Name: 微京尼平沉积技术的微模式化血管肌肉薄膜的扩展文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学习微流体沉积京尼平和纤连蛋白的方法，用于在PDMS基底上构建血管肌肉薄膜体外模型。该技术可维持血管平滑肌组织活性长达两周，为研究脑血管痉挛等血管功能障碍的机制提供可靠平台。

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我们感谢美国心脏协会科学家发展奖（13SDG14670062，PWA）和明尼苏达大学博士论文奖学金（ESH）提供的经费支持。同时感谢明尼苏达大学的明尼苏达纳米中心（MNC）提供的微加工资源，以及大学影像中心（UIC）提供的图像处理资源。本研究的部分工作在明尼苏达大学表征中心完成，该中心通过美国国家科学基金会（NSF）的材料研究科学项目获得部分支持。

注意：本方案的目标是构建并使用具有图1所示结构的血管肌性薄膜（vMTF），以评估血管平滑肌细胞（VSMCs）在PDMS基底上长期培养过程中的收缩功能。为了延长VSMCs的存活时间，我们采用交联剂化合物京尼平（genipin）。这些vMTF所用的基底设计基于Grosberg 等8提出的用于分析组织收缩力的方法。其他vMTF方法5也可使用，仅需对本文所述的基底制备方案进行细微调整。
1. 底物制备
<ol>
	<li>盖玻片清洗
	<ol>
		<li>将直径为25 mm的玻璃盖玻片放入盖玻片染色架中。将支架放入一个大烧杯或容器中（例如，一个空的100 - 1,000 µl 移液器吸头容器）。</li>
		<li>向容器中加入70%乙醇，完全浸没盖玻片。超声处理至少30分钟。</li>
		<li>将盖玻片架从乙醇溶液中取出。将支架悬挂在无菌培养罩内，使盖玻片自然晾干1-2小时（以防止颗粒物沉积在盖玻片上）。 
		注意：在进行后续步骤前，盖玻片必须完全干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在盖玻片上制备聚(N-异丙基丙烯酰胺) (PIPAAm) 条带
	<ol>
		<li>使用胶带将已清洗的盖玻片边缘覆盖，仅在盖玻片中央留出一条暴露的条形区域（图1A）。根据具体应用或微流控设计调整该暴露条带的宽度。</li>
		<li>使用实验标记笔在盖玻片上标记胶带边缘位置，以供后续参考（图1A）。</li>
		<li>沿盖玻片边缘切割，使其从培养皿中释放（图1A，红色虚线）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚(N-异丙基丙烯酰胺) (PIPAAm) 涂层
	<ol>
		<li>使用分析天平称取1 g PIPAAm粉末。切勿使用未聚合的N-异丙基丙烯酰胺，因其具有致癌性。</li>
		<li>将PIPAAm转移至一个50 ml离心管中。在通风橱内加入10 ml 1-丁醇，配制成10% w/v溶液。注意：1-丁醇的闪点为37 oC。将所得溶液储存于易燃品柜中，并避免加热。</li>
		<li>让PIPAAm溶解10分钟。若仍有粉末可见，使用涡旋混合器混匀，直至完全溶解。 
		注意：以下步骤需使用旋涂仪。对每一片盖玻片：</li>
		<li>用镊子将贴好胶带的盖玻片放置在旋涂仪卡盘上。</li>
		<li>将150 µl PIPAAm溶液滴加到盖玻片上，沿盖玻片中心暴露的玻璃区域均匀分布液滴，确保暴露区域完全覆盖。</li>
		<li>按照以下程序进行PIPAAm旋涂：
		<ol>
			<li>10秒内加速至3,000 rpm，保持5秒。</li>
			<li>10秒内加速至6,000 rpm，保持60秒。</li>
			<li>10秒内加速至3,000 rpm，保持5秒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将盖玻片放入带盖的培养皿中，使PIPAAm涂层朝上。静置自然干燥至少15分钟。</li>
		<li>小心地从所有盖玻片上去除胶带，使整个盖玻片暴露，仅在中央区域保留一层薄的PIPAAm涂层条带。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDMS涂层
	<ol>
		<li>按10:1的基础剂与交联剂比例混合并脱气15 g PDMS。在混合前加入7-8滴经超声处理的0.2 µm荧光微球。不使用时，用铝箔覆盖PDMS容器，防止灰尘和其他颗粒污染PDMS。 
		注意：以下步骤需使用旋涂仪。对每一片盖玻片：</li>
		<li>用镊子将已涂覆PIPAAm的盖玻片放置在旋涂仪卡盘上。</li>
		<li>将PDMS转移至盖玻片上，覆盖至少三分之一的盖玻片面积。</li>
		<li>按照以下程序进行旋涂：
		<ol>
			<li>5秒内加速至500 rpm，保持5秒。</li>
			<li>5秒内加速至1,000 rpm，保持5秒。</li>
			<li>10秒内加速至3,000 rpm，保持10秒。</li>
			<li>10秒内加速至4,000 rpm，保持60秒。</li>
			<li>10秒内加速至2,000 rpm，保持15秒。</li>
			<li>10秒内加速至1,000 rpm，保持10秒。</li>
			<li>5秒内加速至500 rpm，保持5秒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将盖玻片放入带盖的培养皿中，使PDMS面朝上。记录旋涂完成的时间。在整个实验过程中跟踪每片盖玻片的旋涂时间，以便后续用于确定PDMS基底厚度。</li>
		<li>将装有盖玻片的培养皿置于90 °C烘箱中至少1.5小时，以确保PDMS充分固化。若无烘箱，可在室温下静置固化至少48小时。</li>
		<li>从烘箱中取出盖玻片，并存放于避光抽屉中，待用。</li>
		<li>每第四片盖玻片保留下来，用于后续使用轮廓仪测量基底厚度，作为旋涂时间的函数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于组织工程的微流控图案化技术
<ol>
	<li>微流控装置的制备
	<ol>
		<li>组织微流控光掩模的设计
		<ol>
			<li>使用任何合适的计算机辅助设计软件设计微流控图案。对于由人脐动脉血管平滑肌细胞构成的动脉片层结构，采用10 µm通道与10 µm通道壁交替排列的图案。</li>
			<li>尽可能使用二进制通道分支17，但也可采用其他分支设计。在每次分支迭代中减小通道的宽度和长度，直至达到所需的组织图案间距（通道壁与通道，图1B）。</li>
			<li>设计装置时设置单一入口用于表面处理溶液的注入，以及单一出口用于施加真空。</li>
			<li>制备包含微流控设计的光掩模，方法如先前所述18。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>光刻晶圆制备 
		注意：应在合适的洁净室或类似设施中进行光刻操作。为通过光刻技术制备用于软光刻的组织微流控装置（通道高度约为20 - 25 µm），请按以下步骤操作：
		<ol>
			<li>将硅片分别在丙酮、甲醇和异丙醇中各清洗1分钟。使用氮气枪吹干硅片。</li>
			<li>将硅片置于热板上，在115 °C下预烘5分钟，以去除多余水分。</li>
			<li>使用以下程序在硅片上旋涂SU-8 3025光刻胶，以获得高度为20 - 25 µm的结构：
			<ol>
				<li>5秒内加速至500 rpm，保持5秒。</li>
				<li>15秒内加速至4,000 rpm，保持15秒。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>将硅片在热板上于95 °C下软烘15分钟。</li>
			<li>装载光掩模，并使用接触式光刻对准仪的真空接触程序对硅片曝光16秒。</li>
			<li>将硅片在热板上于95 °C下硬烘4分钟。</li>
			<li>将硅片在显影液中显影6分钟，随后用新鲜显影液冲洗两次，每次2秒，并用异丙醇冲洗硅片。</li>
			<li>通过将2 - 3滴十三氟三氯硅烷滴入真空干燥器内的空皿中，对图案化硅片进行过夜硅烷化处理。使用培养皿将硅片架起，使其顶部和底部均暴露于气体中。 
			警告：十三氟三氯硅烷为易燃且具腐蚀性的液体，使用时必须佩戴适当的个人防护装备并配备局部排风系统。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>组织微流控装置的制备
		<ol>
			<li>将硅烷化处理后的图案化硅片正面朝上放置于培养皿中。</li>
			<li>按10:1的基础剂与交联剂比例混合并脱气100 g PDMS。将PDMS倒入培养皿中，完全且均匀地覆盖硅片。</li>
			<li>将培养皿置于真空干燥器中，直至未固化的PDMS中所有气泡被去除（约30分钟）。将PDMS在90°C下固化至少1.5小时。可根据制造商指南调整时间和温度，以确保完全固化。</li>
			<li>PDMS固化后，使用剃刀片沿硅片边缘切割PDMS，并小心地将覆盖PDMS的硅片从培养皿中取出。清除硅片下方多余的PDMS，并缓慢从硅片表面剥离PDMS。</li>
			<li>将PDMS圆片正面朝上放置于洁净的培养皿中，使用后将硅片避光保存。</li>
			<li>使用剃刀片切除图案周围的多余PDMS。将装置切割成矩形（图1C），以便在后续步骤中更容易从基底上剥离装置。只要入口、出口及组织图案区域留有足够空间，切割精度无需过高（图1C）。</li>
			<li>使用1 mm外科活检打孔器打出入孔和出孔（图1C）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微流控装置的沉积 
	注意：本方案中，使用微流控递送方式沉积图案化的京尼平（genipin）——长期组织培养的关键交联剂，以及纤连蛋白（fibronectin）。在青霉素/链霉素灭菌步骤（2.2.3）之前的操作无需无菌条件，但建议在整个过程中尽量减少污染和灰尘积聚。自使用青霉素/链霉素对盖玻片进行灭菌（2.2.3）之后的所有步骤均应采用无菌操作技术。注意：本部分操作需在细胞接种前一天开始。
	<ol>
		<li>基底与微流控装置的准备
		<ol>
			<li>将微流控装置在70%乙醇中超声处理至少30分钟。</li>
			<li>使用加压空气或氮气吹干超声处理后的微流控装置，并将其放入培养皿中，通道面朝上放置，以避免结构特征受到不必要的磨损。</li>
			<li>将最多10个vMTF基底盖玻片放入UVO清洗仪中（移除盖子以使表面功能化），处理8分钟。</li>
			<li>取出经UVO处理的盖玻片，将微流控装置逐个正面朝下贴附于每个盖玻片上（方向应与图1C相似）。用力按压装置，确保其与涂有PDMS的盖玻片之间形成紧密密封。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>京尼平与纤连蛋白的沉积
		<ol>
			<li>通过将1 ml无菌ddH2O加入5 mg冻干京尼平中，配制5 mg/ml的京尼平溶液。使用涡旋混合器混匀溶液。室温静置至少30分钟。 
			注意：该粉末在室温下难以溶解，通常需要反复混合至少1分钟。</li>
