Name: 在振荡压力灌流器程序大鼠肝脏的脱细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 了解振荡压力灌流技术用于大鼠肝脏脱细胞的方法。通过肝动脉灌注实现更均匀的脱细胞效果，为器官移植和组织工程研究提供优化的实验方案。

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作者谨此衷心感谢 Steffen Lippert、Khalid Aliyev、Korinna Jöhrens 和 Katharina Struecker 在本项目期间提供的帮助。

动物饲养于德国柏林夏里特实验医学中心（FEM, Charité, Berlin, Germany），所有实验方案均经德国柏林州卫生局及地方事务办公室（LAGeSo, Berlin, Germany；批准编号：O 0365/11）审查并批准。
1. 肝脏采集
<ol>
	<li>术前准备
	<ol>
		<li>使用软木板进行固定。将医用铺巾置于软木板上。用四枚针头将吸入麻醉面罩固定在软木板上，用于术中吸入麻醉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>门静脉插管的预先准备
	<ol>
		<li>将外周静脉导管（G 20）连接至三通旋塞阀。静脉导管应斜切，长度约为 1.5 cm。</li>
		<li>使用装有林格液的 10 ml 注射器排除系统中的空气。必须仔细排尽空气，因为气体栓塞可能对灌注脱细胞过程产生不利影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动脉插管的预先准备
	<ol>
		<li>使用蝶形针头，将其剪至 5 mm 长度。将一段 5 cm 长的导管（内径 0.58 mm；外径 0.96 mm）套接在 5 mm 针头上，并用速干胶固定。再将一段 2 cm 长的导管（内径 0.28 mm；外径 0.61 mm）插入较粗的导管中，并用速干胶固定。</li>
		<li>将另一段导管套在该结构外部作为限位装置，并用速干胶固定。使用装有林格液的 5 ml 注射器排除动脉插管中的空气。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉与镇痛
	<ol>
		<li>在麻醉诱导舱中，以 1.5 L/min 的流速给予 3.5% 异氟烷氧气混合气体，诱导大鼠麻醉。</li>
		<li>为确保术中充分镇痛，经腹腔注射安乃近（100 mg/kg 体重）及低剂量氯胺酮/美托咪啶（10 mg/0.1 mg 每 kg 体重）。</li>
		<li>通过吸入面罩以 1 L/min 的流速供给 1.5% 异氟烷氧气混合气体，以维持术中麻醉状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术前准备
	<ol>
		<li>使用电动剃毛器广泛剃除腹部毛发。用 70% 乙醇湿润腹部切口区域，进行消毒。</li>
		<li>将动物仰卧位放置于准备好的软木板上，头部插入吸入面罩，四肢用医用胶带和针头固定。用纱布垫清除多余的乙醇和毛发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉深度评估
	<ol>
		<li>通过观察呼吸频率评估麻醉深度。当麻醉深度足够（40–60 次/分钟）时，使用手术镊夹压双侧后肢脚趾间的皮肤，尝试诱发脚趾夹捏反射，以判断镇痛是否充分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腹部入路
	<ol>
		<li>在膀胱上方的腹壁尾侧做正中切口，由此向两侧肋弓呈 V 形剪开。注意避免切及膈肌。将切开的腹壁翻折至胸部上方。</li>
		<li>用 Overholt 钳夹住剑突并向上牵拉，再用橡皮筋固定。使用湿润棉签将肠管移出术区，并用湿纱布包裹肠管。同时，用湿纱布覆盖所有腹部创缘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝脏准备
	<ol>
		<li>解剖镰状韧带。使用湿纱布将肝脏中叶和左叶向上牵拉至膈顶下方，暴露肝十二指肠韧带和上大网膜肝叶。</li>
		<li>使用两把显微镊和弹簧剪，小心解剖附着于上大网膜肝叶的韧带，直至该肝叶可自由活动。使用湿棉签在纱布垫下移动肝叶，同时保持中叶和左叶位置固定。</li>
		<li>上大网膜肝叶游离后，将胃向左侧移动。用钳子固定胃部，并使用显微镊和弹簧剪解剖小网膜。</li>
		<li>游离下大网膜肝叶直至其可自由活动，随后将其复位于原位。使用 Backhaus 钳固定十二指肠，将其向左牵拉以拉伸并暴露肝十二指肠韧带。在拉伸的肝十二指肠韧带中环形游离胆总管。</li>
		<li>从周围脂肪及胰腺组织中解剖胆总管。在距胆管分叉处 1.5 cm 处切断胆总管。从周围脂肪组织中解剖门静脉，暴露胃十二指肠静脉。</li>
		<li>使用 6-0 丝线双重结扎胃十二指肠静脉，并在两结扎线之间切断该静脉。从周围组织中解剖腹腔干和肝总动脉，直至所有动脉分支均暴露。</li>
		<li>从周围组织中游离胃十二指肠动脉，使用 6-0 丝线进行双重结扎，两结扎线之间保持一定距离。在两结扎线之间解剖切断胃十二指肠动脉。</li>
		<li>从周围组织中游离脾动脉，使用 6-0 丝线进行双重结扎，两结扎线之间保持一定距离。在两结扎线之间解剖切断脾动脉。</li>
		<li>从周围组织中游离左胃动脉，使用 6-0 丝线进行双重结扎，两结扎线之间保持一定距离。在两结扎线之间解剖切断左胃动脉。</li>
		<li>在右肾与右外侧肝叶之间环形游离下腔静脉。从后腹膜间隙中解剖下腔静脉。沿腹腔干方向暴露腹主动脉。</li>
		<li>解剖后腹膜脂肪组织。向下腔静脉内注射 1,000 I.E. 肝素生理盐水溶液 1 ml。拔出针头，用棉垫压迫切口。等待 1–2 分钟，使肝素发挥全身抗凝作用。</li>
		<li>用镊子环形游离腹主动脉，解剖并放血以处死大鼠。进一步从肾脏远端解剖下腔静脉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>门静脉插管（使用第 1.2 节中预先准备的插管）
