小鼠原代肝细胞中脂肪酸氧化与脂质生成的测定

本实验的总体目标是评估原代小鼠肝细胞中的脂肪酸代谢。首先用消化培养基灌注小鼠肝脏并将其取出，随后分离肝细胞，以此实现该目标。第二步是在胶原包被的培养板上培养肝细胞。

接下来，将肝细胞进行待检测的实验干预处理。最后一步是在存在放射性标记底物的情况下孵育细胞。最终，通过液体闪烁分析来显示各种药理学或遗传学干预对原代肝细胞中脂肪酸氧化或脂质生成的影响。

该方法有助于解答代谢与糖尿病研究领域中的若干关键问题，包括特定的药理学和遗传学干预如何影响肝细胞生物学特性。对该方法进行可视化演示至关重要，原因有二：一是影响肝细胞活性的特定灌注条件较难获得，二是需要对释放的二氧化碳进行定量分析。

气体的性质并不直观。本实验操作将由我实验室的研究生 Tom Akey 进行演示。将无菌管的一端放入预热的肝脏灌注培养基中，另一端放入废液容器中，以完成蠕动泵的安装。

运行泵直至整段管路充满培养基。在处死目标小鼠后，用70%乙醇充分喷洒小鼠腹部。然后使用钝头剪刀沿腹部中线切开皮肤，切口长度与腹部相当，并将皮肤向两侧翻开。

在腹膜上做一类似切口以暴露内脏。使用钝器轻柔地移开肠管。为暴露腹部血管系统，找到下腔静脉腹段，在肾静脉远端的血管下方穿过缝线，并在缝线远端操作。

将针头和导管插入下腔静脉，并推进至结扎线远端。保持针头位置不变，用缝线在导管周围打结以固定其位置，然后小心移除针头。若操作正确，血液将通过导管流入移液管。

用灌注液填充导管的剩余部分，并确保其中无气泡存在。然后小心地将管路连接至导管。接着，使用尖头剪刀谨慎刺穿膈膜，并做一侧向切口以暴露胸膜腔。

注意避开胆囊和胸膜血管，在肝静脉近端处的胸腔下腔静脉上放置一个 bulldog 夹。然后剪断门静脉，并以每分钟 3 至 4 毫升的速度启动泵。使用约 20 毫升灌注液，以肝脏灌注培养基对肝脏灌注 5 分钟。

在此期间，观察肝脏颜色由红色迅速变为灰褐色。若肝脏部分区域仍呈红色，则表明灌注效果不佳，成功分离的可能性将显著降低。完成五分钟灌注后，停止泵流，将管路转移至肝脏消化液中。

重新启动泵，以每分钟3至4毫升的速度继续灌注肝脏10到15分钟，直至灌注液耗尽。灌注结束时，停止泵的运行。

肝脏应呈粉红色，且看起来略有肿大。此时，应通过仔细解剖切除肝脏。将其转移至一个10厘米的组织培养皿中，并移除胆囊。

接下来，向肝脏中加入10毫升铺板培养基，开始用手术刀轻轻刮取肝脏。为分离肝细胞，使用孔径100微米的细胞滤网过滤悬液，并将其转移至50毫升锥形管中。用额外的10毫升铺板培养基冲洗培养板，并将液体吸入50毫升锥形管中。

然后在 4 摄氏度下以 350 × g 离心 5 分钟收集细胞，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 毫升铺板培养基中。接着，轻轻加入 10 毫升涂覆有聚乙烯吡咯烷酮的 90% 胶体二氧化硅，混匀后再次按前述方法离心收集细胞。离心后，吸除混合物顶部漂浮的死细胞层。

然后用20毫升铺板培养基将活细胞沉淀洗涤两次。将最终的细胞沉淀重悬于10毫升铺板培养基中，使用血细胞计数板计数细胞，并将每孔90,000个细胞接种至胶原蛋白包被的24孔培养板中，在开始实验前，于37°C和5% CO₂条件下孵育2小时，或孵育16至20小时。

用预热的PBS洗涤细胞两次，并将细胞更换至无血清的饥饿培养基中，培养基中加入20纳米的胰高血糖素。在检测当天早晨之前，于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育过夜。