			<li>迅速在每个装置的入口处滴加一滴70%乙醇以进行装置引液。注意：乙醇应能通过毛细作用流经装置。</li>
			<li>5 - 10分钟后，小心吸除入口处多余的乙醇，并立即用1X磷酸盐缓冲液（PBS）替换。自此之后，务必确保入口不完全干燥，以避免空气进入装置。</li>
			<li>在每个装置的出口处连接真空吸头，将1X PBS抽吸通过装置以洗去乙醇。在入口处保留少量1X PBS。注意：若入口处接近干燥，需补充更多1X PBS。</li>
			<li>吸除多余的1X PBS，仅在施加京尼平溶液前在入口处保留少量液体。</li>
			<li>在每个入口处加入60 μl的5 mg/ml京尼平溶液（图1D）。通过在出口处连接真空吸头，将京尼平溶液抽吸通过装置（图1D）。注意不要将全部溶液抽尽，应在入口处保留少量溶液。</li>
			<li>在入口和出口处各滴加一滴（约硬币大小）1X PBS，以维持孵育期间的湿润状态。将装有装置的培养皿转移至设定为37 °C的加湿烘箱或培养箱中（无需无菌环境），孵育4小时。培养皿无需加盖。</li>
			<li>在孵育期间，将纤连蛋白在冰上用无菌ddH2O重悬至浓度为50 μg/ml，至少预冷30分钟后再用于微流控装置。</li>
			<li>京尼平孵育结束后，吸除装置出口处残留的所有1X PBS。继续在每个装置出口处施加真空吸力，将入口处剩余的1X PBS抽吸通过装置。</li>
			<li>在每个入口处加入100 μl浓度为50 μg/ml的纤连蛋白溶液，加入时应与入口处残留的少量1X PBS混合（图1D）。</li>
			<li>通过在出口处使用真空吸头，将纤连蛋白溶液抽吸通过装置（图1D）。注意不要将全部溶液抽尽。注意：由于表面张力差异，纤连蛋白液滴的外观将与1X PBS和京尼平不同。</li>
			<li>将未加盖的培养皿转移至设定为37 °C的烘箱或培养箱中，孵育24小时。注意：纤连蛋白步骤无需在入口和出口处添加1X PBS保持湿润。入口处残留的纤连蛋白液池会自然干燥，此现象属正常。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>灭菌与细胞接种准备
		<ol>
			<li>配制用于图案化vMTF盖玻片灭菌的青霉素/链霉素溶液。将5 ml青霉素/链霉素（10,000单位/ml；10,000 μg/ml）加入500 ml无菌1X PBS中。</li>
			<li>将装有装置的培养皿放入无菌生物安全柜中。</li>
			<li>小心地从盖玻片上剥离装置：一手轻握盖玻片，另一手从一角缓慢揭起装置。注意：此步骤需要练习以减少移除过程中对盖玻片的损伤。替代方法是在入口和/或出口处用注射器注入1X PBS以辅助装置脱离。</li>
			<li>将盖玻片放入无菌六孔板中。每孔加入至少5 ml青霉素/链霉素溶液。将六孔板置于37 °C无菌培养箱中孵育至少30分钟。</li>
			<li>灭菌后，吸除青霉素/链霉素溶液，并在盖玻片上接种培养的人脐动脉血管平滑肌细胞19（图1D）。VSMCs的接种密度约为每平方厘米80,000个细胞。为减少每个样本所需的细胞数量，可使用限制器缩小接种面积。一种限制器示例是在接种前用无菌真空脂将15 ml锥形管的切顶部分固定于盖玻片上。</li>
			<li>将接种后的盖玻片置于37 °C、5% CO2的无菌培养箱中孵育，使细胞贴壁并过夜形成排列整齐的动脉片层模拟结构（图2A-B）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>长期vMTF组织培养
		<ol>
			<li>接种后一天，移除细胞培养基和限制器。用1X PBS冲洗组织。加入4 ml无血清细胞培养基，以诱导VSMCs呈现收缩表型20。</li>
			<li>根据长期培养需要，每隔一天重复一次1X PBS冲洗并更换新鲜无血清培养基。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Microfluidic delivery system diagram for cell seeding; includes device layout, flow channels, and vacuum." src="/files/ftp_upload/52971/52971fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 图1. 微流控蛋白质递送装置。（A） 用于PIPAAm包被的胶带覆盖盖玻片。红色虚线圆：切割路径，用于释放盖玻片。 （B） 组织微流控掩模图案的典型 AutoCAD 设计图。插图：交替二进制分支的细节 10 µm x 10 µm 组织模式 (C) 微流控装置置于盖玻片基底上，进样口和出样口已标明。 （D） 微流控蛋白质图案化与递送示意图。从左至右：微流控通道的扫描电子显微镜图像（比例尺： 50 µm）；蛋白质沉积方法的详细示意图；免疫组织化学染色显示纤连蛋白（比例尺： 50 µm细胞接种血管平滑肌细胞 (E) 所制备组织的示意图。1st 插图：分层结构的细节。2nd 插图：微流控沉积后京尼平修饰PDMS基底的细节。© IOP Publishing。经许可 reproduced 和/或修改。版权所有。19 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52971/52971fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
3. 使用vMTF收缩力测定法进行组织功能分析
注意：此处介绍的 MTF 收缩力测定方法参考了 Grosberg et al.8 所建立的技术。
<ol>
	<li>vMTF 收缩性实验
	<ol>
		<li>将组织样本置于一个 100 mm 培养皿中。加入已预热至 37 °C、pH 7.4 的无菌 1× Tyrode 溶液8，以完全覆盖样本。</li>
		<li>使用剃刀片在垂直于 PIPAAm 边缘的方向上进行数条平行切割。切割方式应使组织形成较宽的条带（即 vMTF，宽度约 2 mm），与较窄的条带交替排列（图 3A，侧向切割）。为获得整齐的切口，将剃刀片紧贴样本表面并向一侧用力拖动。</li>
		<li>将培养皿旋转 90°，在组织中央沿与 PIPAAm 条带平行的方向进行两条平直且相互平行的切割（图 3A，末端切割）。移除并丢弃两切割之间松动的组织条带以及 vMTF 之间的窄条组织（上一步切割所得），以防止相邻薄膜相互接触。</li>
		<li>让样本在室温下静置 10 分钟，或直至所有 PIPAAm 完全溶解。注意：若后续步骤中仍有 PIPAAm 残留，可将样本放回切割用培养皿中继续溶解。必要时，可轻轻刮除 vMTF 底面以促进 PIPAAm 去除。</li>
		<li>在洁净的 35 mm 培养皿中放置少量真空脂。加入 5 ml 新鲜无菌、37 °C 的 1× Tyrode 溶液。将带有切割后薄膜的盖玻片从 100 mm 培养皿转移至 35 mm 培养皿中，并压紧至真空脂上，以防止盖玻片移动。</li>
		<li>将培养皿置于体视显微镜载物台的温控平台上。</li>
		<li>在整个处理过程中，按预定时间间隔（例如，30 秒）连续采集透射光和荧光图像。</li>
		<li>依次对 vMTF 施加 50 nM 内皮素-1 处理 20 分钟（诱导收缩），随后施加 100 µM HA-1077 处理 30 分钟（组织松弛）。在指定时间点，将各处理试剂的浓缩溶液加入含有 5 ml 无菌 1× Tyrode 溶液的实验培养皿中，使最终体积为 5 ml 时达到目标处理浓度。加样操作应在时间序列图像采集的间隔期间进行，以避免移液枪头出现在图像中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>vMTF 收缩性分析
	<ol>
		<li>使用在 1.4.8 步骤中预留的盖玻片，用轮廓仪21测量 PDMS 基底厚度。针对每组盖玻片绘制厚度-旋涂时间曲线。利用该曲线估算收缩性实验中所用各盖玻片上 vMTF 的厚度。</li>
		<li>测量实验过程中每个时间点 vMTF 的投影长度，并采用已有报道的方法8计算相应的曲率半径（图 3B）。</li>
		<li>根据已有 vMTF 方法5计算每个时间点的 vMTF 应力。 
		注意：使用 3.2.1 步骤中估算得到的 vMTF 厚度。采用共聚焦图像测量 VSMC 厚度，方法见先前报道9。PDMS 的杨氏模量从厂家提供的数据表中获取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemomechanics+of+cerebral+vasospasm+and+its+resolution%3A+I.+A+new+hypothesis+and+theoretical+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework.</a> Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).</li>
<li>Hald, E. S., Alford, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+phenotype+switching+in+blast+traumatic+brain+injury-induced+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm.</a> Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).</li>
<li>Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+of+medial+hypertrophy+in+the+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta.</a> Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).</li>
<li>, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-241 (2000).</li>
<li>Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biohybrid+thin+films+for+measuring+contractility+in+engineered+cardiovascular+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle.</a> Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).</li>
<li>Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhodin%2C+JAG+%22Physiol.+Rev%22">Physiol. Rev</a>. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).</li>
