达巴万星的参考肉汤微量稀释法 体外 需氧细菌的药敏试验

以下实验方案的总体目标是测定达巴万星的最低抑菌浓度。采用肉汤微量稀释法，并重点关注针对达巴万星特有的关键操作步骤。达巴万星的储备液和中间稀释液使用二甲基亚砜（DMSO）配制，最终稀释液则使用阳离子调节的、添加了聚山梨酯的 Mueller Hinton 肉汤配制。

将稀释液加入96孔板中，并接种标准化的细菌悬液。随后将该板在16至24小时内孵育，并观察以确定抑制细菌生长所需的最低达巴万星浓度。遵循此标准化方法可确保对临床分离株以及本实验所示的质量控制菌株均获得一致的结果。达巴万星是一种半合成脂糖肽类抗菌剂，于2014年5月获美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗由革兰氏阳性菌引起的急性细菌性皮肤及皮肤结构感染。

本方法描述了用于达辛（dassin）的标准肉汤微量稀释敏感性试验，包括使用DMSO在聚山梨酯80中配制储备液，以减少该试剂对塑料器皿的黏附。该方法的可视化演示具有重要帮助，因为储备液和MIC板溶液的配制步骤与大多数抗菌药物不同，这些步骤是脂质糖肽类药物所特有的，必须严格遵循，以获得可重复且准确的MIC结果。

本实验操作将由我实验室的研究科学家 Gina Fisher 进行演示。请注意，在执行以下操作步骤时，应采取符合生物安全二级标准的适当安全防护措施。首先称取适量的达巴万星，以配制浓度为 800 微克/毫升的储备液。

向无菌的玻璃或塑料管中加入适量的纯DMSO，然后将粉末转移至管中并涡旋混匀。接下来，使用每毫升800微克的DALBAVANCIN储备液，按照第1至第4列所示，配制最终MIC平板浓度的100倍中间浓度溶液。这些溶液称为中间浓度。

制备的总体积取决于 MIC 板的数量。最后，用阳离子未调节的穆勒-欣顿肉汤（即 C-A-M-H-B）将中间浓度稀释 1 至 100 倍，并添加 0.004% P 80。所得达巴万星（DALBAVANCIN）和 P 80 的工作浓度为最终浓度的两倍。

由于接种物的加入会导致一到二倍的稀释，使用带无菌吸头的多通道移液器，将每种稀释浓度的达巴万星各50微升加入96孔无菌微量稀释板的相应孔中。MIC板的格式允许每块板同时检测八个接种物。如果板不能立即使用，应用塑料封膜密封，然后放入塑料袋中，并在至少-60摄氏度的无霜冰箱中保存，直至使用。

在本演示中，将接种一个新制备的平板。为制备接种物，从孵育18至24小时的血琼脂平板或其他非选择性琼脂平板上，挑选数个分离良好的菌落。此处使用质量控制菌株s aria和EPHI菌丝状菌株。

用无菌拭子接触每个菌落的顶部，并将部分菌落转移至含有1至5毫升C-A-M-H-B或生理盐水的试管中。持续转移，直至菌液浊度在配制后15至30分钟内达到0.5麦氏比浊标准；随后将接种物在C-A-M-H-B中按1:100稀释，最终浓度为每毫升5×10⁵ CFU。可接受范围为每毫升2×10⁵至8×10⁵ CFU。

立即使用带有无菌吸头的多通道移液器，将最终接种物各 50 微升转移至 MIC 面板板中相应的孔中。每种分离株分别接种四行，每株共设四个重复。接下来，为进行纯度检查，用移液器取阳性生长对照溶液中的 1 至 10 微升，转移至非选择性琼脂培养基，例如含 5% 羊血的胰蛋白胨大豆琼脂。

使用无菌接种环将溶液均匀涂布于平板表面。将平板旋转90度后再次划线，以确保接种物均匀分布。盖上平板并放置一旁。

在进行菌落计数前，使用单通道移液器将生长对照孔中的溶液10 µL转移至10 mL生理盐水混合液中，然后用无菌接种环取100 µL接种于适当的非选择性琼脂培养基（如含5%羊血的胰蛋白胨大豆琼脂）上，将溶液涂布至整个琼脂表面。以不同方向重复此涂布过程两次，以确保接种物均匀分布。接下来，将最多四块MIC板叠放在塑料容器中，并确保最上方的板用盖子严密封闭。

接种后30分钟内，将一张湿润的纸巾放入塑料容器中，并用盖子严密封闭。将MIC板、菌落计数平板和纯度检查平板置于普通空气孵育箱中，在35±2°C条件下孵育16至20小时。次日，通过肉眼观察，以完全抑制孔中细菌生长的最低浓度读取最低抑菌浓度（MIC）。

确定菌落计数平板上的菌落数量。将计得的菌落数乘以稀释倍数。例如，50 个菌落乘以 10,000 的稀释倍数，等于每毫升 5 × 10⁵ CFU。

可接受的菌落数范围为20至80个，相当于每毫升2到8乘以10的5次方个菌落形成单位。接种物的浓度是控制药敏试验以获得准确结果的重要变量。最后，检查纯度平板。

如果所有菌落均与用作接种物的菌落相似，则可视为纯培养。如果存在其他类型的菌落，则 MIC 板中可能存在污染，应重复试验。DAL bevans 将 MIC 结果与采用倍比稀释法获得的结果进行了比较，如下图所示。

达贝万斯的琼脂稀释MIC结果通常比肉汤稀释法高出两到八倍。这与万古霉素的结果形成对比，后者的MIC结果在肉汤稀释法和琼脂稀释法中基本一致。

因此，不建议使用农业稀释法对达巴万星达巴万星肉汤进行测试。微量稀释法的最小抑菌浓度（MIC）结果，其质量控制应在预期范围内，如上所示。SS 质控菌株 ATCC 29213 的典型 MIC 值非常明确，为 0.06 微克/毫升，是检测方法变异性的良好指标。

如果获得的结果超出质量控制菌株的预期范围，或趋向于范围的低端或高端，则需要对该方法进行进一步验证。除了使用质量控制菌株验证方法外，地区性抗菌药物监测项目中的达巴万星（dalbavancin）最低抑菌浓度（MIC）数据也可为临床实验室中预期的MIC结果提供依据。例如，2011年至2013年在欧洲和美国收集的分离株的达巴万星MIC结果显示，99.9%的葡萄球菌属（SIUs）和100%的链球菌属（streptococci）的MIC值均低于0.25微克/毫升。根据这些监测数据可以明显看出，葡萄球菌属和链球菌属的达巴万星MIC值高于0.12微克/毫升的情况极为罕见。

若观察到较高数值，应重复测试，或送至参考实验室进行验证。在DMSO中制备储备稀释液，并在最终MIC孔的肉汤稀释液中加入终浓度为0.002%的P 80，是获得准确且可重复的达巴万星MIC结果的关键步骤。与以往一样，尤其是在细菌耐药性发展的这一领域，准确的抗菌药物敏感性结果对于临床医生选择适当的治疗方案至关重要。