配制预孵育培养基，然后更换为无血清饥饿培养基。将细胞在此混合培养基中于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育2小时。

在孵育结束前约15分钟，通过氮气蒸发使每个孔中的0.5微居里C14棕榈酸酯干燥。将C14棕榈酸酯用0.1 N氢氧化钠溶液重悬，用量为每微居里12.5 µL，于70 °C孵育10分钟。然后加入三倍体积的预热孵育培养基，通过移液上下吹打混匀。

通过轻轻摇动培养板，向每个孔中加入 25 微升稀释的 C 14 棕榈酸混合物，并在 37 摄氏度下孵育 90 分钟。此板即为检测板。在孵育期间，取一个无菌的 24 孔板，移除盖子，在每个孔底部放入一块 2 厘米 × 2 厘米的滤纸。然后使用一个大型矩形物体（如移液器吸头盒）将一块 4 英寸 × 7 英寸的帕拉膜覆盖在板上。

用多孔板上的孔摩擦对位膜，使对位膜在孔口处穿孔，并在板的其余部分形成密封。然后移除穿孔的对位膜圆片。现在，在孵育结束前10分钟覆盖各孔，向滤纸板的每个孔中加入200 µL的三当量氢氧化钠，确保滤纸完全吸收所有液体。

孵育结束后，将检测板在液氮中迅速冷冻。接着，向检测板的每个孔中加入100 µL 70%高氯酸。立即用滤纸板覆盖，并将板置于轨道摇床上。

将培养板在室温下以80 RPM的转速振荡两小时。然后通过将滤纸片转移至含有4毫升液体闪烁液的闪烁瓶中，测量二氧化碳的含量，并使用闪烁计数器检测C 14信号以测定酸可溶性物质。取400微升培养基转移至1.5毫升微量离心管中，在最大转速下离心10分钟，然后将100微升上清液加入500微升氯仿与甲醇按2:1比例配制的混合液中。

短暂涡旋混合物，然后向混合物中加入250微升水并再次涡旋。再次以1000 × g离心样品10分钟。随后将上层相的200微升转移至含有4毫升液体闪烁液的闪烁瓶中，并在细胞血清饥饿处理后检测C 14信号。将细胞更换至脂肪生成培养基中。

加入待检测的任何目标化合物，37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育细胞2小时。孵育结束后，用PBS洗涤细胞两次，然后每孔加入120微升0.1 N盐酸裂解细胞。用细胞刮刀刮取各孔以释放裂解液，随后将100微升裂解液转移至1.5毫升微量离心管中。

接下来，向每根试管中加入 500 µL 氯仿与甲醇按 2:1 比例配制的混合液。短暂涡旋振荡，然后在室温下孵育 5 分钟。孵育结束后，加入 250 µL 水，涡旋振荡，再将样品在室温下额外孵育 5 分钟。

然后以3000 ×g离心样品10分钟。小心将分离后液体的下层转移至含有4毫升液体闪烁液的闪烁瓶中，并使用闪烁计数器测定氚的放射活性。该步骤通常可从每只小鼠分离得到1000万至3000万个肝细胞。经过过夜培养后，健康的细胞呈六边形，其中许多细胞含有细胞核。

不健康的细胞培养物通常含有颗粒物或出芽泡，这些是细胞死亡的标志。此处展示了一项脂肪酸氧化实验的结果，通过比较添加F-C-C-P-A细胞呼吸促进剂和呼吸抑制剂寡霉素与溶剂对照组，以测定完全氧化水平。计算了二氧化碳与酸溶性物质的比值。

促进细胞呼吸的物质（如FCCP）会使得该比值向二氧化碳方向偏移，表明三羧酸（TC.A）循环中的氧化作用增强。当检测时，呼吸链的抑制剂会整体降低氧化水平。对于脂质活性化合物而言，能够增强脂肪酸氧化的物质（如FCCP）或减少ATP合成的物质（如寡霉素），与溶剂对照组相比，会降低培养的肝细胞中的脂质活性。在进行该操作时，重要的是确保在动物处死后立即并充分地完成灌流过程。

此外，在进行脂肪酸氧化检测时，培养基的完全冻结对于二氧化碳气体的可重复测量至关重要。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离原代肝细胞，并利用这些细胞在体外分析脂肪酸氧化和脂质生成。