<li>Balachandran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+induces+dual-mode+endothelial-mesenchymal+transformation+of+the+cardiac+valve%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).</li>
<li>Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembles+of+engineered+cardiac+tissues+for+physiological+and+pharmacological+study%3A+heart+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip.</a> 11, 4165-4173 (2011).</li>
<li>Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+contractility+depends+on+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).</li>
<li>Win, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+architecture+within+cell-dense+vascular+tissues+influences+functional+contractility%29%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility).</a> Integr. Biol. (Camb). , (2014).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio%2Fnon-bio+interfaces%3A+a+straightforward+method+for+obtaining+long+term+PDMS%2Fmuscle+cell+biohybrid+constructs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+B%22%5BJournal%5D)">Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs).</a> Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).</li>
<li>Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-+and+time-dependent+effects+of+genipin+crosslinking+on+cell+viability+and+tissue+mechanics+-+Toward+clinical+application+for+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair.</a> Acta Biomater. , (2013).</li>
<li>Lima, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genipin+enhances+the+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage+and+protects+against+inflammatory+degradation+when+used+as+a+medium+supplement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).</li>
<li>Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadhavan%2C+K+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. , (2011).</li>
<li>Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSatyam%2C+A+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22">J. Tissue Eng. Regen. Med</a>. , (2012).</li>
<li>Alford, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast-induced+phenotypic+switching+in+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).</li>
<li>Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+system+for+controlling+reaction+networks+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A microfluidic system for controlling reaction networks in time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+vascular+contractility+assay+using+genipin-modified+muscular+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films.</a> Biofabrication. 6, 045005(2014).</li>
<li>Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deprivation+results+in+redifferentiation+of+human+umbilical+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+thin+films+for+building+actuators+and+powering+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscular thin films for building actuators and powering devices.</a> Science. 317, 1366-1370 (2007).</li>
<li>Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+ordering+of+dense+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Biomechanical ordering of dense cell populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).</li>
<li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+in+hypertension%3A+roles+of+apoptosis%2C+inflammation%2C+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis.</a> Hypertension. 38, 581-587 (2001).</li>
<li>Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+aneurysms+and+variations+in+the+circle+of+Willis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis.</a> Stroke. 15, 846-850 (1984).</li>
<li>McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolded+gelatin+hydrogels+for+extended+culture+of+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues.</a> Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).</li>
<li>Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+vasospasm+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Time course of vasospasm in man.</a> 48, 173-178 (1978).</li>
<li>McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+maladaptive%2C+multiscale+remodeling+of+failing+myocardium+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).</li>
<li>Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+physiological+biomimicry%3A+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).</li>
<li>Meer, A. D., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种在先前开发的vMTF技术基础上改进的实验方案，可实现更长的实验时间，更符合慢性血管疾病通路的研究需求1,23,24。为实现这一目标，我们采用微流控沉积技术对京尼平进行微图案化处理，该物质此前已被证明可实现PDMS基底的长期功能化11，从而制备出具有改善血管组织存活率的工程化动脉层片，用于MTF收缩力实验。McCain et al. 在相关的MTF模型中，开发了一种替代性的微模制明胶水凝胶基底，可用于工程化心肌组织的长期培养，持续数周25。
该方案成功获得了能够模拟动脉层片结构的vMTF （图2） 和功能 （图3） 为期两周。成功完成本方案可实现疾病相关时间进程的延长培养时间，从而获得预期结果。例如， 持续长达14天的脑血管痉挛的病理效应26），会出现一些常见问题。PDMS微流控装置的重复使用会导致有害损伤，可能引起装置内分支部分或完全堵塞，因此每次实验必须使用新的装置。另一个问题...

