观察脉络丛上皮细胞的纤毛运动 离体

本实验的总体目标是分析脉络丛上皮细胞纤毛在体外的运动情况。首先从鼠胚或幼鼠体内取出脑组织，以分离脉络丛组织。通过微分干涉差（DIC）显微镜观察纤毛运动，随后获取纤毛尖端的数字录像，用于人工追踪纤毛尖端的位置。

最终，根据运动模式对纤毛尖端重建后的运动进行分类和量化。该方法有助于回答细胞生物学中的关键问题，例如：发育过程中纤毛的活动性是如何调控的，以及其运动模式随时间如何变化？这些技术的应用范围延伸至病理生理学分析与诊断。

由于我们对叙利亚相关疾病的动力学理解仍处于初步阶段。断头后立即将经70%乙醇冲洗的新生小鼠头部置于无菌10厘米培养皿中的冰冷Leibovitz L-15培养基中。接下来，使用一对钟表镊从颅骨上移除头皮。

然后沿矢状缝纵向切开颅骨以暴露脑组织，接着切断颅神经以完整取出脑器官。将分离出的脑组织转移至一个新的培养皿中，皿内盛有新鲜的冰冻冷培养液，使脑组织背侧朝上，并将培养皿置于体视显微镜下。调整组织方向，使嗅球位于三点钟位置，然后用钟表镊轻轻夹住脑组织。

用另一只手使用精细解剖镊子切断连接大脑半球与脑干的大脑脚。捏住头端脑部以进一步分离半球，并将切面朝上放置，随后牵拉软脑膜以去除附着在海马侧缘的侧脑室脉络丛。当脉络丛被分离后，将组织转移至含有新鲜培养基的35毫米玻璃底培养皿中，并在安乐死后25至60分钟内，用组织固定器轻轻压住组织使其固定。随后通过肉眼调节物镜焦距，开始对脉络丛上皮细胞的纤毛进行活体成像。

调节聚光镜，使其中心和焦点与科勒照明相吻合。然后将适当的光学元件插入光路，以符合微分干涉差（DIC）光学系统的要求。移动DIC棱镜，调节图像对比度至能够清晰识别组织表面结构的位置。

然后将光路切换至视频相机，并增加光照强度。移除中性密度滤光片后，调整观察视野并聚焦，将视频相机的时间分辨率为200赫兹，曝光时间设置为0.1毫秒，以满足所需的成像时长。在获取图像序列后，每个单帧将清晰显示纤毛，可手动追踪每根纤毛的摆动模式。

使用鼠标指针标记每一帧中纤毛尖端的位置。然后利用适当的软件分析轨迹数据，并通过肉眼将轨迹分类为两种运动模式之一：来回运动或旋转运动。根据公式，计算多个纤毛搏动周期的纤毛搏动频率。

由于同一细胞上的其他纤毛可能干扰单根纤毛的运动，接下来分析单个细胞内纤毛摆动轴的角度均匀性。对于来回运动的轨迹，将纤毛尖端的位置拟合为一条直线，并定义θ为该直线与X轴的夹角。

对于旋转轨迹，将位置拟合到一个椭圆上，并将 theta 定义为椭圆长轴与 x 轴之间的夹角。最后，为了对每条轨迹进行定量描述，将轨迹绕 theta 旋转，并将其纵横比定义为轨迹在 x 轴和 y 轴方向上分布宽度的比值。在第一个视频片段中，展示了出生后两天小鼠幼崽的脉络丛上皮细胞的顶面视图，通过高速视频显微镜成像可见，脉络丛组织的不规则表面使其在焦点内和焦点外平面均清晰可见。

在第二个视频片段中，展示了前一个视频中框选区域的放大视图，以便更仔细地观察单个纤毛所表现出的旋转运动和来回运动。此处呈现了从多个周期的视频记录中重建的代表性纤毛尖端运动轨迹，并在图中绘制了尖端位置 x 和 y 坐标随时间变化的曲线。为了展示这两个坐标之间的相位差，图中对 x 和 y 坐标进行了归一化处理并进行了叠加。

尽管运动型CLIA可通过活体成像轻易识别，但用此方法识别非运动型CLIA并不容易。为克服这一困难，扫描电子显微镜对于获取无论其运动性如何的CLIA整体图像都可能是不可或缺的。在进行该操作时，重要的是需牢记应迅速完成解剖，以保持样品的新鲜度并维持叙利亚仓鼠（Syria）的运动能力。

观看本视频后，您应能够充分了解如何使用病毒性麦芽糖制备组织样本，以及如何监测和量化CX活体外的死亡率。