	<ol>
		<li>在门静脉远端做鱼口状切口。用镊子撑开切口，插入插管。以 20 ml 林格液冲洗肝脏，直至肝脏褪色，再用结扎线（6-0 丝线）固定插管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动脉插管（使用第 1.3 节中预先准备的插管）
	<ol>
		<li>解剖腹腔干上方的腹主动脉，从后腹膜间隙中游离该段主动脉。纵向切开主动脉壁形成主动脉补片。将自制插管插入静态固定装置中。</li>
		<li>使用两把镊子将主动脉补片套入插管。在插管上方用 6-0 丝线结扎肝动脉，并将补片固定在限位装置上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝脏摘除
	<ol>
		<li>切开膈肌，做环形切口，将肝脏从周围结构中游离出来。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存
	<ol>
		<li>将肝脏保存于无菌的 500 ml 容器中，容器内盛有 350 ml 林格液，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 去垢剂溶液
<ol>
	<li>10% Triton X-100 储存液
	<ol>
		<li>取一个 1,000 ml 的瓶子，加入 900 ml 去离子水，再加入 100 ml Triton X-100（99.9%）。使用搅拌器将 Triton X-100 溶解。继续加入去离子水至总体积为 1,000 ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1% Triton X-100
	<ol>
		<li>取 100 ml 储存液（10%）加入 1,000 ml 的瓶子中，再加入 900 ml 去离子水，轻轻摇动瓶子两次。将 1% Triton X-100 溶液通过无菌滤膜过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10% SDS 储存液
	<ol>
		<li>取一个 1,000 ml 的瓶子，加入 900 ml 去离子水，再加入 66.99 g SDS（99.9%，密度 0.67）。使用搅拌器将 SDS 溶解。继续加入去离子水至总体积为 1,000 ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1% SDS
	<ol>
		<li>取 100 ml 储存液（10%）加入 1,000 ml 的瓶子中，再加入 900 ml 去离子水，轻轻摇动瓶子两次。将 1% SDS 溶液通过无菌滤膜过滤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脱细胞化
<ol>
	<li>灌流装置的设置<img alt="生物反应器中大鼠肝脏灌流；标注的示意图显示流入/流出；压力分布。" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"></li>
</ol>
图1：在振荡压力条件下对四只大鼠肝脏进行选择性动脉和门静脉灌注的灌注装置示意图。（改编自 Struecker et al. 14）
<ol>
	<li>将排水管连接至三通旋塞和海德伯格延伸装置，以调节液位，并用 500 ml 0.9% NaCl 填充反应器。 
	<img alt="索氏提取装置图，包含溶剂回流系统、提取装置和溶剂回收瓶。" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"></li>
</ol>
图2：灌注装置示意图。 通过门静脉通路（2）或动脉通路（3），将灌注室（1,400 cm3）（1）连接至除泡阱（5）的远端（4）。除泡阱（5）应在远端配备封闭装置（4），并设有排气口（6）。将除泡阱（5）连接至海德堡延长管（7）。将海德堡延长管连接至泵管段（8）。此外，将泵管段（8）连接至另一根海德堡延长管（9）。将最后一根海德堡延长管（9）插入洗涤剂溶液瓶（10）中。将呼吸机（11）连接至灌注室（或在进行多路灌注时连接至压力分配器）。为排出反应器液体，需将流出管路连接至废液瓶（12）。
<ol>
	<li>将泵管段插入泵中。启动泵以磷酸盐缓冲液（PBS）填充循环系统，关闭气泡捕集器的远端并打开排气口。当气泡底部被 PBS 完全覆盖（2–3 cm）后，关闭排气口并打开气泡捕集器的远端。</li>
	<li>肝脏安装
	<ol>
		<li>将门静脉插管的三通旋塞连接至相应的反应器接口。将动脉插管连接至动脉接口。注意确保无空气进入系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>施加振荡压力条件
	<ol>
		<li>使用呼吸机，频率设为 15 次/分钟（bpm），振幅为 26 mbar（最小 4 mbar，最大 30 mbar）。将呼吸机连接至压力分配室，并将压力分配室连接至反应器。开始施加压力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱细胞化方案
	<ol>
		<li>以 5 ml/min 的流速进行灌注操作。首先用 1% Triton X-100 对肝脏灌注 90 分钟以启动脱细胞化过程。通过灌注装置的流出端排出废液，以维持灌注室内液面恒定并始终高于灌注中的肝脏。90 分钟后，更换去垢剂为 1% SDS。 
		<img alt="灌注时间线示意图，显示 PBS、1% Triton X-100、1% SDS 在 5 ml/min 流速下的过程。" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
		<img alt="灌注路径表，显示门静脉和肝动脉以及振荡压力数据。" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
 图3：所有实验组的灌注方案。

