啮齿类动物脑部微量注射研究动机行为的分子基础

本实验的总体目标是精确制备套管和微注射器，并正确执行微注射操作。首先，需将套管制备成适当长度，以实现这一目标；第二步是切割并组装微注射器。

接下来，准备显微注射仪、导管和用于显微注射的泵。最后一步是完成显微注射，并等待一段扩散时间。最终，显微注射可用于将试剂精确注入目标脑区，以展示正确的操作方法。

显微注射操作将由我实验室的学生 Ryan Poland 完成。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为必须格外小心，每一步骤都需要高度专注，以确保导管放置位置和显微注射位点的准确性。首先准备导管：使用细头笔在胶带上画一条15毫米的参考线。

然后使用该标记作为引导，用锐利的永久性记号笔在导管上依次标出15毫米的段落。接下来，将导管轻触旋转工具上缓慢转动的切割片，进行切口。在已标记的位置，将导管旋转180度，并在导管的对侧进行切口。

不要完全切断导管，以免造成堵塞。随后，将导管剧烈弯折，使其断裂成15毫米的节段。然后用拇指和食指将套管的每一端垂直夹在切割片上。

将套管导管的管端在截断的圆盘表面轻轻旋转摩擦，以形成钝端。随后，使用26号斜面针头对套管的两端进行扩孔，以确保彻底去除毛刺并保证套管通畅无阻。为制备针芯，取一个套管在其中段位置用中等重量的直止血钳夹紧，将已锁定的止血钳平放在实验台上，使套管与实验台呈垂直方向。

然后将阿托导丝的一端插入套管，直至导丝到达操作台面。用手指捏住导丝弯曲，使导丝形成30度角，同时保持穿刺针芯与操作台面接触。随后将导丝从套管中取出，并用小型斜口钳在弯曲处近端2.5毫米处剪去多余部分。

在此操作中，使用一把锁定的直止血钳垂直夹住微注射管的一端。在保持管路张力的同时，扭转止血钳，并将管路紧密缠绕在止血钳上至少一圈。接着，从微注射管另一端的自由端量取32毫米，用第二把止血钳垂直夹住该位置。

保持张力的同时反复弯折导管，直至其断裂。然后检查显微注射导管，确保两端平直，且内径无阻塞。在卷尺上用记号笔画一条5 mm的参考线，并依次标记套管导管上每5 mm的分段。

接下来，将套管软管接触已标记位置的缓慢旋转的切割片，以在软管上刻出凹槽。然后迅速弯曲微注射器套管软管，将其折成五毫米长的小段。将一个套管从微注射器管末端约两厘米处滑入，套在每根微注射器管上。

在微注射管的一端距末端五毫米处涂抹少量超级胶水。接着，将套管滑过胶水珠，使其位于微注射管末端一毫米处。然后，用胶水覆盖套管的两端。

然后将一个26号针头连接到装有无菌水的1毫升注射器上。将8厘米长的微量注射器塑料管滑到针头上，注意不要刺穿管子，之后将塑料管的另一端套在干燥的微量注射器的套管端。推动注满水的注射器活塞，以检测通路是否通畅。在此步骤中，从与套管端相对的一端起15毫米处，将组装好的微量注射器弯曲95度。

接下来，将塑料导管剪切成70厘米长，并将其套在显微注射器的套管上。为准备用于显微注射的泵，请在泵管上设置显微注射针的直径、期望输注速率和目标注射体积。然后将泵模式设为体积模式，以便自动精确输送指定体积。

接下来，调整泵的限位器，使注射器能够吸入注射体积外加额外0.2微升的液体。现在将气密注射器的针尖插入盛有无菌水的小型移液船中，并轻轻抽动活塞，以均匀润滑内部金属丝。将泵上的活塞拉至限位器位置，用水充满显微注射针。

下一张幻灯片。将连接到微注射器上的PE 20管连接至一支装有1毫升无菌水的一次性无菌注射器的26号针头上。通过微注射器喷出无菌水，观察喷雾的模式和喷射距离。

然后将已灭菌的微量注射器放置于无菌区域。将管路从针头滑脱，保持注射器直立以防液体滴出，于针头损伤部位下方剪断管路。接着，轻微推动微量注射器的活塞，使针头末端形成一滴液体，再将充满水的PE 20管路套入针头。

随后，将推杆完全向前推动，以准备样品加载，并确保微量注射器中无任何乙醇残留。通过用干净的实验室擦拭纸多次接触微量注射器尖端形成的水滴，检查装置是否漏液。然后将注射器推杆向后拉动 0.2 微升，以在无菌水与 PE 20 管路及待注射溶液之间形成一个气泡。

然后，将微量注射器插入待注射的试剂中，缓慢向后拉动注射器活塞至限位处。为准备动物注射，将大鼠的胸部紧贴实验者的胸部。用浸有聚维酮碘的棉签清洁套管周围的区域。

用碘伏擦拭套管帽三次，然后用乙醇擦拭两次。接着将装满液体的微量注射器插入套管中。启动微量注射泵，并观察气泡的移动情况。

注射完成后，将微量注射器从套管中取出，并换上封闭栓。该图显示通过微量注射病毒转染伏隔核星形胶质细胞区域的结果，该图显示通过激活在伏隔核中过表达的转基因，显著降低了大鼠自我给予乙醇的动机。在戒断后，通过系统给予CNO激活伏隔核核心区星形胶质细胞位点中的DREADD，与给予溶剂CNO的对照组相比，显著降低了大鼠自我给予乙醇的动机；而在另一组经过同等训练、表达GFP而非DREADD的大鼠中，CNO无此效应。

该技术可实现定制化的脑部微量注射工具，并为实验操作提供更大的灵活性。在进行该操作时，必须牢记精确的微量注射定位对于实现预期效果至关重要。