参考微量稀释法达巴万星体外细菌敏感性测试生长有氧
September 9th, 2015
在这里，我们提出了一种使用肉汤微量稀释参考方法测定临床相关革兰氏阳性菌的达巴万星敏感性的方案。
以下程序的总体目标是确定 dalbavancin 的最低抑制浓度。使用肉汤微量稀释方法，重点关注 Dalbavancin 独有的关键步骤来实现这一点。在 DMSO 中制备 dalbavancin 的储备液和中间稀释液，并在补充有聚山梨酯的调整后的 Mueller Hinton 肉汤中用阳离子进行最终稀释。
将稀释液分配到 96 孔板中，并接种标准化的细菌悬浮液。然后将板孵育 16 至 24 小时并检查以确定抑制细菌生长所需的达巴万星的最小量。坚持这种标准化方法将确保两种临床分离株的结果一致，并且如此处所示，质量控制分离株 Dalbavancin 是一种半合成脂糖肽抗菌剂，于 2014 年 5 月被 FDA 批准用于治疗由革兰氏阳性菌引起的急性细菌皮肤和皮肤结构感染。
该方法描述了 dassin 的标准化肉汤、微量稀释敏感性方法，其中包括使用 DMSO 制备聚山梨酯 80 中的储备液，以减轻试剂对塑料的粘附该方法的视觉演示是有帮助的。因为与大多数抗菌剂相比，储备液和 MIC 板溶液的制备步骤并不典型。这些步骤是脂糖肽试剂所独有的，为了获得可重现和准确的 MIC 结果，必须遵循这些步骤。
演示该程序的是我实验室的研究科学家 Gina Fisher。请注意，在执行以下程序时，应采用符合生物安全 2 级的适当安全预防措施。首先称取适量的达巴万星，制备每毫升 800 微克的储备溶液。
将适量的 NEAT DMSO 加入无菌玻璃管或塑料管中，然后将粉末转移到管中并涡旋。下一个。使用 800 μg/mL DALBAVANCIN 储备溶液，制备 100 x 最终 MIC 板浓度，如第 1 列至第 4 列所示。这些被称为中间浓度。
准备的总体积将取决于 MIC 面板的数量。最后，在补充有 0.004%P 80 的阳离子未调整的 Mueller Hinten 肉汤（也称为 C-A-M-H-B）中将中间浓度稀释 1 至 100。DALBAVANCIN 和 P 80 的所得工作浓度是最终浓度的两倍。
由于添加接种物将导致使用带有无菌吸头的多通道移液器进行 1 到 2 稀释，因此将 50 微升每种稀释的达巴万星稀释液分配到 96 孔无菌微量稀释面板的适当孔中。MIC 板格式允许每个板测试 8 个接种筒。如果面板不会立即使用，请用塑料薄膜密封，然后将它们放入塑料袋中并存放在至少零下 60 摄氏度的非解冻冰箱中，直到需要为止。
在此演示中，将接种一个新鲜制备的板。为了制备接种物，请从 18 至 24 小时的血液螺旋或其他非选择性螺旋板中选择几个分离良好的菌落。这里使用了质量控制 s aria 和 EPHI 老茧菌株。
用无菌棉签触摸每个菌落的顶部，并将部分菌落转移到含有 1 至 5 毫升 C-A-M-H-B 或生理盐水的试管中。在制备后 15 至 30 分钟内继续转移直至浊度与 0.5 McFarland 标准匹配，在 C-A-M-H-B 中将接种物稀释 1 至 100，以达到每毫升 CFU 的 5 倍 10 至 5 CFU。可接受的范围是每毫升 2 到 8 乘以 10 到 5 CFU。
立即使用带有无菌吸头的多通道移液器，将 50 微升最终接种物转移到 MIC 面板板的每个适当孔中。用两种分离株中的每一种接种四行，每个分离株总共四次重复。接下来，要进行纯度检查，请使用移液管将阳性生长对照中的 1 至 10 微升溶液转移到非选择性琼脂中，例如 Try Decay 的大豆琼脂与 5% 羊血。
使用无菌定量环将溶液涂抹在板的表面。将板旋转 90 度并再次划线以确保接种物均匀分布。盖上盘子，放在一边。
在准备菌落计数时，使用单通道移液器将生长对照井中的 10 微升溶液转移到 10 毫升盐水混合物中，然后将 100 微升转移到合适的非选择性农业培养基中，例如尝试使用无菌环添加 5% 羊血的 Toay 大豆琼脂，将溶液涂抹在整个农业表面上。沿不同方向重复此过程两次，以确保接种物均匀分布。接下来，将最多四个 MIC 面板堆叠在一个塑料容器中，确保顶板用盖子紧密密封。
然后将湿纸巾放入塑料容器内，并在接种后 30 分钟内用盖子将其盖紧。将 MIC 检测板、菌落计数板和纯度检查板置于环境空气培养箱中，在 35 摄氏度或零下 2 摄氏度下孵育 16 至 20 小时。第二天，将最低抑制浓度读数为肉眼检测到的完全抑制孔中细菌生长的最低浓度。
确定菌落计数板上的菌落数。将计数的数字乘以稀释因子。例如，50 个菌落乘以稀释因子 10， 000 等于每毫升 10 的 5 乘以 10 至第 5 个 CFU。
可接受的范围是 20 到 80 个菌落，这相当于每 ml 第五个菌落形成单位的 2 到 8 乘以 10。接种物的浓度是控制药敏试验以获得准确结果的重要变量。最后，检查纯度板。
