振荡压力灌注装置中大鼠肝脏脱细胞操作步骤

以下实验的总体目标是评估灌注根部在优化大鼠肝脏灌注脱细胞均匀性中的作用。首先，对新鲜分离的大鼠肝脏的门静脉和肝动脉进行插管，然后将肝脏连接至灌注装置，以选择性地灌注门静脉或肝动脉。

接下来，向灌注室施加振荡压力变化，以模拟呼吸过程中发生的腹腔内压力变化。通过优化肝脏微灌注，最终在振荡压力条件下经肝动脉灌注的肝脏表现出更均匀且更快的脱细胞效果，这一结论通过宏观观察以及组织学和生化分析得以评估。该技术相较于现有方法（如门静脉灌注脱细胞）的主要优势在于，采用振荡压力条件进行动脉灌注可实现更均匀的脱细胞结果。

尽管在较短时间内，该方法仍可为减速技术提供深入见解。该方法还可应用于其他系统，例如离体再灌注实验、体外灌注装置以及器官模型。通常，初学者在使用该方法时会遇到困难，因为红色肝脏的获取与动脉插管操作较为复杂。

在收获肝脏之前，对一段1.5厘米长的外周G 20静脉导管末端进行斜切。将导管连接至三通旋塞阀，并使用装有林格液的10毫升注射器排空系统中的空气。接着，将蝶形套管针头剪至5毫米长度，并使用超级胶水将一段5厘米长的导管固定在针头上。

将一根两厘米长的细管插入较粗的管子中，并同样用强力胶固定。将另一根管子套入该结构，并将其粘牢以形成支撑结构。然后使用一支装有林格氏液的5毫升注射器，对新构建的动脉插管进行冲洗，以修复肝脏供后续获取。

首先，使用湿纱布敷料将麻醉成年大鼠的中叶和左叶肝脏固定于膈肌穹窿下方。此时，暴露肝十二指肠韧带及上部肝叶。接着，使用两把显微镊子和弹簧剪，仔细解剖附着于上部大网膜肝叶的韧带，直至该肝叶可自由移动。

然后固定住中叶和左叶。使用湿润的棉签将肝叶移至GRE压片下方，并将胃向动物左侧移动。用夹子固定胃，并解剖小网膜。

然后解剖肝脏下叶或尾状叶，直至其可活动，使用Backhaus钳将肝叶推回原位以固定十二指肠，将十二指肠向左侧牵拉，暴露肝十二指肠韧带，环绕胆总管。随后从脂肪组织和胰腺组织中游离胆管，并在距胆管分叉处1.5厘米处切断胆管。

从周围脂肪组织中分离出脾静脉，暴露胃十二指肠静脉。随后使用6-0缝线对胃十二指肠静脉进行双重结扎，并在两个结扎线之间切断该静脉。游离腹腔干和肝总动脉，清除周围组织，直至所有动脉分支均清晰显露。

所有动脉解剖完毕后，在右肾与肝右叶之间环切下腔静脉，并将该静脉从腹膜后间隙中分离。沿腹腔干走行以暴露腹主动脉，随后剥离腹膜后脂肪组织，并在腹腔干上方环切腹主动脉。

现在将1000单位肝素溶于1毫升生理盐水中，注入下腔静脉。用棉垫覆盖切口，并等待1至2分钟使肝素发挥作用。然后用镊子环形夹住主动脉，从肾远端分离主动脉和下腔静脉。

为放置门静脉插管，在门静脉远端做一鱼口状切口，并用镊子撑开切口。随后插入门静脉插管，用20毫升林格氏液冲洗肝脏，直至肝脏去血化。使用6-0丝线结扎固定插管位置。为放置动脉插管，解剖腹腔动脉上方的主动脉，直至该段主动脉可从腹膜后间隙游离出来。

纵向切开主动脉节段以制备主动脉补片，并将自制的套管插入静态固定架中。然后使用两把镊子将主动脉补片套入套管上，并在套管上方用6-0丝线结扎肝动脉。将补片固定在对接处以进行脱细胞处理。将门静脉套管上的三通旋塞阀连接至相应的反应器通路，并将动脉套管连接至动脉通路，注意避免空气进入系统。

接下来，将呼吸机连接到压力分布室，并将压力分布室连接至反应器。启动压力施加，随后开始脱细胞过程。

以每分钟 5 毫升的速度，使用 1% Triton X-100 对肝脏进行灌注融合。通过灌注装置的流出通道排出废液，以维持灌注腔内液面恒定并始终高于灌注的肝脏。90 分钟后，更换为 1% SDS。经门静脉灌注的肝脏显示出不均匀的脱细胞效果，提示在脱细胞过程中及完成后，肉眼可见残留细胞；而经肝动脉灌注的肝脏则表现出更均匀的脱细胞过程，残留细胞较少。

如果肝脏在施加振荡压力条件的情况下进行灌注，则未见残留细胞。无论灌注方式如何，通过肝动脉灌注的脱细胞肝脏基质的组织学评估结果确实支持宏观观察结果。

无论是否在振荡压力条件下灌注，经肝动脉灌注的肝脏中均未观察到残留细胞；然而，经门静脉灌注的肝脏则显示出残留细胞区域，即使在振荡压力条件下灌注也是如此，尽管该条件可减少这些肝脏中的残留细胞量。需要注意的是，无论脱细胞条件如何，肝脏细胞外基质均得到了保存。与天然肝脏相比，所有实验组肝脏基质的单位干重DNA含量均有所下降，但差异仅在振荡压力条件下灌注的组别中具有统计学显著性。

此外，对脱细胞肝脏基质进行的腐蚀铸型证实了灌注过程中肝脏微解剖结构的保留。观看本视频后，您应能够充分理解如何收获、插管并灌注红色肝脏，以实现可重复且均匀的脱细胞。请务必注意，使用Triton X-100和SDS可能具有极高危险性，操作时应采取佩戴手套等防护措施。