血管疾病，例如脑血管痉挛1,2，高血压3，以及动脉粥样硬化4，进展缓慢，通常具有慢性特征，并涉及血管平滑肌细胞（VSMCs）产生功能障碍性的收缩力。我们旨在利用这些缓慢进展的血管功能障碍进行研究 体外 比以往更精细地控制实验条件的方法 体内 模型。我们此前已开发出血管肌层薄膜（vMTFs），用于测量功能性收缩力 体外 工程化心血管组织5但该方法仅限于相对较短时间的研究。在此，我们介绍一种基底修饰技术，可扩展我们先前的vMTF技术，以实现长期测量。
尽管内皮在整体血管功能中也至关重要，工程化的动脉层片为评估疾病进展过程中血管收缩功能的变化提供了一个有用的模型系统。为了构建一个功能性的血管疾病组织模型，必须高度保真地重现动脉层片的结构和功能，即血管的基本收缩单位。动脉层片是由弹性蛋白层分隔的、同心且周向排列的收缩型血管平滑肌细胞（VSMC）片层6。以往研究中，已通过将细胞外基质（ECM）蛋白微接触印刷到聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上来提供组织排列的引导信号，以模拟有序的心血管组织5,7-10。然而，采用微接触印刷技术构建的组织在培养3至4天后可能失去完整性，限制了其在慢性研究中的应用。本实验方案通过采用一种新型微流控沉积技术替代传统的微接触印刷方法，解决了这一问题。
Genchi et al. 使用京尼平对 PDMS 基底进行修饰，发现心肌细胞在培养中存活时间可延长至一个月11。本文采用类似方法，以延长在 PDMS 上图案化的血管平滑肌细胞的培养时间。京尼平是一种源自栀子果实的天然水解产物，与其他交联剂相比具有较低的毒性，并且在组织修复12,13和细胞外基质（ECM）修饰14,15领域作为生物材料的应用日益广泛，因此是基底修饰的理想候选分子。在本实验方案中，纤连蛋白被用作细胞导向信号，与以往的微接触印刷方法一致；然而，在纤连蛋白图案化之前，先将京尼平沉积到 PDMS 基底上。因此，当细胞降解图案化的基质时，贴壁的血管平滑肌细胞新合成的细胞外基质能够与京尼平修饰的 PDMS 基底结合。
本方案利用一种微流控递送装置实现二步法京尼平和细胞外基质的沉积。该微流控装置的设计模仿了先前研究中用于构建动脉层状结构的微接触印刷图案。16因此，我们预期该方案将获得成功模拟高度有序排列的动脉层状结构的仿生材料 体内 动脉层片的结构与收缩功能。我们还评估了组织的收缩性，以证实京尼平是一种适用于长期培养的合适基质修饰化合物 体外 血管疾病模型