<ol><li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+support+strategies%3A+cutting-edge+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+scaffolds+effectively+support+the+proliferation+and+differentiation+of+mouse+fetal+hepatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li>
<li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).</li>
<li>De Kock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+quick+method+for+whole-liver+decellularization%3A+a+novel+in+vitro+three-dimensional+bioengineering+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+toxicology%22%5BJournal%5D)">Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool.</a> Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).</li>
<li>Park, K. M., Woo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+decellularization+for+multi-organ+scaffolds+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+proceedings%22%5BJournal%5D)">Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats.</a> Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).</li>
<li>Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+as+a+practical+scaffold+with+a+vascular+network+template+for+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering.</a> J Biosci Bioeng. , (2012).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver Int. 33, 448-458 (2013).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+rat+liver+decellularization+by+arterial+perfusion+under+oscillating+pressure+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+Liver+Decellularization+Under+Oscillating+Pressure+Conditions%3A+A+Technical+Refinement+to+Improve+the+Homogeneity+of+the+Decellularization+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管大鼠肝脏收获与脱细胞技术易于重复，但仍需注意某些关键步骤：
在准备肝脏摘取时，重要的是避免严重出血，因为出血会激活血液凝固，可能导致肝脏内形成血栓。我们认为，在门静脉插管前直接切开腹主动脉是有利的，可避免经门静脉灌注时血液通过肝动脉流入肝脏。一旦肝脏完成插管并得到明确灌注，血栓形成便不再成为问题。
在肝脏获取并转运至灌注装置后，将肝脏连接至灌注装置是一个尤为关键的步骤，必须避免气体气泡进入灌注回路，以防止发生气体栓塞。在将连接肝脏套管的三通阀接入灌注系统之前，使用注射器和细套管向该三通阀内预先充满磷酸盐缓冲液（PBS），此操作十分必要。
建立灌注后，应重新检查所有管路连接头、三通阀和管路是否均连接完好。如果肝脏需要长时间灌注（例如，过夜），即使连接处存在微小误差，也可能导致空气被虹吸进入灌注系统，从而引发致命的灌注后果。
目前的数据存在局限性，因为尚不明确产生最佳脱细胞效果所需的振荡压力变化的最...