如果所有菌落都与用作接种物的菌落相似，则可以认为它是纯的。如果存在任何其他菌落，则 MIC 面板中可能存在污染物，应重复测试。将 DAL bevans、MIC 结果与使用 agri 稀释法获得的结果进行了比较，如图所示。
Dal bevans 的 Agri MIC 结果通常比肉汤高 2 到 8 倍。微量稀释，MIC 结果。这种对比万古霉素的结果，是通过肉汤和农业方法。
因此，不建议将 agri 稀释法用于 dalbavancin 达巴万星肉汤的检测。微量稀释 MIC，质量控制结果应在预期范围内，如图所示。SS 质控微生物 A TCC 2 9 2 1 3 具有非常清晰的模态 MIC，为 0.06 μg/mL，是方法变化的良好指标。
如果获得的结果超出质量控制生物的预期范围或趋向于范围的低端或高端，则需要对该方法进行进一步验证。除了使用质量控制生物体验证该方法外，来自区域抗菌监测计划的 dalbavancin、MIC 数据可以为临床实验室环境中预期的 MIC 结果提供基础，如下所示，Dal b Anson MIC，2011 年至 2013 年在欧洲和美国收集的分离株的结果低于 0.25 微克/毫升99.9% 的 SIU 和 100% 的链球菌。根据这些监测数据，很明显，达巴万星 MIC 对葡萄球菌和链球菌的检测结果大于 0.12 μg/mL 的情况很少见。
如果看到更高的数字，则应重复测试或将其送至参考实验室进行验证。在 DMSO 中制备储备液稀释液，并在最终 MIC 孔中以 0.002% 的浓度向肉汤稀释液中加入 P 80 是获得准确且可重复的达巴万星 MIC 结果的关键步骤与往常一样，但尤其是在细菌耐药性发展的这一领域，准确的抗菌药敏结果对于临床医生选择适当的疗法至关重要。
概述
本文介绍了使用肉汤微量稀释法确定革兰氏阳性菌对达巴万星敏感性的协议。重点是确保准确结果的达巴万星的关键步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 药理学
- 抗菌药物敏感性测试
背景
- 达巴万星是一种半合成脂肽抗菌药物。
- 2014年5月获FDA批准用于治疗急性细菌性皮肤感染。
- 确定最低抑菌浓度（MIC）对有效治疗至关重要。
- 标准化方法对于可重复性和准确性是必要的。
研究目的
- 建立测试达巴万星敏感性的可靠协议。
- 突出与其他抗菌药物相比达巴万星的独特制备步骤。
- 确保临床和质量控制分离株的一致结果。
使用的方法
- 在DMSO中准备达巴万星的原料溶液。
- 使用补充了聚山梨醇酯80的阳离子调整穆勒-欣顿肉汤。
- 将稀释液分装到96孔板中并接种标准化的细菌悬液。
- 孵育并检查细菌生长抑制。
主要结果
- 成功确定了达巴万星对所测试菌株的MIC。
- 临床分离株结果的可重复性得到证明。
- 保持适当的接种浓度对准确的敏感性测试至关重要。
- 该方法的视觉演示增强了对独特制备步骤的理解。
结论
- 肉汤微量稀释法可有效评估达巴万星的敏感性。
- 遵循协议可确保可靠和可重复的结果。
- 进一步的研究可能扩展达巴万星在临床环境中使用的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate antimicrobial susceptibility testing is essential for antimicrobial development and resistance monitoring, directly informing go/no-go decisions in early discovery. Dalbavancin’s long half-life and once-weekly dosing profile make it a strategic candidate for Gram-positive infection programs, but reliable MIC determination requires specialized handling due to its lipoglycopeptide properties. This standardized broth microdilution method ensures reproducible, low-variability MIC data, reducing mechanistic ambiguity in target validation and supporting predictive confidence in lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise interrogation of dalbavancin’s inhibitory activity against Gram-positive pathogens, clarifying target engagement and mechanism of action.