<table><tbody><tr><td>盖玻片染色架</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com/&lt;/a&gt;</td><td>72239-04</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 - 25 mm</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td><td>12-545-102</td></tr><tr><td>聚(N-异丙基丙烯酰胺) (PIPAAm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/&lt;/a&gt;</td><td>#21458</td></tr><tr><td>1-丁醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td><td>360465</td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Specialty Coating Systems, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.scscoatings.com/">www.scscoatings.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷 (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives (Dow Corning)</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ellsworth.com/">www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td></tr><tr><td>荧光微球</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/&lt;/a&gt;</td><td>17151</td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>Wafer World, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.waferworld.com/">www.waferworld.com&lt;/a&gt;</td><td>2398</td></tr><tr><td>光刻胶&amp;nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.microchem.com/">www.microchem.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>接触式掩模对准器</td><td>Suss MicroTec</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.suss.com/">www.suss.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>显影液</td><td>MicroChem Corp.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.microchem.com/">www.microchem.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>十三氟三氯硅烷</td><td>UCT Specialties, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.unitedchem.com/">www.unitedchem.com&lt;/a&gt;</td><td>T2492</td></tr><tr><td>外科活检打孔器</td><td>Integra LifeSciences Corp.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltex.com/">www.miltex.com&lt;/a&gt;</td><td>33-31AA-P/25</td></tr><tr><td>京尼平</td><td>Cayman Chemical</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.caymanchem.com/">www.caymanchem.com&lt;/a&gt;</td><td>10010622</td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cellgro.com/">www.cellgro.com&lt;/a&gt;</td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Corning, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.corning.com/">www.corning.com&lt;/a&gt;</td><td>356008</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies, Inc.</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/">www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>脐动脉平滑肌细胞</td><td>Lonza</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lonza.com/">www.lonza.com&lt;/a&gt;</td><td>CC-2579</td></tr><tr><td>Tyrode's 溶液组分</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td><td>各种</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com&lt;/a&gt;</td><td>4350020000000000</td></tr><tr><td>温控平台</td><td>Warner Instruments</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.warneronline.com/">www.warneronline.com&lt;/a&gt;</td><td>641659; 640352; 641922</td></tr><tr><td>内皮素-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td><td>E7764-50UG</td></tr><tr><td>HA-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td><td>H139-10MG</td></tr></tbody></table>

