和功能，大脑仍是人体中最不为人所理解的器官。为了获得对……

本实验的总体目标是展示类脑三维组织的构建过程。首先，采用盐沥滤技术，利用丝素蛋白溶液制备多孔支架。第二步是将支架预切成环形，并通过灭菌及多聚赖氨酸（PDL）包被处理，为后续细胞培养做好准备。接下来，将 freshly isolated primary rat cortical neurons 接种到制备好的支架上。最后一步是将支架包埋于胶原中，并转移至培养板。最终通过免疫荧光显微镜观察神经生长及神经网络的发育情况。该技术的应用前景涉及脑部疾病治疗或诊断，因为该技术可作为开发帕金森病或阿尔茨海默病新型研究模型的基础。实验开始前，按照文本方案所述配制6%的丝素溶液，并在4摄氏度下保存。为制备多孔支架，首先对颗粒状氯化钠进行筛分，收集直径在500至600微米之间的颗粒。将30毫升丝素溶液倒入聚四氟乙烯（PTFE）模具中，然后均匀撒入60克过筛的氯化钠。在室温下孵育48小时，使丝素聚合。将含有模具的支架置于60摄氏度的烘箱中一小时，以完成丝素蛋白的交联并蒸发任何残留液体。随后，将模具与支架组合体浸入装有2升蒸馏水的烧杯中，持续48小时。为浸出盐分，每天更换水两到三次。将支架从模具中取出，并切成小块。首先使用直径为5 mm的活检打孔器，然后将支架切割至2 mm高，并用直径为2 mm的活检打孔器去除每块的中心部分。将支架在湿润循环条件下高压灭菌20分钟。在细胞培养超净台内，放置一对灭菌镊子、细胞培养基以及经高压灭菌的支架。取一个96孔板，拆去外包装后放入超净台中，用于接种支架。首先，每个孔中放置一个无菌支架。在96孔板中加入细胞培养基，使支架完全浸没，并于37摄氏度的组织培养孵箱中孵育至少30分钟以达到平衡。孵育结束后，吸去支架上多余的培养基。然后每孔支架中加入 2 × 10⁶ 个大鼠皮层神经元细胞，悬浮于 100 µL 神经基础培养基中。将培养板放回培养箱，过夜培养，使细胞贴附于支架上。次日早晨。小心吸去未贴壁的细胞，并加入 200 µL 新鲜细胞培养基。在 37°C 下短暂孵育。随后，使用无菌镊子从孔中吸去培养基。将含有细胞的支架转移至96孔板的空孔中，然后向每个支架加入100 µL新鲜稀释的冰上预冷的、浓度为3 mg/mL的大鼠尾尾胶原蛋白溶液。将细胞放回37°C培养箱中，孵育30分钟以使胶原蛋白聚合。从培养箱中取出培养板，每孔加入100 µL预热的细胞培养基，然后将培养板放回培养箱中，根据所需时间继续培养细胞。每天更换每孔中一半的培养基，补充新鲜培养基，持续培养最长可达一周。在这些高度多孔的支架中，神经元细胞可培养至所示的高密度。以下是细胞活力检测结果。接种后一天，荧光二乙酸酯标记的活细胞呈绿色，碘化丙啶和丝素蛋白支架可见。红色显示在低倍镜下观察到较高比例的活细胞。该图像展示了神经元胞体与轴突样结构在环形支架内的区域化分布。接种细胞一天后，神经元胞体仍附着在丝素蛋白支架上，经免疫荧光染色显示 βIII 微管蛋白呈绿色。如预期所示，培养至第7天时，细胞已密集占据支架。相比之下，支架中央中空区域的胶原基质为轴突的广泛生长提供了支持。图中显示的是轴突网络结构。接种后第7天。本视频展示了含有神经网络细胞的支架中央胶原窗口的共聚焦Z轴扫描，细胞通过βIII微管蛋白染色标记。观看本视频后，您应能充分理解如何构建类脑三维组织。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

极化神经组织工程三维蚕丝胶原蛋白为基础的模式

本视频展示了利用丝素-胶原蛋白支架构建三维极化神经组织模型的过程。详细介绍了在多孔丝素支架上接种神经细胞、孵育以促进细胞贴附、用胶原蛋白包埋支架的操作步骤，并强调了支持性胶原基质在形成三维极化神经组织模型中的重要作用。...

开发一种基于工程化丝素蛋白-胶原的极化神经组织三维模型

来源：Struzyna, L. A. et. al.，基于解剖学启发的三维微组织工程化神经网络用于神经系统重建、调控与建模。J. Vis. Exp.

利用基于水凝胶的微柱开发微组织工程化神经网络

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三维 体外 基于胶原支架的神经母细胞瘤仿生模型

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