脱细胞化与再细胞化可能实现在体外生成具有功能且可移植的器官in vitro 1。通过去除器官中的细胞及抗原性物质（例如，DNA、α-Gal 表位），可获得非免疫原性或低免疫原性的细胞外基质（ECM）。该基质保留了器官的三维微解剖结构，可作为理想的生物支架，用于接种来源不同、甚至异种来源的细胞 2。因此，可将人肝细胞接种于脱细胞化的大鼠肝脏基质中。这种人源化微肝可作为研究疾病（例如，先天性代谢性疾病、病毒感染或恶性肿瘤）或进行临床前药物测试的ex vivo模型 3。
已有多种不同的大鼠肝脏灌流脱细胞方法被发表4-13。在所有这些方法中，均是通过门静脉插管灌注碱性离子或非离子型去污剂来实现脱细胞。据我们所知，我们是首个报道通过门静脉和/或大鼠肝动脉进行选择性灌注以实现大鼠肝脏脱细胞的团队14。实现肝脏内不同血管系统的特异性灌注，可能有助于获得更优的脱细胞效果，并且在后续的细胞再接种过程中也可能发挥重要作用。
在本研究中，肝脏在一种定制的专有灌注装置中进行灌注，从而能够在振荡压力条件下实现灌注。这种压力条件模拟了生理状态下呼吸依赖性的肝脏灌注：in situ 时，肝脏悬挂在膈肌穹窿下方，呼吸过程中膈肌的运动直接影响肝脏的灌注。吸气时膈肌下降并挤压肝脏，从而优化肝静脉的流出；而呼气时肝脏上升，腹腔内压力降低，有利于门静脉的流入15。
我们的目标是通过模拟腹腔内条件，评估振荡压力环境是否会影响大鼠肝脏灌注脱细胞过程的均匀性 离体脱细胞过程的均一性在灌注脱细胞中可能是一个被低估的因素。所有已知用于肝脏脱细胞的试剂均会引起细胞外基质（ECM）的改变。灌注不良区域的细胞会残留在ECM中，而其他区域则已完全脱细胞。为了溶解残留细胞，必须延长灌注时间或提高压力，但这会导致灌注良好区域的ECM发生更显著的改变。因此，脱细胞所用的去垢剂应在器官内均匀分布。

<table><tbody><tr><td colspan="4">自制动脉插管</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex 非无菌聚乙烯导管</td><td>SIMS Portex</td><td>货号 800/110/100</td><td>内径 0.28 mm，外径 0.61 mm</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex 非无菌聚乙烯导管</td><td>SIMS Portex</td><td>货号 800/110/200</td><td>内径 0.58 mm，外径 0.96 mm</td></tr><tr><td>Venodrop Safe 蝶形静脉留置针</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">门静脉插管</td></tr><tr><td>外周静脉导管</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">手术用品</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>棉垫&amp;nbsp;</td><td>绍兴正德外科敷料</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>纱布绷带</td><td>湖北海格&amp;nbsp;医疗器械</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;林格氏液</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml / Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml 注射器</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml / Luer Solo</td></tr><tr><td>缝合线（丝线 6/0）</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>批号 105001.81</td></tr><tr><td>医用铺巾</td><td>绍兴正德外科敷料</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">手术器械</td></tr><tr><td>持针器</td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>显微镊</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>显微剪</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>显微镊</td><td>S&amp;amp;T&amp;nbsp;</td><td>112314</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>F S T&amp;nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>外科镊</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">脱细胞处理</td></tr><tr><td>呼吸机</td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>灌注装置</td><td>Charite 医疗工程实验室</td><td>定制设备</td><td>脱细胞装置</td></tr><tr><td>peristaltic pump ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&amp;nbsp;</td><td>4 通道</td></tr><tr><td>Heidelberger 延长管 75 cm&amp;nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA 泵管段</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&amp;nbsp;</td><td>MS/CA/click'n'go/POM-C</td></tr><tr><td>CA 2-密封塞管</td><td>Pharmed</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>气泡捕集器&amp;nbsp;</td><td></td><td>定制物品</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock 软管接头</td><td>Neolab</td><td>货号 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">去垢剂</td></tr><tr><td>SDS 颗粒</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>CN30.4&amp;nbsp;</td><td>2.5 kg</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>3051.1&amp;nbsp;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">染色</td></tr><tr><td>伊红 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td> Mayer 苏木精</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>戈莫里染色液</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>阿利新蓝-PAS 染色液</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>直接红 80&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