微流控京尼平沉积技术用于微图形化血管肌薄层的长期培养

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

血管疾病进展的慢性特征需要开发能够在与疾病相关的时间尺度上模拟生理和病理血管行为的实验技术。此前，微接触印刷技术已被用于通过细胞外基质蛋白的图案化作为组织排列的引导信号，来构建二维功能性动脉模拟结构。血管肌肉薄膜利用这些模拟结构来评估功能性收缩能力。然而，通常使用的微接触印刷制备技术会引入疏水性的PDMS基底。当组织更新其下方的细胞外基质时，新合成的蛋白质必须发生构象改变或变性，以暴露疏水性氨基酸残基，从而与疏水性PDMS表面结合附着，这会导致基质蛋白生物活性的改变、基质剥离以及组织死亡。
本文介绍了一种用于图案化交联剂化合物京尼平（genipin）的微流控沉积技术。京尼平作为图案化组织与聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底之间的中介，可使细胞在更具亲水性的表面沉积新合成的细胞外基质蛋白，并保持与PDMS基底的附着。我们还证明，细胞外基质蛋白可直接图案化沉积在京尼平涂层上，从而调控工程化组织的结构。利用该技术制备的组织在血管肌肉薄膜模型中表现出高度保真的结构排列和血管平滑肌组织的收缩功能。该技术可拓展应用于其他细胞类型，为未来研究慢性组织和器官水平的功能提供了技术框架。

本研究的主要目标是延长微图形化血管平滑肌细胞在疏水性聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上的存活时间。通过整合微流控递送系统，在PDMS上沉积图案化的京尼平和纤连蛋白，实现了这一目标。 （图1）采用微流控递送方式沉积ECM蛋白，可实现基因素与纤连蛋白条带之间裸露PDMS区域的高保真通道图案转移 （图1D）贴壁细胞 （图1E） 形成融合的单层，模拟 体内 动脉薄片结构（图2），类似于以往的微接触印刷方法5,10,16这些组织产生了具有响应性和收缩性的构建物，其应力通过vMTF技术进行测量 （图3）.
在为期两周的过程中对组织活力进行的定性评估显示，经京尼平修饰的基底上组织退化程度最小（图 2A）。组织的汇合度与细胞排列在两周内均得以维持（图 2B、2C 和 2D）。针对每个 vMTF 计算了两个关键的应力值：1）基础...

我们介绍一种在聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上微流控沉积图案化京尼平和纤连蛋白的方法，可延长富含血管平滑肌细胞组织的存活时间。该组织制备方法与先前的血管肌肉薄膜技术相结合，用于在与疾病相关的时程内测量血管收缩力。