- Operational Value: Reduces variability in MIC results by addressing adherence issues through DMSO stock preparation and polysorbate 80 supplementation, improving assay robustness.
- Predictive Value: Generates consistent, low-fold-change MIC data that aligns with surveillance trends, supporting reliable potency ranking in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative MIC outputs that serve as a standardized benchmark for comparing compound potency across screening campaigns.
- Operational Value: Uses a 96-well format compatible with high-throughput workflows, enabling scalable testing of multiple strains and replicates.
- Reproducibility Value: Incorporates quality control strains with established MIC ranges (e.g., ATCC 29213 at 0.06 µg/mL) to monitor assay drift and ensure run-to-run consistency.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant MIC data for streptococci and staphylococci, aligning with pathogens in acute bacterial skin infection models.
- Operational Value: Supports preclinical efficacy studies by defining exposure thresholds linked to in vivo activity, enabling PK/PD integration.
- Risk Mitigation: Avoids false resistance calls by correcting for agar dilution artifacts, which can overestimate MICs 2- to 8-fold, thus preventing premature deprioritization of promising candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the antimicrobial discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical profiling, where MIC data informs structure-activity relationships and compound prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of dalbavancin’s mechanism by linking MIC shifts to genetic or phenotypic changes in bacterial strains.
- Screening: Delivers standardized, quantitative susceptibility data that enables reliable comparison of analogs and derivatives in SAR studies.
- Analytics: Generates MIC endpoints that can be statistically analyzed to assess potency, variability, and resistance emergence across strain panels.
- Translational Research: Connects in vitro susceptibility to clinical relevance through surveillance data showing <0.25 µg/mL MICs in >99.9% of staphylococcal and streptococcal isolates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reference-compliant SOP that can be shared across discovery, preclinical, and translational teams to ensure data comparability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by minimizing false-positive resistance signals caused by methodological artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized reagent preparation (DMSO stocks, polysorbate 80 broth) and defined inoculum controls (5×10⁵ CFU/mL, 2–8×10⁵ acceptable range).
- Strategic Value: Improves decision-making efficiency by providing reliable MIC cutoffs for go/no-go gates, reducing late-stage attrition due to unexpected resistance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying compounds with consistent sub-0.25 µg/mL activity against key Gram-positive targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antimicrobial susceptibility testing and handling of lipoglycopeptide compounds.
- Necessitates access to DMSO for stock preparation, polysorbate 80, cation-adjusted Mueller Hinton broth, and 96-well microtiter plates.
- Demands strict inoculum standardization using McFarland equivalence and dilution to 5×10⁵ CFU/mL to avoid false susceptibility or resistance results.
- Requires incubation at 35±2°C for 16–20 hours and visual MIC reading as the lowest concentration with no visible growth.
- Dependent on quality control monitoring (e.g., ATCC 29213) to detect reagent degradation, incubator variability, or technician drift that could shift MICs outside expected ranges.