振荡压力灌注装置中大鼠肝脏脱细胞操作步骤

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

实质器官的脱细胞与再细胞化可能实现在体外生成功能性器官，目前已有多种关于啮齿类动物肝脏脱细胞的实验方案发表。本研究旨在通过构建一种专有的灌注装置，实现经门静脉和/或肝动脉的选择性灌注，从而优化脱细胞过程。此外，我们尝试在振荡的周围压力条件下进行灌注，以提高脱细胞的均一性。迄今为止，灌注脱细胞过程中的均一性一直是一个被低估的因素。在脱细胞过程中，器官中灌注不良的区域可能仍残留细胞，而灌注充分区域的细胞外基质（ECM）则可能已受到碱性去污剂的影响。振荡压力变化可模拟呼吸过程中发生的腹腔内压力变化，从而优化肝脏内部的微灌注。在本研究中，通过组织学染色、DNA含量分析和腐蚀铸型技术对大鼠脱细胞肝脏基质进行了分析。结果显示，经肝动脉灌注所得结果比经门静脉灌注更具均一性。应用振荡压力条件可提高灌注脱细胞的效率。经肝动脉灌注并在振荡压力条件下处理的肝脏表现出最佳效果。本文介绍的肝脏获取、插管及使用本机构专有装置进行灌注的技术，可实现复杂的灌注设置，从而改进大鼠肝脏的脱细胞与再细胞化实验。

通过宏观观察、组织学分析以及对脱细胞肝脏基质中残留DNA含量的分析，评估了不同脱细胞化方案的均一性及其效果。此外，还进行了腐蚀铸型以直观显示脱细胞后肝脏的完整微细解剖结构。
大体观察
在脱细胞过程中，肝脏变得透明，表明细胞成分已被去除。通过门静脉灌注的肝脏显示出不均匀的透明化（即脱细胞化），在脱细胞过程中及完成后肉眼可见残留的细胞（白色箭头）。通过肝动脉灌注的肝脏则表现出更均匀的脱细胞过程，且无可见的残留细胞。若在施加振荡压力条件的情况下进行肝脏灌注，则无论灌注路径如何，均无可见的残留细胞。
<img alt="脱细胞过程、心脏支架制备、生物医学研究、比较研究图像。" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4：无振荡压力条件下大鼠肝脏脱细胞的宏观结果。左侧：通过肝动脉进行脱细胞的...