血管疾病进展的慢性特征要求开发能够模拟生理和病理血管...的实验技术

本实验的总体目标是建立一种体外平滑肌收缩功能模型，可用于在与疾病相关的较长时间尺度上研究血管功能障碍的机制，例如脑血管痉挛。该目标通过长期血管肌肉薄膜实现：首先，通过在盖玻片上依次旋涂一层 piam，再涂覆 PDMS，制备弹性体基底；第二步，使用微流控沉积装置在基底表面依次沉积 genin 和纤连蛋白。为了为血管肌肉薄膜上的组织自组织提供引导线索，最后一步是通过成像样本的同时诱导血管肌肉薄膜收缩和舒张，进行收缩力测定实验。最终，该方法可获得在培养条件下维持结构完整性和功能性收缩能力长达两周的组织。与现有的微接触印刷肌肉薄膜等方法相比，该技术的主要优势在于，组织完整性和功能性收缩能力可维持数周，而使用先前方法构建的组织在三到四天后即开始降解。在体外培养中，该方法为研究血管疾病中的关键问题提供了平台，例如在慢性疾病进展过程中动脉的功能力学如何发生改变。本文中我们研究的是血管力学，但该方法也可应用于其他模型器官系统，例如用于模拟心脏或骨骼肌功能的器官芯片技术。我们最初提出该方法的设想，是在致力于研究缓慢发展的血管功能障碍时，发现现有方法要么无法用于量化血管平滑肌细胞功能，要么无法在足够长的时间内维持组织完整性。金微流体沉积技术为细胞自组织提供了类似于微接触印刷的模板，同时还允许图案化组织在适合研究血管重塑的时间尺度上维持其结构和完整性。首先，按照随附文本方案中所述的方法清洗一批直径为25毫米的玻璃盖玻片，通过在盖玻片侧面贴上胶带覆盖其边缘，仅在中心区域暴露一条玻璃带。接下来，将盖玻片从培养皿上切割下来，并逐个放置到旋涂卡盘上。用镊子加入 150 µL 10% 的聚 N 异丙基丙烯酰胺（又称聚丙烯酰胺或 Piam）溶液，该溶液溶解于正丁醇中。确保完全覆盖盖玻片的暴露区域。然后开启旋涂仪，将转速在10秒内逐步升至3000 RPM。等待5秒后，再在10秒内逐步升至6,000 RPM。在6,000 RPM下保持1分钟，然后在10秒内逐步降回3000 RPM。在完成旋涂循环前，将其保持五秒钟。干燥后，小心地从所有盖玻片上移除胶带，使盖玻片完全暴露，并在玻璃盖玻片中心留下一层薄薄的 piam 涂层。接下来，将一层脱气的 PDMS 旋涂到每个盖玻片上。在90摄氏度的烘箱中滑动并固化至少1.5小时。根据随附的文字方案设计组织微流控光刻掩模，然后制备图案化硅片。图案化完成后，采用标准技术蚀刻硅片，并将其有图案的一面朝上放入培养皿中。接下来，将100克PDMS与交联剂按10:1的比例混合，将混合后的PDMS完全且均匀地倒入培养皿中，覆盖图案化硅片。将培养皿置于真空干燥器中抽真空约30分钟，直至所有气泡完全去除。随后，在90摄氏度下固化PDMS至少1.5小时。固化后，用刀片切除多余的PDMS，并从晶圆的图案面缓慢剥离剩余的图案化PDMS。使用剃须刀片切除图案周围的多余PDMS，将器件修整为矩形，以便后续步骤中更容易取出器件。接着，使用1毫米外科活检打孔器制备进样口和出样口孔洞。每次使用前，将微流控装置在70%乙醇中进行超声处理至少30分钟。将最多10个血管肌性薄膜基底盖玻片放入紫外臭氧清洗仪中处理八分钟。接着，通过向含有5毫克冻干明胶的容器中加入1毫升无菌双蒸水，配制5毫克/毫升的明胶溶液。使用涡旋混合器混匀溶液，将小瓶置于室温下静置至少30分钟。将清洗后的微流控器件功能面朝下放置在每个盖片上。每次插入一个。用力按压装置，确保其与涂有PDMS的盖玻片之间形成紧密密封。迅速在每个装置的入口处滴加一滴70%乙醇，以对装置进行预润。五到十分钟后，小心吸除入口处多余的乙醇，并立即替换为约100 µL的PBS。使用真空泵将 PBS 从装置的入口抽吸至出口，以冲洗乙醇。当入口处仅剩少量 PBS 时停止。然后在每个入口处加入 60 微升浓度为 5 毫克/毫升的甘氨溶液，通过装置抽吸甘氨溶液，并在出口处更换真空吸头。当入口处仅剩少量溶液时，停止抽吸。随后在入口和出口处分别滴加数滴PBS，以防止溶液干燥。孵育期间，将装有装置的培养皿转移至设定为37摄氏度的湿润烘箱或培养箱中，孵育四小时。孵育期间，将纤维连接蛋白用无菌双蒸水重悬至浓度为50微克/毫升，并在与Jin孵育后置于冰上至少30分钟。通过入口处用少量PBS冲洗，但仅使用最小量的PBS。接着，在入口处加入100微升浓度为50微克/毫升的纤维连接蛋白溶液。在每个入口处，使用真空吸液管尖端将溶液抽吸通过装置。在出口处，将装有装置的敞口培养皿转移至设定为37摄氏度的烘箱或培养箱中，孵育24小时。孵育结束后，用一只手轻轻握住盖玻片，另一只手从装置的一角缓慢剥离，小心地将装置从盖玻片上取下，并将盖玻片放入无菌的六孔板中。向每个孔中加入至少五毫升青霉素-链霉素溶液，然后将培养皿置于37°C的无菌培养箱中孵育至少30分钟。灭菌后，吸除青霉素-链霉素溶液，并将培养的人脐动脉血管平滑肌细胞以每平方厘米80,000个细胞的浓度接种到盖玻片上。在检测前，将细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育至少24小时。开始检测时，将组织样本置于直径100毫米的培养皿中。加入pH值为7.4的无菌预热台氏液以覆盖样本。使用剃刀片沿垂直于管道臂边缘的方向，在细胞层上做数道平行切口。进行切割，获得约两毫米厚的较宽组织切片。这些切片将形成血管肌薄膜，与后续需去除的细条状组织交替排列。然后将培养皿旋转90度，并在组织中间沿软脑膜条平行方向做两条笔直且相互平行的切口。移除血管、肌肉性薄膜之间纤细的条状组织，以防止相邻薄膜相互接触。随后将培养皿置于体视显微镜载物台上的温控平台上，并在处理实验过程中按所需时间间隔连续采集延时、透射光及荧光图像。依次对血管肌肉性薄膜进行处理：先加入50 nmol的内皮素作用20分钟以诱导收缩，随后加入100 µmol的HA 1077作用30分钟，在温度降至32°C以下时诱导其松弛。匹氨溶解后释放出血管平滑肌薄膜。投影长度的测量值可转换为曲率半径，用于计算该细胞层在薄膜上的平均应力，如本图中代表性收缩力检测的连续透射光图像所示。这些图像可进一步转换为应力值，据此计算基础张力和诱导性收缩力。本视频展示了一次完整的收缩力检测的代表性延时过程。肌肉薄膜达到收缩平衡后，在加入50纳摩尔内皮素时进一步收缩。在加入100微摩尔ha 10 77后，薄膜松弛。在实验结束时，基础张力和组织收缩能力的轻微下降很可能是由于构成组织的细胞数量减少所致。由于血清饥饿的血管平滑肌细胞不会增殖，因此此处显示的是在明胶修饰表面上培养的平滑肌细胞在不同处死时间点（从一天到两周）的相差显微图像。通过免疫组织化学方法对F-肌动蛋白丝（染成绿色）进行染色，以突出显示组织在血清饥饿一天、四天和七天后的细胞汇合度和细胞排列情况。在此时间段内对组织融合度进行的定量评估显示，这些表面的组织退化程度极小。对F-肌动蛋白丝的排列进行了量化，结果证实其排列在两周内保持稳定。在培养过程中，一旦掌握该体外组织制备技术，可在两天内完成操作。进行该操作时，需注意在预计接种细胞的前一天开始微流控沉积，并在薄膜实验过程中保持恒定的生理温度。按照本方案操作后，可采用传统的生物化学方法（如蛋白质印迹和PCR）来研究蛋白质和基因表达的变化，从而将细胞表型与功能行为相关联。该技术为研究人员探索缓慢发展的血管功能障碍（如脑血管痉挛、高血压和动脉粥样硬化）以及构建人动脉壁的体外模型提供了途径。

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微京尼平沉积技术的微模式化血管肌肉薄膜的扩展文化

在本方案中，我们演示了该技术所基于的垂直位移微柱阵列微致动器的制备方法，并介绍了如何对该基础技术进行改进，以在二维和三维培养模式下实现高通量的力学动态细胞培养。...

用于力学动态细胞培养的微加工平台

本文描述了利用数字微镜装置在常规细胞培养基底上进行动态掩模投影光刻，快速制备微加工神经培养系统的简单技术。这些培养系统可能更接近天然生物结构，且所述技术可针对多种应用进行调整。...

使用动态掩模投影光刻技术制备用于神经培养系统的微图案化水凝胶

一种在具有微血管尺寸通道的微流控装置整个内部三维表面培养内皮细胞单层的方法&lt;30 μm）被描述。 这一 体外...

用于研究血液系统疾病中微血管相互作用的内皮化微流控技术

一种微通道芯片平台通过结合光刻可重铸光刻胶技术、软光刻技术和微流控技术而开发。该内皮化微通道平台可模拟三维（3D）几何结构 体内...

多深度圆形截面血管内皮化微通道芯片的制备方法

在微流控装置中构建功能性微组织需要通过将传统细胞培养技术适应微器件的有限空间尺寸，以稳定细胞表型。对胶原蛋白进行修饰可实现超薄胶原组装体的逐层沉积，从而在微流控组织模型中稳定原代细胞（如肝细胞）。...

逐层胶原沉积微流控装置用于微组织稳定化

本文介绍了一种采用注塑成型的方法来构建具有内皮生理特性的微血管。该基于微流控的技术可生成通畅的三维血管网络，并可调节流动、细胞组成、几何结构和生化梯度等参数。文中描述了该制备工艺及若干潜在应用示例。...

三维微血管的微图形化与组装

本方案概述了采用图像引导的激光降解技术，在聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶中构建源自血管、具有仿生特性的微流体网络的方法。此类仿生微流体系统可应用于组织工程、组织构建 体外...

基于影像引导的激光制造血管衍生微流体网络

我们提供一种基于微流控生物打印策略的通用方案，用于构建微纤维血管床，其中可进一步将第二种细胞类型接种于该微纤维结构的间隙空间，以生成带血管化的组织和类器官。...

用于构建血管化组织和类器官的微流控生物打印技术

该方案描述了如何在球状体中构建可灌注的血管网络。通过设计球状体周围的微环境，可诱导血管生成，并将球状体与微流控装置中的微通道连接。该方法实现了对球状体的灌注，这是三维培养领域长期期待的技术。...

微流控装置中具有组织模型的可灌注血管网络

本文提供了一种微流控芯片及一种可自动控制、高效循环的微流控系统，可重现血管新生的初始微环境，使内皮细胞（ECs）同时受到高管腔剪切应力、生理水平的跨内皮流动以及不同分布的血管内皮生长因子（VEGF）的刺激。...

模拟新生血管化初始事件的微流控模型

在此，我们介绍一种利用微加工微流控平台构建三维简化且未分化的皮肤模型的实验方案。通过平行流动方法，可实现 原位 通过注射泵控制，在真皮层隔室上沉积以供上层接种上皮细胞。...

在微加工微流控平台中构建简化的三维皮肤芯片模型

学习微流体沉积京尼平和纤连蛋白的方法，用于在PDMS基底上构建血管肌肉薄膜体外模型。该技术可维持血管平滑肌组织活性长达两周，为研究脑血管痉挛等血管功能障碍的机制提供可靠平台。

微流控京尼平沉积技术用于微图形化血管肌薄层的长期培养

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