采用我们专有设备进行大鼠肝脏收获、插管和灌注的技术，可实现复杂的灌注系统，从而改进肝脏脱细胞和再细胞化实验。

实质器官的脱细胞与再细胞化可能实现在体外生成功能性器官，目前已有多项针对啮齿类动物的方案……

以下实验的总体目标是评估灌注根部在优化大鼠肝脏灌注脱细胞均匀性中的作用。首先，对新鲜分离的大鼠肝脏的门静脉和肝动脉进行插管。第二步，将肝脏连接至灌注装置，以选择性地灌注门静脉或肝动脉。接下来，向灌注 chamber 施加振荡压力变化，以模拟呼吸过程中发生的腹腔内压力变化。通过优化肝脏微灌注，最终在振荡压力条件下经肝动脉灌注的肝脏，通过肉眼观察以及组织学和生物化学分析评估，表现出更均匀且更快的脱细胞效果。该技术相较于现有方法（如门静脉灌注脱细胞）的主要优势在于，采用振荡压力条件进行动脉灌注可实现更均匀的脱细胞结果。尽管耗时较短，该方法仍可为减速度技术提供见解。它还可应用于其他系统，如离体再灌注实验、体外灌注装置以及器官模型。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为红肝的获取和动脉插管操作较为复杂。在采集肝脏之前，将一段1.5厘米长的外周G 20静脉导管末端斜向剪开。将导管连接至三通旋塞阀，并使用装有林格氏液的10毫升注射器排空系统中的空气。接着，将蝶形针头剪短至5毫米长度，并使用速干胶将一段5厘米长的导管固定在针头上。将一段两厘米长的细管插入较粗的长管中，并同样用强力胶固定。再将另一段管子套入该结构，并用胶水固定，以形成一个支挡结构。然后使用一个装有林格溶液的5毫升注射器，对新构建的动脉插管进行冲洗，以修复肝脏供后续获取。首先，使用湿纱布将一只麻醉的成年大鼠的中叶和左叶肝脏固定于膈肌穹隆下方。此时暴露肝十二指肠韧带和上部肝叶。接着，使用两把显微镊子和弹簧剪仔细解剖附着在上部大网膜叶的韧带，直至该肝叶可自由移动。然后固定住中叶和左叶。使用湿润的棉签将肝叶移至GRE压迫器下方，并将胃向动物左侧移动。用夹子固定胃，并解剖小网膜。然后分离肝脏下叶或尾状叶，直至其可活动，使用Backhaus钳将肝叶推回原位以固定十二指肠，将十二指肠向左侧牵拉，暴露肝十二指肠韧带，环绕胆总管进行分离。随后从周围脂肪组织及胰腺组织中游离胆总管，并在距胆管分叉处1.5厘米处切断胆总管。从周围脂肪组织中分离出脾静脉，暴露胃十二指肠静脉。随后使用6-0缝线对胃十二指肠静脉进行双重结扎，并在两个结扎线之间切断该静脉。游离腹腔干和肝总动脉，直至所有动脉分支均清晰暴露。所有动脉解剖完毕后，在右肾与肝右叶之间环切下腔静脉，并将该静脉从腹膜后间隙中分离。沿腹腔干走行以暴露腹主动脉，随后解剖腹膜后脂肪组织，并在腹腔干上方环切腹主动脉。现在将1000单位肝素溶于1毫升生理盐水中，注入下腔静脉。用棉垫覆盖切口，等待一至两分钟，使肝素发挥作用。然后用镊子夹住主动脉周围，从肾脏远端分离主动脉和下腔静脉。为放置门静脉插管，在门静脉远端做一鱼口状切口，并用镊子撑开切口。随后插入门静脉导管，用20毫升林格氏液冲洗肝脏，直至肝脏去血。使用6-0丝线结扎固定插管。为放置动脉插管，解剖腹腔动脉上方的主动脉，直至能将该段主动脉从腹膜后间隙游离出来。将主动脉节段纵向切开，制备主动脉补片，并将自制的套管插入静态支架中。然后使用两把镊子将主动脉补片套入套管上，并在套管上方用6-0丝线结扎肝动脉。将补片固定在对接处以进行脱细胞处理。将门静脉套管上的三通旋塞阀连接至相应反应器接口，并将动脉套管连接至动脉接口，注意避免空气进入系统。接下来，将呼吸机连接到压力分布室，并将压力分布室连接至反应器。启动压力施加，随后开始脱细胞过程。以每分钟 5 毫升的速度，使用 1% Triton X-100 对肝脏进行灌注融合。通过灌注装置的流出通道排出废液，以维持灌注腔内液面恒定并始终高于灌注的肝脏。90 分钟后，将去污剂更换为 1% SDS。经门静脉灌注的肝脏显示出不均匀的脱细胞效果，提示在脱细胞过程中及完成后，肉眼可见残留细胞；而经肝动脉灌注的肝脏则表现出更均匀的脱细胞过程，残留细胞较少。若肝脏在施加振荡压力条件的情况下进行灌注，则未见残留细胞。无论灌注方式如何，通过肝动脉灌注的脱细胞肝脏基质的组织学评估结果确实支持宏观观察结果。无论是否在振荡压力条件下灌注，经肝动脉灌注的肝脏中均未观察到残留细胞；然而，经门静脉灌注的肝脏则显示出残留细胞区域，即使在振荡压力条件下灌注亦如此，尽管该条件可减少这些肝脏中的残留细胞量。需要注意的是，无论脱细胞条件如何，肝脏的细胞外基质均得到了保留。与天然肝脏相比，所有实验组肝脏基质的单位干重DNA含量均有所下降，但统计学上的显著差异仅出现在经振荡压力条件灌注的组别中。此外，脱细胞肝脏基质的腐蚀铸型证实了灌注过程中肝脏微解剖结构的保留。观看本视频后，您应充分了解如何收获、插管并灌注红色肝脏，以实现可重复且均匀的脱细胞。请务必注意，使用 Triton X-100 和 SDS 具有极高危险性，操作时应采取佩戴手套等防护措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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灌注脱细胞是一种新型技术，可用于制备保留肝脏细胞外基质成分和微结构的全肝支架。本文描述了利用灌注脱细胞法制备全器官支架并随后接种肝细胞的方法。通过该技术可生成具有功能且可移植的肝脏移植物。...

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振荡压力灌注装置中大鼠肝脏脱细胞操作步骤

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